土壤因子對(duì)朝鮮淫羊藿有效成分的影響1)

劉振成 張碩 代艾林 韓梅 楊利民 張永剛

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，130118)

朝鮮淫羊藿(Epimediumkoreanum)為小檗科(Berberidaceae)多年生草本植物，多生于疏林下、灌叢間或林緣半陰環(huán)境[1]，分布于吉林省南部、遼寧省東部、朝鮮北部[2-3]。朝鮮淫羊藿作為傳統(tǒng)藥材淫羊藿的重要基原，以干燥葉入藥，具有補(bǔ)腎陽(yáng)，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕等功能[4-6]。目前，朝鮮淫羊藿人工栽培尚未形成規(guī)模，其藥材商品長(zhǎng)期依賴于野生資源，因需求不斷增加造成野生資源急劇減少，各地的藥材質(zhì)量參差不齊[7]。

土壤是植物賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，是植物吸收養(yǎng)分和水分的場(chǎng)所，土壤理化性質(zhì)和無機(jī)元素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和藥效成分具有重要的影響[8-12]。相關(guān)研究表明，影響藥用植物有效成分含量的土壤主導(dǎo)因子不盡相同[13-16]。目前，關(guān)于朝鮮淫羊藿研究主要集中于化學(xué)成分、藥理、質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面[17-18]，尚有部分學(xué)者開展生態(tài)環(huán)境對(duì)朝鮮淫羊藿化學(xué)成分及生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律研究[19-20]，而關(guān)于朝鮮淫羊藿有效成分與土壤因子相關(guān)性的研究尚未見報(bào)道。本研究對(duì)不同產(chǎn)地朝鮮淫羊藿有效成分質(zhì)量濃度與其生長(zhǎng)的土壤因子進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，探尋影響朝鮮淫羊藿藥材質(zhì)量的土壤主導(dǎo)因子，為朝鮮淫羊藿適宜種植區(qū)的選擇，開展規(guī)范化種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2019年8月中旬在吉林省不同地區(qū)(通化、集安、白山、撫松、臨江、敦化)采集野生朝鮮淫羊藿樣品26個(gè)(見表1)，并記錄樣地海拔及經(jīng)緯度，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)張永剛副教授鑒定為朝鮮淫羊藿樣品植株，土壤樣品為所取植株根際土壤，與取植株樣品時(shí)一并取回，置于室內(nèi)自然風(fēng)干，粉碎過篩。

1.2 朝鮮淫羊藿化學(xué)成分的測(cè)定

采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定朝鮮淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷有效成分質(zhì)量濃度。精密稱定樣品粉末0.5 g(0.425 mm孔徑)置于50 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，20 ℃超聲提取1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇補(bǔ)足損失質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液作供試品溶液用于質(zhì)量濃度測(cè)定；總黃酮質(zhì)量濃度參照2015年版《中國(guó)藥典》淫羊藿項(xiàng)下總黃酮質(zhì)量濃度測(cè)定方法[1]進(jìn)行測(cè)定。精密量取總黃酮醇苷項(xiàng)下的供試品溶液0.5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。分別取供試品溶液和對(duì)照品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，用紫外-可見分光光度法，在270 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算，即得。

表1 朝鮮淫羊藿采集點(diǎn)信息

色譜條件：Agilent Zorbox C18色譜柱(250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)，柱溫30 ℃，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相A為乙腈、C為水，梯度洗脫(0～25 min，體積分?jǐn)?shù)24%A、體積分?jǐn)?shù)76%B；25～30 min，體積分?jǐn)?shù)24%～30%A、體積分?jǐn)?shù)76%～70%B)。

1.3 土壤元素測(cè)定

土壤pH采用pH計(jì)測(cè)定(梅特勒-托利多儀器上海有限公司SevenMulti型離子綜合測(cè)試儀)；土壤堿解氮(N)采用堿解擴(kuò)散法進(jìn)行測(cè)定；土壤速效磷(P)采用紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)測(cè)定；土壤中速效鉀(K)、有效鈣(Ca)、有效鎂(Mg)、有效鐵(Fe)、有效銅(Cu)、有效鋅(Zn)、有效錳(Mn)元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用火焰原子吸收儀(島津AA-6300型原子吸收儀)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，DPS進(jìn)行通徑分析及多元回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 朝鮮淫羊藿化學(xué)成分描述性統(tǒng)計(jì)

由表2可見，朝藿定A、B、C、淫羊藿苷變異系數(shù)為56.3%～89.8%，屬于高度變異，總黃酮變異系數(shù)為31.7%，屬于中等變異，說明不同產(chǎn)地間朝鮮淫羊藿化學(xué)成分質(zhì)量濃度差異較大，品質(zhì)相對(duì)不穩(wěn)定。2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定淫羊藿苷、總黃酮為朝鮮淫羊藿化學(xué)成分主要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，含量分別不低于0.5%、5.0%符合用藥標(biāo)準(zhǔn)。朝鮮淫羊藿主要化學(xué)成分淫羊藿苷質(zhì)量濃度較高的地區(qū)為通化、集安地區(qū)，較低的地區(qū)為敦化、撫松等地，且未達(dá)到藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，總黃酮質(zhì)量濃度較高區(qū)域?yàn)橥ɑ貐^(qū)，較低區(qū)域?yàn)閾崴傻貐^(qū)，說明通化地區(qū)更適合朝鮮淫羊藿化學(xué)成分合成，藥材質(zhì)量較好。

表2 朝鮮淫羊藿主要化學(xué)成分描述性統(tǒng)計(jì)

2.2 朝鮮淫羊藿土壤因子描述性統(tǒng)計(jì)

由表3可知，pH平均值為6.26±0.62，變異系數(shù)為9.9%，屬于小范圍變異，說明朝鮮淫羊藿適宜在弱酸性土壤中生長(zhǎng)；有機(jī)質(zhì)變幅為2.1%～6.2%，平均值為(4.048±0.929)%，變異系數(shù)為23.0%；土壤無機(jī)元素，鐵、銅、鋅、錳、鈣、鎂變異系數(shù)均為高度變異，不同樣地間土壤無機(jī)元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)各不相同，其中銅變異系數(shù)最大，分布極不均衡；速效磷變幅為21.74～563.30 mg·kg-1，平均值為(130.38±95.80)mg·kg-1，變異系數(shù)為73.5%，速效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高但不均衡；堿解氮變異系數(shù)為26.0%，含量豐富，較為均衡；速效鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)中等，但不均衡；海拔變幅為360～670 m，均值為(482.00±72.14)m，變異系數(shù)為15.0%，變異系數(shù)較小，說明朝鮮淫羊藿生長(zhǎng)的海拔較為穩(wěn)定，朝鮮淫羊藿適宜生長(zhǎng)在低海拔地區(qū)。

表3 朝鮮淫羊藿土壤因子描述性統(tǒng)計(jì)

2.3 土壤因子與化學(xué)成分相關(guān)性

由表4可知，朝藿定A與有效鎂呈極顯著正相關(guān)，朝藿定B與pH、有效鈣呈負(fù)相關(guān)，與有效鎂呈極顯著正相關(guān)，朝藿定C與有效鈣呈負(fù)相關(guān)，與有效鎂呈極顯著正相關(guān)，淫羊藿苷與有效鈣呈負(fù)相關(guān)，與有效鎂呈極顯著正相關(guān)，總黃酮與有效鋅呈負(fù)相關(guān)。表明有效鎂有利于朝藿定A、B、C、淫羊藿苷的合成，高pH不利于朝藿定B的質(zhì)量濃度積累，有效鈣過高抑制朝藿定B、C、淫羊藿苷的化學(xué)成分形成，有效鋅過高不利于總黃酮質(zhì)量濃度積累。

表4 土壤因子與淫羊藿化學(xué)成分相關(guān)性

2.4 土壤因子與朝鮮淫羊藿化學(xué)成分灰色關(guān)聯(lián)度

分別以朝藿定A、B、C、淫羊藿苷、總黃酮作為母因素，以土壤因子為子因素對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析。結(jié)果如表5所示，各化學(xué)成分與土壤因子關(guān)聯(lián)系數(shù)較高，說明它們之間關(guān)系密切，影響朝藿定A的主要土壤因子是有效銅、有效鈣、速效鉀，影響朝藿定B的主要土壤因子是速效磷、有效銅、速效鉀，影響朝藿定C的主要土壤因子是有效銅、有效鈣、有效鋅；影響淫羊藿苷的主要土壤因子是速效磷、有效銅、有效鈣；影響總黃酮的主要土壤因子是速效磷、有效鈣、有效銅。

表5 土壤因子與朝鮮淫羊藿化學(xué)成分灰色關(guān)聯(lián)度

2.5 土壤因子對(duì)朝鮮淫羊藿化學(xué)成分通徑分析

由表6可知，土壤因子對(duì)朝藿定A的直接通徑系數(shù)的絕對(duì)值較大的為：有效鈣(0.689)、有機(jī)質(zhì)(0.350)、海拔(-0.303)，說明有效鈣、有機(jī)質(zhì)、海拔對(duì)朝藿定A的直接效應(yīng)最大，其中有效鈣、有機(jī)質(zhì)為正效應(yīng)，海拔為負(fù)效應(yīng)，有效鈣、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的地區(qū)有利于朝藿定A質(zhì)量濃度的積累，高海拔不利于朝藿定A質(zhì)量濃度的積累，這也符合朝鮮淫羊藿適宜生長(zhǎng)在低海拔地區(qū)的特性。土壤因子對(duì)朝藿定B的直接通徑系數(shù)絕對(duì)值較大的為有效鈣(0.699)、有效鎂(-0.475)、有效銅(-0.335)；土壤因子對(duì)朝藿定C的直接通徑系數(shù)絕對(duì)值較大的為有效鈣(0.813)、有效鎂(-0.507)、有效銅(-0.274)；土壤因子對(duì)淫羊藿苷的直接通徑系數(shù)絕對(duì)值較大的為有效鈣(0.725)、有效鎂(-0.382)、有效銅(-0.231)。有效鈣、有效鎂、有效銅是對(duì)朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷直接通徑系數(shù)絕對(duì)值較大且直接效應(yīng)較大的3個(gè)土壤因子，其中有效鈣為正效應(yīng)，有效鎂、有效銅為負(fù)效應(yīng)，說明有效鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高地點(diǎn)有利于朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷質(zhì)量濃度的形成，土壤中有效鎂、有效銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高會(huì)抑制朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷質(zhì)量濃度的積累。由表6可知，土壤因子對(duì)總黃酮的直接通徑系數(shù)的絕對(duì)值較大的為：有效鎂(-0.795)、有機(jī)質(zhì)(0.699)、有效鈣(0.497)速效磷(-0.491)，有效鎂、有效鈣、有機(jī)質(zhì)、速效磷對(duì)總黃酮直接效應(yīng)最大，其中有效鈣、有機(jī)質(zhì)為正效應(yīng)，有效鎂、速效磷為負(fù)效應(yīng)，表明土壤中有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)豐富、有效鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的地區(qū)，有利于總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的積累，過高的有效鎂、速效磷會(huì)抑制總黃酮的積累。

表6 土壤因子對(duì)朝鮮淫羊藿化學(xué)成分通徑分析

2.6 淫羊藿化學(xué)成分與土壤因子多元回歸分析

在相關(guān)性分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、通徑分析基礎(chǔ)上，通過多元逐步回歸分析剔除對(duì)因變量不起作用的因子。以朝鮮淫羊藿5種化學(xué)成分為因變量，12個(gè)土壤因子為自變量，建立回歸方程，挑選主要影響因子。方程如表7所示，當(dāng)有效鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)(x4)增加一個(gè)單位時(shí)，朝藿定A質(zhì)量濃度增加0.046 96%；當(dāng)有效鈣(x4)和有效鎂(x5)處于平均水平，而其中一個(gè)變量固定時(shí)，剩余變量如有效鈣(mg·kg-1)和有效鎂(mg·kg-1)每增加一個(gè)單位，朝藿定B質(zhì)量濃度分別增加0.000 07%和減少0.000 06%，朝藿定C質(zhì)量濃度分別增加0.000 06%和減少0.000 04%，淫羊藿苷質(zhì)量濃度分別增加0.000 37%和減少0.000 3%；當(dāng)有機(jī)質(zhì)(x3)、有效鈣(x4)、有效鎂(x5)、速效氮(x11)處于平均水平，而其中一個(gè)變量固定時(shí)，剩余變量如有機(jī)質(zhì)(mg·kg-1)、有效鈣(mg·kg-1)、有效鎂(mg·kg-1)、速效氮(mg·kg-1)每增加一個(gè)單位，總黃酮質(zhì)量濃度分別增加2.090%、0.002%和減少0.004%、0.010%。

表7 朝鮮淫羊藿化學(xué)成分與土壤因子多元逐步回歸分析

為了更加明確土壤因子對(duì)朝鮮淫羊藿化學(xué)成分質(zhì)量濃度的影響，對(duì)土壤因子與朝鮮淫羊藿化學(xué)成分重新做通徑分析。由表8可知，影響朝藿定A質(zhì)量濃度的決定因子是有效鈣；有效鈣、有效鎂是影響朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的決定因子，有機(jī)質(zhì)、有效鈣、有效鎂、堿解氮是影響總黃酮的決定因子。

表8 淫羊藿化學(xué)成分與土壤決定因子的通徑分析

3 討論

生態(tài)因子是影響藥材質(zhì)量的重要因素，不同生態(tài)因子對(duì)藥材結(jié)構(gòu)、性狀、藥效成分等產(chǎn)生不同程度的影響，即環(huán)境飾變導(dǎo)致同種異地藥材質(zhì)量的不同[21]。生態(tài)因子中土壤因子是直接影響中藥材生長(zhǎng)發(fā)育以及產(chǎn)量品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵性因子，是中藥材生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中的限制因子[22]。不同地區(qū)土壤因子存在差別，致使生長(zhǎng)在不同地區(qū)的同種藥材化學(xué)成分存在顯著差異，本研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地野生朝鮮淫羊藿化學(xué)成分含量差異較大，同一地區(qū)不同樣地野生朝鮮淫羊藿化學(xué)成分也存在較大差異，總體上通化地區(qū)化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)要高于其他地區(qū)。土壤是一個(gè)很好的“儲(chǔ)藏室”，儲(chǔ)存水分、空氣、礦質(zhì)元素，這些都是植物生長(zhǎng)發(fā)育及化學(xué)成分合成所必需的要素，土壤對(duì)藥材品質(zhì)具有重要影響。楊月等[23]研究發(fā)現(xiàn)，K、Mg對(duì)三七藥材品質(zhì)有著重要影響；徐琳娜等[24]在對(duì)茂蘭地區(qū)鐵皮石斛適應(yīng)性研究中發(fā)現(xiàn)，野生的鐵皮石斛在Ca元素較高的石灰石上生長(zhǎng)得最好；Ca、Mg元素是植物體內(nèi)某些酶的活化劑，對(duì)植物的呼吸作用以及其他礦質(zhì)元素的吸收都會(huì)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)和代謝[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同土壤因子變異系數(shù)也呈現(xiàn)高度變異，但海拔、pH均屬于小變異，說明朝鮮淫羊藿適宜生長(zhǎng)在低海拔、弱酸性土壤中。本研究通過簡(jiǎn)單相關(guān)性、灰色關(guān)聯(lián)度分析、通徑分析、多元回歸分析多方法共同闡釋土壤因子對(duì)化學(xué)成分的影響，最終結(jié)果指出有效鈣與朝藿定A呈顯著正相關(guān)關(guān)系，在回歸方程中也僅有效鈣與朝藿定A呈顯著回歸。有效鈣(正相關(guān))、有效鎂(負(fù)相關(guān))、有效銅(負(fù)相關(guān))是影響朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的主要影響因子，但僅有有效鈣、有效鎂與朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷質(zhì)量濃度形成回歸方程，增加土壤中有效鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)、減少有效鎂質(zhì)量分?jǐn)?shù)有利于增加朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的質(zhì)量濃度。相關(guān)性分析中朝藿定B、C、淫羊藿苷與有機(jī)質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，但在回歸方程中并沒有顯著回歸，可能因子間存在多重共線性。有效鎂(負(fù)相關(guān))、有效鈣(正相關(guān))、有機(jī)質(zhì)(正相關(guān))、堿解氮(負(fù)相關(guān))是影響總黃酮主要因素，且形成二元回歸方程，說明土壤肥沃，有效鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的地區(qū)，減少有效鎂、堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)有利于總黃酮質(zhì)量濃度增加。

朝鮮淫羊藿有效成分的質(zhì)量濃度除了受土壤因子的影響外，還與自身遺傳和產(chǎn)地的光照、降水量、溫度等氣象因子及地形因子密切相關(guān)。綜合考慮包含氣象因子、地形因子及土壤因子對(duì)朝鮮淫羊藿的產(chǎn)量及有效成分含量的影響，才能更好地為確定朝鮮淫羊藿的適宜產(chǎn)地及開展人工種植提供理論依據(jù)，這將是進(jìn)一步研究的方向。

4 結(jié)論

朝鮮淫羊藿化學(xué)成分與土壤因子變異系數(shù)均較大。通過相關(guān)性分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、通徑分析、多元回歸分析，層層深入，多方法緊密結(jié)合，明確影響化學(xué)成分主要土壤因子：朝藿定A為有效鈣；朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷為有效鈣、有效鎂；總黃酮為有機(jī)質(zhì)、有效鈣、有效鎂、堿解氮。綜上所述，影響朝鮮淫羊藿化學(xué)成分主要生態(tài)因子是有效鈣、有效鎂、有機(jī)質(zhì)、堿解氮。在低海拔、弱酸性土壤中，增加有效鈣、減少有效鎂有利于增加朝鮮淫羊藿化學(xué)成分質(zhì)量濃度，但在土壤肥力較高地區(qū)，減少堿解氮更有利于增加總黃酮質(zhì)量濃度。