基于Ce-BDC的氧化物酶活性檢測果汁中抗壞血酸的比色方法研究

楊 陽，劉光勤，楊思龍，艾雪蓮，梁秋紅， 羅林頻，汪 蓉，王建龍，張文濤

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

抗壞血酸(AA)又被稱為維生素C(Vc)，是一類具有烯二醇結構的還原性物質。抗壞血酸在維持人體正常生理機能中扮演著重要角色[1-2]，適量的攝入抗壞血酸有利于增強機體抗應激能力和免疫力，促進鈣、鐵、葉酸等的吸收，預防癌癥與心血管疾病等。此外，抗壞血酸作為一種抗氧化劑也被廣泛用于醫療制藥、食品加工和化妝品等領域[2]。但人體自身不能合成抗壞血酸，只能從外界攝取，因此檢測食品和醫藥產品中的抗壞血酸含量是非常有必要的。目前常見的抗壞血酸檢測方法有毛細管電泳法[3]、色譜法[4]、熒光法[5]以及電化學法[6]等，這些方法雖靈敏度高、特異性強，但其昂貴的儀器設備、復雜費時的操作過程限制了進一步應用。基于納米酶的比色法因具有檢測成本低、操作簡單、無需專業人員的優點而備受關注。

天然酶大多是蛋白質和RNA，在高溫、強酸、強堿等條件下易變性失活，失去催化活性，且天然酶不易提取或提取費用高。納米酶具有合成簡單、制備成本低、可回收利用、對極端反應條件耐受性強等優點，有望作為天然酶的替代品。盡管近年來納米酶領域已取得了很大發展，但納米酶的催化能力弱于天然酶，且特異性差[7]，這些缺點限制了納米酶在各個領域的發展，因此尋求具有優異催化性能的納米材料是目前的研究熱點。金屬有機骨架(MOFs)也稱多孔配位聚合物(PCPs)，是一種新型晶態微孔材料，具有比表面積大、孔隙率高、孔道形狀及尺寸可調等優點[8-9]，已被廣泛用于納米酶的開發。迄今為止，大量的MOFs材料(如Fe-MOFs[10]、Cu-MOFs[11]、Co-MOFs[12]、Zn-MOFs[13]、Zr-MOFs[14]、Ce-MOFs[15]等)被開發作為納米酶用于生物傳感、生物醫學、環境監測等領域。這些MOFs材料的活性催化中心高度依賴于具有氧化還原活性的多價態金屬元素，因此以多金屬或多價態金屬作為活性中心是開發高性能納米酶的一個可行策略。

本文以對苯二甲酸(H2BDC)為有機配體，Ce為活性金屬中心合成了一種金屬有機框架材料Ce-BDC。Ce-BDC可模擬氧化物酶活性并催化3,3,5,5-四甲基聯苯胺(TMB)生成氧化反應產物oxTMB，溶液由無色變為藍色并在652 nm處出現很強的紫外吸收峰。抗壞血酸的加入可以還原oxTMB，從而使溶液藍色減弱且在652 nm處的紫外吸收值下降，本文基于此建立了一種檢測成本低、操作簡單、靈敏、迅速、選擇性好的檢測抗壞血酸的比色方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

傅里葉變換紅外光譜儀、XRD粉末衍射儀(德國布魯克公司)；UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津公司)；X射線光電子能譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)；高速冷凍離心機(北京儀諾科興科技發展有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)；掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；pH計(美國梅特勒-托利多儀器公司)；超聲清洗器(昆山禾創超聲儀器公司)；分析天平(中國奧豪斯儀器公司)。

對苯二甲酸(H2BDC，99%)、抗壞血酸(AA，≥99.7%)、酒石酸(TA，≥99%)、檸檬酸(CA，≥99.5%)、谷氨酸(Glu，≥98.5%)、天冬氨酸(Asp，99%)、果糖(≥99%)、淀粉(≥99%)、蔗糖(≥99%)等均購于阿拉丁試劑(上海)有限公司。乙酸(≥99%)、醋酸鈉(≥99%)、氫氧化鈉(98%)、氯化鈉(≥99.5%)、氯化鉀(≥99.5%)、氯化鈣(≥96%)、氯化鐵(≥99%)、氯化鎂(≥98%)、氯化鎳(≥98%)、氯化銅(≥99%)、氯化錳(≥99%)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮等均購于國藥集團化學試劑有限公司。硝酸鈰銨、3,3,5,5-四甲基聯苯胺(TMB)購自西格瑪奧德里奇貿易有限公司。復合果汁購自楊凌示范區當地超市。所有試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 Ce-BDC的制備采用改進的水熱法合成Ce-BDC：首先，將0.548 g硝酸鈰銨溶于2 mL水中，0.166 g有機配體對苯二甲酸溶于6 mL DMF中，然后將硝酸鈰銨溶液緩慢加入到盛有對苯二甲酸的燒杯中，加熱至100 ℃并保持攪拌15 min，自然冷卻至室溫，離心得淡黃色沉淀。沉淀再用DMF洗滌3次，并用丙酮浸泡過夜，隨后放入80 ℃真空干燥箱中干燥2 h，最后得到淡黃色Ce-BDC(產率約72.6%)。

1.2.2 Ce-BDC的氧化物酶活性研究分別進行實驗組和對照組兩組實驗。其中實驗組依次加入醋酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 3.0)，不同濃度的Ce-BDC和TMB(20 mmol/L)；對照組中只加入TMB和緩沖液。兩組均于室溫下反應10 min后，分別用紫外分光光度計在時間-掃描模式下監測其光譜。

1.2.3 Ce-BDC的穩態動力學研究反應體系為加入一定體積緩沖液(pH 3.0)、10 μL 1 mg/mL的Ce-BDC和不同濃度TMB溶液，最終反應體系的總體積為200 μL，溶液混合均勻后，用紫外分光光度計在時間-掃描監測模式下檢測溶液在652 nm處的吸光度值。動力學參數根據米氏方程V=Vmax[S]/(Km+[S]) 計算，其中V代表催化反應的初始速度；Vmax表示該反應的最大速度，[S]為底物濃度；Km表示米氏常數。

1.2.4 抗壞血酸的檢測向反應體系中依次加入醋酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH 3.0)、Ce-BDC(90 μg/mL)、TMB(1 mmol/L)以及一系列不同濃度的抗壞血酸溶液，反應體系總體積為500 μL。將反應體系置于室溫下孵育2 min，孵育結束后用紫外分光光度計掃描其在300～800 nm下的吸收光譜，取652 nm處的吸光度值與抗壞血酸濃度繪制曲線。

2 結果與討論

2.1 Ce-BDC的結構表征

通過掃描電子顯微鏡(SEM)獲得了制備的Ce-BDC尺寸大小和形貌(圖1A)，圖中可見Ce-BDC呈較為均勻的納米顆粒狀，其直徑約150～180 nm。再采用XRD表征材料的晶體結構(圖1B)，發現該材料具有明顯的晶形結構，其出現的峰可與UIO-66(Zr-BDC)的標準圖譜峰對應。進一步采用XPS分析Ce-BDC中Ce的化學價態組成(圖1C)，發現917.5、908.6、905.2、902.3 eV處的峰與Ce4+的特征峰對應，899.1、889.0、886.2、883.7 eV處的峰與Ce3+的特征峰對應[15]。由此表明，具有雙價態金屬活性中心的金屬有機框架材料Ce-BDC已成功合成。

圖1 Ce-BDC的結構表征Fig.1 Structural characterizations of the Ce-BDC A:SEM images(SEM圖像),B:XRD patterns(XRD圖譜),C:XPS spectra of the Ce 3D regions(Ce 3D區域的XPS譜圖)

2.2 Ce-BDC氧化物酶的現象研究

為研究Ce-BDC的氧化物酶催化活性，選擇TMB為顯色底物[16]。由圖2A插圖可知，Ce-BDC/TMB體系在652 nm處有一個明顯的吸收峰且溶液呈藍色，而單純的TMB和Ce-BDC溶液在652 nm處則無吸收峰和相應的藍色溶液，表明Ce-BDC催化無色的TMB生成了藍色氧化態的TMB，即Ce-BDC具有氧化物酶的催化活性。

2.3 實驗條件優化

2.3.1 反應時間的優化為了研究反應時間對反應體系的影響，監測了一系列濃度的Ce-BDC和TMB (1 mmol/L)混合溶液在652 nm處的吸光度值隨著時間的變化情況(圖2B)。結果顯示，在相同時間點下，Ce-BDC濃度越大，652 nm處的吸光度值越大，說明催化劑濃度越大反應速率越大。在0～120 s范圍內，652 nm處的吸光度隨著時間的逐漸延長而增大，120 s后吸光度基本保持不變，這可能是因為底物TMB隨著時間消耗的越來越多，并在120 s時達到平衡。因此選擇最佳反應時間為120 s。

2.3.2 溫度的優化為了研究溫度對Ce-BDC氧化物酶活性的影響，監測了Ce-BDC(90 μg/mL)和TMB (1 mmol/L)混合溶液在不同溫度下(20～80 ℃)反應2 min后在652 nm處的吸光度值(圖2C)。結果顯示，隨著反應體系溫度的升高，Ce-BDC的氧化物酶活性逐漸增強，當反應溫度超過30 ℃時，Ce-BDC的氧化物酶活性開始下降。且在30～50 ℃溫度范圍內，氧化物酶活性的下降幅度較小，在60～80 ℃溫度范圍內，氧化物酶活性的下降幅度明顯增大，因此選擇最適的反應溫度為30 ℃。

2.3.3 pH值的優化Ce-BDC的氧化物酶活性和其他基于納米材料的酶模擬物一樣，也受pH值的影響。pH值對Ce-BDC氧化物酶活性的影響可通過Ce-BDC(90 μg/mL)/TMB (1 mmol/L)體系在不同pH值緩沖液孵育2 min所測得的652 nm處的吸光度值來評估(圖2D)。結果顯示，pH值對Ce-BDC的氧化酶活性的影響較大。當pH值小于3.0時，隨著pH值的增大，Ce-BDC的氧化酶活性緩慢上升；當pH值超過3.0時，Ce-BDC的氧化酶活性隨著pH值的增大反而下降。因此選擇反應體系的pH值為3.0。如無特殊說明，此實驗均在最佳反應條件下進行。

2.4 Ce-BDC模擬酶活性的動力學研究

為進一步評估Ce-BDC的模擬氧化物酶活性，實驗對其氧化物酶的米氏動力學進行研究(圖3)。結果顯示，Ce-BDC的酶催化活性遵循穩態動力學規律，經計算得Ce-BDC對底物TMB的Km和Vmax分別為0.393 89 mmol/L和1.8 μm·s-1，Ce-BDC材料表現出較低的Km值，Km越小，表明酶對該底物的親和能力越大，有利于酶促反應進行。因此Ce-BDC對TMB具有較強親和力，在代替天然氧化酶應用于食品、生物、醫學等領域有著較大研究前景。

在已有研究中，以Ce為活性金屬中心的納米酶材料的氧化活性很有可能基于Ce3+/Ce4+兩種價態間的相互轉化[15,17]。當TMB顯色劑加入反應體系后，TMB被氧化使溶液呈藍色，Ce4+隨后自身被還原為Ce3+,生成的Ce3+又自發被氧化成Ce4+。因而推測Ce-BDC的納米酶活性可能是來自于Ce3+/Ce4+。

2.5 檢測抗壞血酸的標準曲線

基于Ce-BDC的氧化物酶活性建立了檢測抗壞血酸的比色方法(圖4)，結果顯示，反應體系在652 nm處的吸光度值(A)隨著抗壞血酸濃度(c,mol/L)的增大呈下降趨勢，且在1.0～30 μmol/L范圍內吸光度與抗壞血酸濃度呈線性關系，線性方程為A=-2.64×104c(mol/L)+0.815 4，相關系數(r2)為0.991 4。當抗壞血酸濃度為30 μmol/L時，體系呈無色(4A插圖)且在652 nm處無吸收峰。以3倍信噪比(S/N=3)計算得抗壞血酸的檢出限為0.32 μmol/L。

圖5 抗壞血酸檢測的選擇性測試Fig.5 Selective test of ascorbic acid detection

2.6 選擇性研究

考慮到果汁樣品中可能存在某些物質干擾抗壞血酸的檢測，因此選擇果汁中的常見離子(K+、Na+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+)、檸檬酸(CA)、酒石酸(TA)、糖類(果糖、蔗糖)、氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)進行抗干擾實驗。于Ce-BDC和TMB的醋酸鹽緩沖液(pH 3.0)體系中，分別添加抗壞血酸(20 μmol/L)和其他干擾物質(200 μmol/L)，混勻，在室溫下孵育2 min后再對其紫外可見光吸收光譜掃描(圖5)。結果顯示，10倍含量的上述物質基本不干擾抗壞血酸的測定，表明方法對抗壞血酸具有良好的選擇性。

2.7 實際樣品測定

取市售果汁樣品以12 000 r/min離心10 min，去除沉淀，上清液用醋酸鹽緩沖液稀釋50倍，在反應體系中加入Ce-BDC、TMB以及一系列不同濃度的抗壞血酸標準溶液(0、10、15、20 μmol/L)，于室溫下孵育2 min，采用紫外分光光度計掃描反應體系在300～800 nm下的吸收光譜，取波長為652 nm處樣品溶液的吸光度，每組實驗平行3次。結果顯示：3個添加水平下抗壞血酸的平均值分別為9.82、15.36、20.22 μmol/L，回收率為98.2%～102%，相對標準偏差(RSD)為1.2%～7.2%。該結果與抗壞血酸試劑盒(MAK074, Sigma)的檢測結果(10.01、15.13、19.91 μmol/L)能夠較好地吻合，表明方法可用于果汁中抗壞血酸含量的準確測定。

3 結 論

本文以對苯二甲酸(H2BDC)為有機配體，Ce為活性金屬中心制備了一種具有氧化物酶活性的Ce-BDC，利用Ce-BDC可以催化顯色底物TMB生成氧化反應產物oxTMB，然后抗壞血酸可將oxTMB還原，反應過程中oxTMB的消耗導致溶液在652 nm處吸光度的下降，從而建立了抗壞血酸的比色檢測方法。該比色方法具有檢測成本低、操作簡單、靈敏、迅速、選擇性好等優點，為抗壞血酸的檢測提供了新方法。