基于網絡藥理學研究血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的作用機制

李和教，黃毅嵐，黃易

1.海南醫學院第一附屬醫院藥學部，海南 海口 570102；2.西南醫科大學附屬醫院藥學部，四川 瀘州 646000

血管性認知障礙(vascular cognitive impairment，VCI)是由腦血管病變或由血管性因素導致與之有關的認知損害，亦是一種中樞神經系統(central nervous system，CNS)退行性疾病[1]，主要以學習、記憶及社交等能力降低為主要的疾病特點認知功能障礙[2]，多發于中老年。隨著社會的老齡化，血管性認知障礙對人們的健康及生活質量的影響越來越明顯及其發病率較高，甚至進展成癡呆，這不僅給患者的健康及生活質量帶來嚴重的影響，還給社會及其家庭帶來嚴峻的考驗[3]。目前在臨床及基礎研究針對血管性認知功能障礙的發病機制亦尚未明確，且在臨床治療上沒有療效確切的藥物和治療方案[4]；在中醫上采用辨證論治方法，以滋益固腎、活血化瘀、化痰開竅的治療原則治療及改善患者的血管性認知功能障礙的癥狀方面取得良好的臨床效果。

血府逐瘀湯是治療“胸中血府淤血”的常用理血藥方之一，具有活血化瘀、行氣通絡之效，對血管性癡呆具有明顯改善作用[5]。有研究顯示通過多成分、多層面、多靶點及多通路研究及分析該方所包含的活血化瘀中藥，發現血府逐瘀湯及其活性成分具有減輕氧化應激和炎癥反應，改善機體微循環障礙等作用，在一定程度可改善或延緩認知功能障礙的惡化[6-9]。

網絡藥理學主要利用生物信息學和分子生物學等研究方法，通過“成分-潛在靶點-分子通路”網絡的構建，從整體上對中藥物質基礎和藥理作用進行系統和多層次的解析[10-12]。本研究運用網絡藥理學方法，篩選血府逐瘀湯的活性成分靶點，構建“活性成分-潛在靶點”和“成分-潛在靶點-通路”網絡，尋找潛在通路，探討血府逐瘀湯通過多成分、多靶點、多通路發揮治病作用的機制，為其臨床應用提供證據，更為血管性認知功能障礙的臨床干預治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 血府逐瘀湯活性成分的篩選 通過檢索TCMSP 數據庫檢索血府逐瘀湯的活性成分，根據OB%≥30%和DL≥0.18 條件[13]篩選血府逐瘀湯的活性成分，并且通過PuChem 數據查詢活性成分對應的結構式(SMILES)將所得信息錄入Excel 表格，且下載2D和3D結構。

1.2 血府逐瘀湯活性成分靶點反向預測 通過將SMILES 依次輸入SWISS 數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)[14]中的SWISS，以“人類”為研究物種預測活性成分的靶點，整合去重得到血府逐瘀湯的作用靶點。

1.3 血管性認知功能障礙的靶點獲取 利用“vascular cognitive impairment”作為關鍵詞，對Gene-Card等數據庫進行疾病靶點的檢索及篩選。整合去除重復靶點，即可獲得血管性認知功能障礙的相關靶點。

1.4 構建活性成分-潛在靶點網絡圖 利用韋恩圖(Venn diagram)得到成分靶點與疾病靶點的交集，即潛在靶點，使用Cytoscape 3.6.0軟件構建活性成分-潛在靶點網絡。網絡圖中的節點(node)分別為活性成分和潛在靶點；邊(edge)表示三者的相互關系。使用Cytoscape 中Network Analysis 插件對相應網絡進行拓撲性質分析，根據節點連接度(degree)和介數中心性(betweenness centrality)設置網絡樣式，節點大小反映degree大小，邊的粗細反映betweenness centrality大小。

1.5 蛋白質相互關系網絡構建和關鍵靶點篩選 將血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的潛在靶點導入String數據庫，得到潛在作用靶點的PPI網絡，結果以TSV格式導出結果，將結果中的node1、node2、combined score信息以TXT格式導入Cytoscape軟件中進行可視化和Network Analyzer分析，以節點degree 值反映靶點大小和顏色，從而構建蛋白互作網絡。以節點度值(degree)和介數中心度(betweenness centrality)大于等于所有點中位數值2倍的靶點，并滿足接近中心度(closeness centrality)大于所有點中位數值條件篩選關鍵靶點作為血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的“關鍵靶點”，研究關鍵靶標可能存在的藥理作用。

1.6 GO 與KEGG 通路富集分析 通過DAVID 數據庫對血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的關鍵靶點進行GeneOntology 分析(生物過程、分子功能和細胞成分三個層面)和Pathways分析，保存并整理結果，篩選排名靠前的生物過程或信號通路，通過Omicshare進行可視化。

1.7 構建活性成分-潛在靶點-通路網絡圖 根據KEGG 分析結果篩選出關鍵基因富集基因數相對大的通路，通過Cytoscape 軟件構建活性成分-潛在靶點-通路網絡圖。

2 結果

2.1 血府逐瘀湯的活性成分篩選結果 通過TCMSP 數據庫以及文獻分別檢索血府逐瘀湯的活性成分及相應靶點等信息，滿足OB＞30%和DL＞0.18 條件的成分作為主要活性成分，共得到活性成分212個，其中桃仁23 個、紅花22 個、當歸2 個、川芎7 個、赤芍29 個、牛膝20 個、柴胡17 個、桔梗7 個、甘草23 個、枳殼5 個、地黃57 個，去重及去除無結構式的活性成分后有105個活性成分，部分主要活性成分見表1。

表1 血府逐瘀湯的主要活性成分信息

2.2 構建血府逐瘀湯活性成分-血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的潛在靶點藥理網絡 活性成分-潛在靶點藥理網絡共包括147個節點和519個邊，該網絡包含了88個化合物節點和59個潛在靶點節點(圖1)。紅色(node)：潛在靶點；深藍色(node)：活性成分；這些潛在的活性成分與靶點產生519個相互作用關系。通過Network Analyzer對網絡圖進行分析，結果顯示：與潛在靶點相互作用的活性成分中，甘草查爾酮B、刺槐黃素、刺果甘草查耳酮、橙皮素、柚皮素、槲皮素、山奈酚、甘草寧G、漢黃芩素等大于活性成分的中位數度值，即與6個以上靶點連接，是血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的主要成分；在這個網絡中，藥物活性成分可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，一種成分對應多個靶點，一個靶點也對應多種成分，這體現了其多成分、多靶點的作用特點。

圖1 血府逐瘀湯的“成分-靶點”網絡圖

2.3 蛋白相互作用網絡的構建 使用STRING網站對得到的血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的潛在靶點進行分析，為獲得更加簡潔PPI網絡，首先刪除了自相作用關系蛋白邊，再刪除沒有相互作用蛋白的節點，在使用Cytoscape軟件構建潛在蛋白質-潛在蛋白質相互作用(PPI)網絡(圖2)。PPI網絡中有59個節點和588 個邊緣。PPI 網絡圖中節點的大小與其在網絡中的度值呈正相關。節點的度值越大，它在網絡中作用越重要，相應的蛋白質靶點在疾病過程中有著更重要的作用。而在PPI圖中，用紅色飛鏢形代表關鍵蛋白、黃色飛鏢形代表其他主要蛋白、藍色圓形代表其他相關蛋白，在PPI 網絡中APP(Degree34)、MAPK 1(Degree34)、TNF (Degree61)、FGF2 (Degree37)、EGFR(Degree38)、VEGFA(Degree39)、IL6 (Degree40)、AKT1(Degree44)蛋白質節點的程度較高，大于節點中位數對應的度的2 倍以上，這些靶點蛋白可能在血管性認知功能障礙的發展中起關鍵作用，見表2。

表2 血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的關鍵靶點

2.4 生物通路富集分析 使用DAVID網站對血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的關鍵靶點進行GO富集分析，得到了P＜0.05的GO條目共計40個，其中包含生物過程(biological process，BP)條目共26 個，最顯著的為ERK1 和ERK2 級聯正調控、MAP 激酶活性的正調節、MAPK 級聯、蛋白激酶B 信號的正調控等；細胞組成(cell composition，CC)分析結果一共有9條，最顯著的為細胞表面、質膜、細胞外間隙、胞外區、細胞核等；分子功能(molecular function，MF) 分析結果共有5條，最顯著的為酶結合、ATP結合、肝素結合、細胞因子活性、ATP 結合等，各類分別取前20 條。通過對血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的關鍵靶點進行KEGG 通路分析得到了P＜0.05 的通路共44條，包括PI3K-Akt(磷酸肌醇-3羥激酶/蛋白激酶B)通路、HIF-1(缺氧誘導因子1)信號通路、MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)信號通路、TNF(腫瘤壞死因子)信號通路、FoxO 信號通路、Ras 信號通路、Toll 樣受體信號通路等，見圖3。此20 條作用通路均與血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙相關的4 個以上靶基因富集重疊，揭示血府逐瘀湯的有效成分可能通過作用于以上多條信號通路來治療血管性認知功能障礙。相關通路信息及富集基因見表3。

圖2 血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的潛在靶點的蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡

圖3 GO和KEGG富集分析

表3 血府逐瘀治療血管性認知功能障礙的關鍵通路

圖4 血府逐瘀湯的“活性成分-潛在靶點-通路”的網絡圖

2.5 構建血府逐瘀湯活性成分-潛在靶點-通路網絡 為研究血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的主要作用通路，本研究將血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙作用的8 個關鍵靶點蛋白置入DAVID 數據庫中進行通路富集分析，將結果中含有特殊疾病信號通路刪除，并將結果在Cytoscape軟件中構建血府逐瘀湯活性化合物-疾病靶點-通路網絡，見圖4。共有163個節點和582 個邊，有88 個血府逐瘀湯中的化合物，59個主要的血管性認知功能障礙潛在靶點和16 個通路。其中PI3K-Akt 信號通路含有6 個蛋白被富集，HIF-1 信號通路有5 個蛋白被富集，Ras 信號通路有5個蛋白被富集，MAPK 信號通路有5 個蛋白被富集，FoxO 和腫瘤壞死因子通路有4 個蛋白被富集，VEGF信號通路有5 個蛋白被富集，其余通路富集蛋白數量見表3。

3 討論

血管性認知功能障礙是一種常見的中樞神經系統(central nervous system，CNS)退行性疾病，隨著年齡的增長，其對健康和生活質量的影響越來越明顯，發病率也越來越高，甚至會發展為癡呆，這不僅嚴重影響了患者的健康和生活質量，而且也給社會和家庭帶來了嚴峻的考驗[3]。針對血管性認知功能障礙的發病機制，目前臨床及基礎研究尚無定論，在臨床治療中也無療效確切的藥物和方案[4]。中醫采用辨證論治方法，以滋養腎、活血化瘀、化痰開竅為原則治療血管性認知功能障礙，取得較好的臨床效果。血府逐瘀湯是治療“胸中血府淤血”的常用理血方劑之一，具有活血化瘀、通絡止痛的功效，對血管性癡呆有明顯的改善作用[5]。研究顯示，通過多成分、多層面、多靶點、多通路研究及分析血府逐瘀湯及其有效成分，發現具有抗氧化應激、抗炎癥、改善機體微循環障礙等作用，并在一定程度上改善或延緩認知功能障礙的惡化[6-9]。因此，本文采用網絡藥理學方法研究血管性認知功能障礙相關藥物及其作用機理，為臨床和基礎研究奠定基礎，對緩解臨床癥狀和改善預后具有重要意義[15]。

本研究分析結果顯示，通過TCMSP 數據庫檢索血府逐瘀湯中各味藥的活性成分，并篩選出口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性值(DL)≥0.18 的血府逐瘀湯活性成分，共得到105 個有效活性成分和59個血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的主要潛在靶點。分析圖1 可見，有些化合物能調節多個作用靶點，比如甘草查爾酮B 可調控14 個潛在靶點、柚皮素能影響12 個潛在靶點、懈皮素可以調控10個潛在靶點等，但有少部分化合物只能調節一個靶點，比如β-胡蘿卜素僅作用于RBP4 靶點；反過來，一些關鍵蛋白也能被多種化合物調節和作用，但有部分蛋白質也只受一個化合物調節及影響。如AKT1 蛋白被12 種化合物調控，EGFR 可被31 種化合物調控，而TGFBR2、HLA-DRB1 和VCAM1 僅由一個化合物調控，這說明血府逐瘀湯具有多成分、多靶點間相互作用和作用的特點，一些關鍵化合物作用于關鍵靶點起到治療疾病的主要作用。

血府逐瘀湯治療VCI 有8 個關鍵靶點，44 條信號通路和40條GO生物功能過程，主要是通過調節細胞增殖周期、激酶活性、胰島素抵抗、MAPK 信號通路、PI3K-Akt 信號通路和TNF 通路等多靶點、多途徑、多層面發揮作用，有效地改善及治療血管性認知功能障礙的作用。在圖4中可見，一共有163個節點和582個邊，該網絡包含88個化合物、59個潛在靶點和16個通路。通過GO和KEGG富集分析可見，關鍵靶點TNF、EGFR、AKT1、MAPK富集于多條分子通路，亦反映關鍵靶點和分子通路在血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的關鍵性作用，如6個關鍵靶點富集于PI3K-Akt(磷酸肌醇-3羥激酶/蛋白激酶B)信號通路，5個關鍵靶點富集于HIF-1(缺氧誘導因子1)信號通路，5個關鍵靶點富集于MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)信號通路，FoxO和TNF通路有4個關鍵靶點被富集。整個富集中，PI3K-Ak信號通路、MAPK信號通路、FoxO和TNF通路被富集的蛋白最多，這均可說明這些通路在血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的過程中起到關鍵性作用。

Akt 是PI3K 信號傳導途徑中一個重要的下游靶激酶，具有調節細胞生長和遷移作用。PI3K/Akt信號通路在神經組織中廣泛存在，比如腦組織海馬，其PI3K和Akt靶點酶的活化可促進內皮細胞生存、減輕神經元的損傷[16-17]，減少炎癥細胞的死亡[18-19]、阻擋神經元凋亡[20-21]；血管性認知功能障礙與許多腦血管疾病有關，大多數患者表現為學習記憶力減退，嚴重者出現智能障礙和無法自理，其智能障礙呈現進行性發展趨勢[22]。研究顯示[23]：PI3K/Akt 信號通路存在于各種神經細胞中，通過激活PI3K/Akt 信號通路[24]及提高PI3K、Akt、HIF-1α以及血管內皮生長因子(VEGF)蛋白和基因表達，從而修復及保護神經元、發揮神經保護作用、調節血管舒縮功能[25]、改善腦循環、改善腦組織海馬神經元突觸可塑形態[26]、改善腦海馬神經元超微結構，說明PI3K/Akt通路在神經退行性疾病及腦血管疾病等中發揮重要作用。此外，PI3K/Akt通路的激活可通過調節神經系統中的神經元及各膠質細胞的活性、凋亡及自噬來發揮神經保護效應[27-28]及調節學習記憶功能[25]。葛根素和黃芪均能通過激活PI3K/Akt通路減少大鼠腦缺血再灌注引起神經元細胞的凋亡，起到神經保護作用[29-30]。中藥復方補陽還五湯及中藥單體化合物(地黃屬、魚草屬、車前屬等)通過促進腦皮層腦源性神經營養因子的表達，激活PI3K/Akt信號通路的轉導作用，從而抑制腦組織神經細胞的凋亡、改善血管血流量及能量、促進神經修復及保護作用，進而保護腦組織及改善認知功能[31]。與之相關的TNF、EGFR、MAPK等主要及關鍵基因，在血管性認知功能障礙的相關分子通路中起到相應的調節作用，改善認知功能障礙的相應臨床表現，為后期的臨床研究及基礎研究提供更深入的研究方向及靶點。

本文基于網絡藥理學方法預測血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的潛在靶點預測及研究其分子機制，從多成分、多靶點及多通路等系統層面揭示血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的作用機制，為臨床及基礎研究血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙的作用成分、關鍵靶點及其相關機制奠定基礎。下一步，我們將對預測的關鍵靶標和關鍵通路進行藥理學驗證，為進一步研究血府逐瘀湯治療血管性認知功能障礙提供依據。