Klotho、TXNIP在老年糖尿病心肌病中的表達(dá)及其臨床意義

伊芬秀

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是DM病人后期的慢性并發(fā)癥之一，其以心臟舒張功能異常為特征，后期收縮功能逐漸下降[1]。但DCM早期通常心臟無(wú)明顯器質(zhì)性與功能性病變，導(dǎo)致其缺乏明確的病理特異診斷方法，使得DCM早期防治較為困難[2]。因此，臨床中急需尋找與DCM相關(guān)的評(píng)估指標(biāo)。Klotho作為一種抗衰老基因，在慢性炎癥和抗氧化應(yīng)激中有重要作用[3]。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)是一種內(nèi)源性硫氧還蛋白結(jié)合抑制蛋白，研究表明，其在DM病人體內(nèi)呈異常高表達(dá)[4]。Klotho、TXNIP均與DM有密切聯(lián)系，但目前關(guān)于二者在DCM病人中的研究較少，因此，本研究通過(guò)檢測(cè)DCM病人Klotho mRNA、TXNIP表達(dá)水平，探討其與DM病人并發(fā)心肌病的相關(guān)性，以期為控制DM病情進(jìn)展、降低心肌病發(fā)生率提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年5月至2020年3月期間于本院就診的67例老年DCM病人為研究對(duì)象(DCM組)，年齡62～86歲，平均(74.33±11.40)歲，男32例，女35例；選取同期住院及門(mén)診治療的老年DM無(wú)心肌病病人72例作為DM組，年齡61～85歲，平均(73.47±11.06)歲，男37例，女35例；選取同期老年健康體檢者84例作為對(duì)照組，年齡61～84歲，平均(72.71±10.86)歲，男42例，女42例。3組間年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)(American diabetes association，ADA)和WHO最新的DM診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，同時(shí)根據(jù)臨床診斷確診DCM病人，其中診斷要點(diǎn)：臨床有勞累性心悸、呼吸困難、胸悶；心電圖大致正常，心電圖證實(shí)左心室順應(yīng)性下降，舒張功能減退，A峰上升、E峰下降，E/A比值<1.0；(2)病歷資料齊全且自愿參加本研究者；(3)冠脈造影顯示無(wú)冠狀動(dòng)脈病變或無(wú)心肌內(nèi)廣泛微血管病變者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝腎功能異常、甲狀腺功能亢進(jìn)者；(2)高血壓、原發(fā)性心肌病、先天性心臟病者；(3)合并腫瘤等惡性疾病者。本研究經(jīng)本院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)；miScript SYBR?Green qPCR試劑盒(德國(guó)凱杰公司)；TXNIP ELISA試劑盒、BNP ELISA試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)；cTnI ELISA試劑盒(武漢維克賽思科技有限公司)；TIMP-1 ELISA試劑盒、MMP-2 ELISA試劑盒、ANP ELISA試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)。酶標(biāo)儀(杭州奧盛儀器有限公司)；qRT-PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存：采集受試對(duì)象入院時(shí)晨起空腹靜脈血樣，3000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80℃保存待測(cè)。

1.3.2 一般資料收集：收集整理病人一般資料，主要包括性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、高血壓，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)餐后2 h血糖(2hPG)、HbA1c、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平。

1.3.3 TXNIP及血清學(xué)指標(biāo)水平檢測(cè)：采用ELISA法檢測(cè)受試者血清TXNIP、BNP、肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ，cTnI)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metralloproteinase-1，TIMP-1)、心鈉素(atrial natriuretic peptide，ANP)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metralloproteinase-2，MMP-2)水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4 血清Klotho mRNA水平測(cè)定：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)血清中Klotho mRNA表達(dá)水平。Klotho正向引物為5′-ACCTGGTGGCGCACAC-3′，反向引物為：5′-TTGGCAAACCAACCTAGTACA-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物為：5′-GACCTGGTGGCGCACAC-3′，反向引物為：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。qRT-PCR反應(yīng)體系共20μL：cDNA(50 ng/μL)2μL，miScript SYBR? Green Mix 10μL，上下游引物(10μmol/L)各0.8μL，雙蒸水6.4μL，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，連續(xù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每份樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，采用2-△△CTDelta法計(jì)算血清Klotho mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較 3組飲酒、吸煙、高血壓病人比例比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DCM組2hPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C水平高于DM組和對(duì)照組，HDL-C水平低于DM組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DM組2hPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C水平高于對(duì)照組，HDL-C水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 3組血清Klotho mRNA、TXNIP水平比較 DCM組血清TXNIP水平高于DM組和對(duì)照組，Klotho mRNA水平低于DM組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DM組血清TXNIP水平高于對(duì)照組，Klotho mRNA水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組血清Klotho mRNA、TXNIP水平比較

2.3 3組血清學(xué)指標(biāo)水平比較 DCM組BNP、cTnI、TIMP-1、ANP水平高于DM組和對(duì)照組，MMP-2水平低于DM組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DM組BNP、cTnI、TIMP-1、ANP水平高于對(duì)照組，MMP-2水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 DCM病人血清Klotho mRNA、TXNIP與血清學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，DCM病人血清Klotho mRNA與TXNIP呈負(fù)相關(guān)(r=-0.646，P<0.05)，且Klotho mRNA與MMP-2呈正相關(guān)(P<0.05)，與BNP、cTnI、TIMP-1、ANP呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；TXNIP與MMP-2呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與BNP、cTnI、TIMP-1、ANP呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

2.5 影響DM病人發(fā)生心肌病的Logistic回歸分析 將DM病人是否發(fā)生心肌病作為因變量，校正年齡、性別、飲酒、吸煙、高血壓、2hPG、HbA1c、TC、TG、HDL-C、LDL-C等因素后，以Klotho mRNA、TXNIP、BNP、cTnI、TIMP-1、ANP、MMP-2水平為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示TXNIP、ANP是影響DM病人發(fā)生心肌病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，Klotho mRNA是影響DM病人發(fā)生心肌病的保護(hù)因素(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 影響DM病人發(fā)生心肌病的多因素Logistic回歸分析

3 討論

DM是一類(lèi)以胰島素抵抗或慢性胰島素缺乏為特征的代謝性疾病，DM的并發(fā)癥是導(dǎo)致病人致殘的主要原因，也是嚴(yán)重危害DM病人生命健康的主要因素[6]。DCM是DM后期出現(xiàn)的一種心室舒張功能異常的慢性并發(fā)癥[7]。目前DCM可通過(guò)病理活檢、超聲心動(dòng)圖、心臟磁共振等方法確診，但其缺乏更為簡(jiǎn)單、有效的血清學(xué)生化指標(biāo)作為早期診斷參考依據(jù)。

Klotho家族包括α-Klotho和β-Klotho 2種，可調(diào)控衰老過(guò)程及與衰老相關(guān)的疾病，參與組織、肝、腎等器官的代謝過(guò)程，與糖尿病腎病有重要聯(lián)系。Klotho可與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，抑制特異性轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O1的磷酸化，從而發(fā)揮對(duì)過(guò)氧化物的清除作用[8]。研究表明，Klotho可通過(guò)影響一氧化氮(NO)的生成量，發(fā)揮對(duì)血管疾病的調(diào)節(jié)作用[9]。本研究結(jié)果顯示，DCM病人血清Klotho mRNA水平低于DM病人和健康人群，DM病人血清Klotho mRNA水平低于健康人群，與劉洪等[10]研究結(jié)果中Klotho表達(dá)趨勢(shì)一致。多因素分析顯示Klotho mRNA是影響DM病人發(fā)生心肌病的保護(hù)因素。提示Klotho的低表達(dá)可能與DCM的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且可能是由于DCM病人處于病理狀態(tài)下，其內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生一定的損傷，體內(nèi)NO生成量下降，影響循環(huán)血及血管壁中的一些活性因子表達(dá)，進(jìn)而影響Klotho的表達(dá)量。

TXNIP可影響胰島B細(xì)胞分泌胰島素的能力，調(diào)節(jié)肝臟和脂肪組織對(duì)胰島素的抵抗[11]。此外，TXNIP在微血管病變中發(fā)揮重要作用，且是通過(guò)影響血管炎癥對(duì)血管內(nèi)皮發(fā)揮作用[12]。本研究結(jié)果顯示，DCM病人血清TXNIP水平高于DM病人和健康人群，DM病人血清TXNIP水平高于健康人群，與劉敏潔等[13]研究結(jié)果相似；且TXNIP是影響DM病人發(fā)生心肌病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。推測(cè)可能病人在病理狀態(tài)下血管中氧化應(yīng)激、高糖、紊亂血流以及其他因素帶來(lái)的血管炎癥增加，同時(shí)血管內(nèi)皮損傷增加，進(jìn)而影響TXNIP的表達(dá)量。此外，本研究結(jié)果中，DCM病人血清Klotho mRNA與TXNIP水平呈負(fù)相關(guān)，且二者與血清學(xué)指標(biāo)MMP-2、BNP、cTnI、TIMP-1、ANP均呈一定的相關(guān)性，而ANP、cTnI等血清學(xué)指標(biāo)均是心肌病相關(guān)指標(biāo)[14-15]。進(jìn)一步提示，Klotho、TXNIP在DM病人體內(nèi)可能發(fā)揮協(xié)同作用，與DCM的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，臨床中除了要密切監(jiān)測(cè)Klotho、TXNIP水平變化外，還可對(duì)ANP等心肌病相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，以便臨床中及時(shí)采取針對(duì)性治療措施，降低心肌病的發(fā)病率。

綜上所述，Klotho、TXNIP的低、高表達(dá)可能與DCM的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，臨床中可考慮將二者作為DCM的血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行深入研究。控制TXNIP、ANP、Klotho mRNA水平穩(wěn)定，可能有利于改善DM并發(fā)心肌病病人的預(yù)后。但Klotho、TXNIP共同影響DCM的具體分子機(jī)制目前尚不明確，有待進(jìn)一步研究和探索。