miR-193a-5p靶向VASP干擾PI3K/AKT信號通路抑制胃癌細胞增殖和誘導細胞凋亡的機制研究

殷玉敬，高 輝，岳 林，楊文濤，薛麗英

胃癌是多因素參與的復雜病變過程，是人類常見的惡性腫瘤[1-2]。miRNA可參與多種信號通路調節，通過激活或抑制相關信號通路影響胃癌細胞的增殖、侵襲、轉移、凋亡等生物學功能，與胃癌的發生發展密切相關。miR-193a-5p在肺癌、膀胱癌、食管鱗狀細胞癌等癌癥中顯著下調[3]。Xiao等[4]證實miR-193a-5p作為抑癌miRNA已被用于胃間質瘤的診治靶點研究。PI3K/AKT信號通路活化可以抑制多種刺激誘發胃癌細胞凋亡，促進細胞周期進展、血管生成和轉移[5]。VASP是一種和肌動蛋白調節相關的多功能蛋白，研究表明miR-4455通過下調VASP可抑制PI3K/AKT信號通路活化，進而抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[6]。通過生物信息學分析發現VASP可能是miR-193a-5p的靶基因，但miR-193a-5p是否靶向VASP調控PI3K/AKT信號通路，進而影響胃癌細胞增殖和凋亡尚不清楚。因此，本研究旨在探討miR-193a-5p對胃癌細胞增殖和凋亡的影響，并分析VASP和PI3K/AKT信號通路的潛在作用，以期為治療胃癌提供有價值的靶點。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑 人胃黏膜上皮細胞株GES-1購自美國細胞培養收藏中心；人胃癌細胞株BGC-823和SGC7901購自中國科學院上海細胞研究所。DMEM培養基、RPMI-1640培養基、青霉素、鏈霉素購于Hyclone公司，胎牛血清購于Gibco公司，CCK-8試劑和胰蛋白酶購于Sigma公司，miRNeasy Mini Kit試劑盒、miRNAeasy提取試劑盒購于Qiagen公司，RT-qPCR購于寶生物工程(大連)有限公司，miR-NC、miR-193a-5p mimics、anti-miR-193-5p購于上海拓然生物科技有限公司。VASP干擾RNA和對照干擾RNA均由上海生物工程有限公司合成構建。RIPA裂解液、結晶紫染色液、BCA試劑盒、ECL化學發光試劑盒、辣根過氧化酶標記的二抗均購于碧云天公司，p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、β-actin一抗購于美國CST公司，pcDNA3.1空載體、VASP過表達載體pcDNA3.1-VASP由上海吉瑪生物科技有限公司合成構建，LipofectamineTM2000購于賽默飛公司。熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司。Annexin V/PI細胞凋亡試劑盒購于BD生物科學公司。所有引物由上海鉑尚生物科技有限公司設計合成。

1.2主要方法

1.2.1胃癌組織標本：采用胃癌患者60例的石蠟包埋標本，其中男37例，女23例；年齡32～80歲，中位年齡54歲；病理分期：早期14例，中晚期46例；分化程度：高分化13例，中分化28例，低分化19例。所有患者術前未接受過放化療。本研究經我院醫學倫理委員會批準，且患者知情并簽署知情同意書。

1.2.2細胞培養與轉染：人胃黏膜上皮細胞株GES-1常規培養于DMEM培養基中，內含10%胎牛血清、1.5×105U/L青霉素及50 mg/L鏈霉素；人胃癌細胞株BGC-823和SGC7901培養于RPMI-1640培養基中，內含10%胎牛血清、1.0×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素。所有細胞置于37℃、5%二氧化碳的恒溫培養箱中培養。待BGC-823和SGC7901細胞生長至80%融合度，以適當密度接種至6孔細胞板中，按照LipofectamineTM2000轉染試劑使用說明將轉染miR-193a-5p mimics(miR-193a-5p)、轉染anti-miR-193a-5p(anti-miR-193a-5p)、轉染VASP干擾RNA(si-VASP)、共轉染miR-193a-5p mimics和pcDNA3.1-VASP(miR-193a-5p+VASP)轉染至細胞，同時轉染無義序列或空載體作為陰性對照組(NC組)。

1.2.3RT-qPCR檢測miRNA和mRNA表達：按照實驗要求將60例胃癌組織、癌旁組織及GES-1、BGC-823、SGC7901細胞根據Trizol試劑說明提取細胞或組織中總RNA，使用miRNAeasy提取試劑盒提取miRNA。使用M-MLV逆轉錄酶以總RNA為模板逆轉錄成cDNA。MiR-193a-5p和U6引物來源于MicroRNA RT-qPCR試劑盒。以U6和β-actin為內參，計算miRNA和mRNA的相對表達水平。β-actin引物為：β-actin-F：5'-GGACCTGACTGACTACCTC-3'，β-actin-R：5'-TACTCCTGCTTGCTGAT-3'。

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖：將轉染后細胞以每孔4×103個的密度接種至96孔細胞板中，每孔加10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，每6孔為一組，分別于培養24、48、72和96 h時加入CCK-8溶液10 μl，置于37℃、5%二氧化碳培養箱中繼續培養2 h，采用酶標儀檢測各組細胞在450 nm波長處的吸光度值。取每天6孔平均值繪制細胞生長曲線。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡率：收集各組轉染48 h后的BGC-823和SGC7901細胞，并以1×109/L的濃度將細胞重懸于磷酸鹽緩沖溶液中，加Annexin V 5 μl和PI 5 μl室溫避光孵育15 min后，使用Accurri C6流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，檢測結果使用FlowJo 7.6.2軟件分析,實驗重復3次。

1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-193a-5p與VASP的靶向作用關系：生物信息學TargetScan軟件預測miR-193a-5p與VASP-3'-UTR結合位點。參照轉染試劑說明書將構建好的野生型VASP-3'-UTR-WT和突變型VASP-3'-UTR-WT的熒光素酶報告質粒及miR-con、miR-193a-5p mimics轉染至BGC-823和SGC7901細胞，6 h后換新鮮培養液并繼續培養24 h，按照雙熒光素酶報告基因實驗試劑盒操作步驟檢測各組細胞熒光素酶活性，實驗重復3次。

1.2.7Western blot檢測蛋白表達：收集胃癌組織和癌旁組織研磨液、胃癌細胞BGC-823和SGC7901，用細胞裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒檢測細胞中的總蛋白濃度。取20 μg變性蛋白上樣行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用濕轉法將蛋白凝膠轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后，置于含5%去脂奶粉的封閉液中4℃孵育過夜。以PBST洗膜后，再在4℃下將PVDF膜轉入1︰2000稀釋的一抗(VASP、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT)中反應過夜，經TBST洗膜后，加入1︰10 000稀釋的二抗于37℃下孵育1 h后行化學發光顯影，Image J分析目的條帶的灰度值，以β-actin為內參，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達情況。

2 結果

2.1miR-193a-5p在胃癌組織和胃癌細胞BGC-823、SGC7901中的表達 以60例胃癌匹配癌旁組織和人胃黏膜上皮細胞株GES-1為對照，RT-qPCR檢測發現，60例胃癌組織和胃癌細胞BGC-823、SGC7901中miR-193a-5p的表達均顯著下調，且BGC-823細胞中表達下調更為顯著，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2miR-193a-5p對胃癌細胞生長活力和凋亡的影響 通過瞬時轉染技術，在胃癌細胞BGC-823和SGC7901中上調或下調miR-193a-5p表達，采用RT-qPCR檢測其在BGC-823和SGC7901細胞中的轉染效果。結果顯示，與NC組相比，miR-193a-5p組miR-193a-5p表達顯著升高，anti-miR-193a-5p組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。CCK-8法檢測BGC-823和SGC7901細胞生長活力，結果顯示，與NC組相比，miR-193a-5p組細胞生長活力明顯降低，anti-miR-193a-5p組細胞生長活力顯著提高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。流式細胞術檢測細胞凋亡，結果表明miR-193a-5p可使BGC-823和SGC7901細胞的凋亡率顯著升高，而anti-miR-193a-5p組的細胞凋亡率呈現降低趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。上述結果表明， miR-193a-5p過表達能夠抑制胃癌細胞的增殖，同時誘導其凋亡。

圖2 RT-qPCR檢測BGC-823、SGC7901細胞中miR-193a-5p轉染效果

圖3 CCK-8法檢測BGC-823和SGC7901細胞增殖率

圖4 流式細胞術檢測BGC-823和SGC7901細胞凋亡率

2.3VASP與miR-193a-5p的靶向作用關系 通過TargetScan對miR-193a-5p和VASP結合進行預測，示意圖見圖5。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-193a-5p能夠明顯降低VASP-3'UTR-WT的熒光素酶活性(P<0.05)，而不影響VASP-3'UTR-MUT的熒光素酶活性(P>0.05)，見圖6A和B；miR-193a-5p過表達可負調控BGC-823和SGC7901細胞中VASP蛋白表達(P<0.05)，而anti-miR-193a-5p使VASP蛋白表達顯著上調(P<0.05)，見圖6C和D。提示VASP是miR-193a-5p的靶基因。

圖5 miR-193a-5p與VASP的3'UTR結合位點示意圖

圖6 VASP與miR-193a-5p的靶向作用關系

2.4VASP對胃癌細胞增殖和凋亡的影響 RT-qPCR和Western blot法檢測發現，與癌旁組織相比，胃癌組織VASP mRNA和蛋白的表達顯著上調(P<0.05)，見圖7，這與miRNA-193a-5p在胃癌組織中的表達相反，二者呈負相關(圖8)。轉染si-VASP后，BGC-823和SGC7901細胞中的mRNA和蛋白水平均顯著下調(P<0.05)，見圖9。CCK-8法檢測細胞生長活力，結果顯示si-VASP轉染后，細胞生長活力較si-con組顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；反之轉染pcDNA3.1-VASP細胞使VASP蛋白過表達，細胞增殖顯著增加且細胞凋亡率顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖10。提示VASP可促進BGC-823和SGC7901細胞的增殖和誘導其凋亡。

圖7 RT-qPCR和Western blot檢測胃癌組織中VASP的mRNA和蛋白表達

圖8 胃癌組織中miR-193a-5p與VASP表達水平的相關性

圖9 RT-qPCR和Western blot檢測VASP轉染效果

圖10 CCK-8法檢測BGC-823和SGC7901細胞的增殖

2.5miR-193a-5p對PI3K/AKT信號通路的影響 Western blot檢測結果顯示，與未轉染的Ctrl組相比，miR-193a-5p組對BGC-823細胞中p-PI3K、p-AKT蛋白表達有明顯抑制作用，而PI3K、AKT總蛋白表達變化不明顯，miR-193a-5p+VASP組則恢復了miR-193a-5p對p-PI3K、p-AKT蛋白表達的抑制作用，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖11。表明miR-193a-5p可干擾PI3K/AKT信號通路的活化。

圖11 miR-193a-5p抑制PI3K/AKT信號通路的活化

3 討論

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤，具有較高的發病率和病死率。miR-193a-5p是miRNA家族中的一員，既往研究證實乳腺癌中miR-193a-5p表達降低，miR-193a-5p過表達顯著抑制乳腺癌細胞的增殖和轉移能力[7]。還有學者指出肝癌細胞miR-193a-5p過表達顯著抑制肝癌細胞體外增殖和侵襲能力，促進細胞凋亡，并抑制體內腫瘤生長[8]。此外，干擾長鏈非編碼RNA TTN-AS1對前列腺癌細胞凋亡起促進作用，分析原因與上調miR-193a-5p表達有關[9]。本研究結果發現與癌旁組織相比，癌組織miR-193a-5p表達顯著下降；miR-193a-5p過表達則BGC-823和SGC7901細胞的生長活力明顯下降，細胞凋亡率顯著升高，而沉默miR-193a-5p則可使細胞生長活力提高，細胞凋亡率降低，這與Chou等[10]研究結論基本吻合。表明miR-193a-5p通過抑制胃癌細胞增殖和誘導凋亡參與胃癌的發生發展。

腫瘤細胞遷移能力與腫瘤的侵襲轉移密切相關。VASP是和肌動蛋白調節相關的多功能蛋白，能調節細胞黏附和伸展過程中肌動蛋白重排，在細胞遷移過程中起重要作用[11]。Liu等[12]研究表明，缺氧可誘導VASP表達上調，并通過改變上皮間質轉化表型和基質金屬蛋白酶表達，在體內外激活AKT信號通路，促進肝癌細胞遷移和侵襲。Tian等[13]證實VASP表達增加與乳腺癌患者預后不良呈正相關，干擾VASP表達可抑制乳腺癌細胞遷移能力。有研究指出，miR-22、苦參堿抑制胃癌細胞增殖和侵襲作用與下調VASP表達相關[14-15]。本研究RT-qPCR和Western blot檢測發現，與癌旁組織相比，胃癌組織VASP蛋白表達顯著上調，而VASP過表達可提升胃癌細胞生長活力和降低細胞凋亡率，沉默VASP則相反，故VASP具有致癌功能。經TargetScan預測發現VASP可能是miR-193a-5p的靶基因，雙熒光素酶報告基因實驗進一步驗證了VASP與miR-193a-5p的靶向作用關系；miR-193a-5p過表達可負調控BGC-823和SGC7901細胞中VASP蛋白表達，而anti-miR-193a-5p過表達則可顯著上調VASP蛋白表達，證實VASP是miR-193a-5p的靶基因，且miR-193a-5p經調控VASP表達影響胃癌細胞增殖和凋亡。PI3K/AKT信號通路通過磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白，進而調節細胞增殖分化、轉移、侵襲、凋亡和血管生成等，與多種癌癥的發生發展有密切關系[16-20]。PI3K介導信號通路異常激活，可致AKT信號傳導，最后使腫瘤細胞增殖和遷移[21-22]。p-AKT水平增加可致PI3K/AKT信號通路活化，促進腫瘤細胞生長、增殖，抑制腫瘤細胞凋亡[23-24]。

近年來研究發現，胃癌組織中PI3K/AKT信號通路上關鍵基因存在異常表達，同時該信號通路異常激活與腫瘤分化、淋巴結轉移及預后密切相關[19,25-26]。據報道，干擾miR-92b表達可抑制PI3K-AKT信號通路，從而導致胃癌細胞增殖減少和細胞凋亡增加[27]。miR-150-3p、miR-21-5p等miRNA通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[28-29]。但胃癌組織中miR-129a-5p、VASP和PI3K/AKT信號通路間的相關性仍未知。本研究發現miR-129a-5p對胃癌細胞BGC-823中p-PI3K、p-AKT蛋白表達有明顯抑制作用，而VASP過表達顯著減弱miR-129a-5p對p-PI3K、p-AKT的抑制作用；p-PI3K、p-AKT表達高低直接影響PI3K/AKT信號通路活性。表明miR-193a-5p通過靶向VASP干擾PI3K/AKT信號通路活化。故靶向miR-193a-5p/VASP途徑進而阻斷PI3K/AKT信號通路可能為胃癌治療提供新思路。

綜上，miR-193a-5p通過靶向VASP干擾PI3K/AKT信號通路，進而影響胃癌細胞的增殖和凋亡，具有抑癌作用。