基于影像學(xué)評(píng)價(jià)正弦電磁場對(duì)大鼠股骨骨折的影響

侯雪峰，賈鵬舉，柏 鑫，高玉海，任 莉，吳思敏，陳克明

骨折是人類最常見的大器官創(chuàng)傷[1]，其愈合時(shí)間久，常給患者帶來巨大的痛苦，因此如何促進(jìn)骨折愈合成為目前研究的熱點(diǎn)。隨著物理學(xué)與生物學(xué)及醫(yī)學(xué)的相互交叉結(jié)合，電磁場物理療法在骨質(zhì)疏松癥及其他代謝性骨疾病治療中的應(yīng)用越來越廣泛。研究表明，正弦電磁場(SEMFs)在特定條件參數(shù)下對(duì)胎兒成骨細(xì)胞及主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用[2]。相關(guān)研究指出，暴露持續(xù)時(shí)間90 min是SEMFs發(fā)揮作用的最佳時(shí)間[3]。本課題組前期研究也顯示，50 Hz的1.8 mT電磁場以波形依賴的方式影響成骨細(xì)胞的增殖和分化[4]；50 Hz的1.8 mT正弦交變電磁場可通過提高骨形成降低具有骨吸收活性的相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，有效提高青年大鼠的峰值骨量,并有效抑制尾吊大鼠的骨量丟失[5-7]；50 Hz、1.8 mT的SEMFs能提高大鼠股骨組織中骨代謝相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)增加鈣含量[8]。目前關(guān)于SEMFs的研究多集中于骨質(zhì)疏松癥，對(duì)于SEMFs促進(jìn)骨折愈合的研究尚不多見。因此結(jié)合本課題組的前期研究，本實(shí)驗(yàn)主要研究治療時(shí)間為90 min的50 Hz、1.8 mT SEMFs對(duì)大鼠股骨骨折愈合的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器與器械 電磁場治療儀，病理切片掃描儀(濱松公司，日本)，AG-X系列臺(tái)式電子萬能試驗(yàn)機(jī)(島津公司，日本)，High Resolutionin-vivo X-ray Microtomograph(布魯克科技有限公司，德國)，X線照片機(jī)(HOLOGIC公司，美國)，鈦合金克氏針(張家港市華陽醫(yī)療器械廠，中國)，骨科鉆(上海紫靄醫(yī)療器械有限公司，中國)，可吸收縫合線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司，中國)，圓鋸，手術(shù)器械。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 水合氯醛(天津大茂化學(xué)試劑公司，中國)、注射用青霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，中國)、碘伏皮膚消毒液(上海利康消毒高科技有限公司，中國)、75%乙醇(山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，中國)、0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，中國)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理方法 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠40只，體質(zhì)量(220±10)g，由蘭州大學(xué)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)：SCXK(甘)2014-0006-152。40只大鼠飼養(yǎng)于解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證編號(hào)：SYXK(軍)2017-0047，適應(yīng)性馴化1周后建立大鼠股骨開放性骨折模型。建模完成后立即攝X線片，確定大鼠建模是否成功，將建模成功大鼠隨機(jī)分成模型對(duì)照組(MC組)和SEMFs治療組(SEMFs組)，每組20只，嚴(yán)格控制溫度、濕度，自由進(jìn)食水。MC組不采取任何干預(yù)措施，SEMFs組每天給予50 Hz、1.8 mT SEMFs干預(yù)90 min。

1.4檢測項(xiàng)目與方法

1.4.1主要臟器HE染色及器官指數(shù)：開始實(shí)驗(yàn)8周后脫頸處死大鼠，迅速取出肝、腎、脾、心、肺，將周圍脂肪及黏膜組織剝離干凈，生理鹽水清洗殘留血液，反復(fù)清洗3遍后用濾紙吸干多余的生理鹽水并稱取各器官重量，計(jì)算器官指數(shù)。器官指數(shù)=器官重量/大鼠體質(zhì)量×100%。

1.4.2X線檢查：每2周對(duì)大鼠行X線檢查，每次檢查時(shí)先麻醉大鼠，然后對(duì)每只大鼠進(jìn)行檢查，檢查體位為俯臥位。通過X線片觀察各組大鼠骨痂生長情況，并根據(jù)骨痂評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠骨痂生長情況進(jìn)行評(píng)分。骨痂評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：斷端未見骨痂為Ⅰ級(jí)；斷端邊緣模糊，少見骨痂為Ⅱ級(jí)；斷端邊緣進(jìn)一步模糊，骨痂量增多但尚未填滿骨折缺損部位為Ⅲ級(jí)；斷端邊緣已完全消失，骨折缺損部位被骨痂填滿為Ⅳ級(jí)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)分別記為0、1、2、3分。

1.4.3生物力學(xué)指標(biāo)檢測：開始實(shí)驗(yàn)8周后，隨機(jī)取2組大鼠各6只，過量麻醉處死大鼠，迅速分離術(shù)側(cè)股骨，剔除股骨周圍其他組織，用生理鹽水浸泡過的紗布包裹于-20℃冰箱中保存。后將凍存的股骨室溫解凍2 h置于AG-IS生物力學(xué)萬能試驗(yàn)機(jī)上行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，支點(diǎn)跨距17 mm，中點(diǎn)為加壓點(diǎn)，加載速度為2 mm/min，計(jì)算機(jī)記錄載荷-位移曲線，得出彈性模量、最大載荷和斷裂點(diǎn)載荷骨生物力學(xué)指標(biāo)值。

1.4.4顯微CT三維重建：分別于各組開始實(shí)驗(yàn)4、8周后隨機(jī)取3只大鼠，過量麻醉處死，取出術(shù)側(cè)股骨，4%多聚甲醛固定后室溫保存。采用SkyScan1276掃描儀，源電壓85 V，源電流200 μA，中度分辨率，感興趣區(qū)域?yàn)橐怨钦劬€為中心的前后4 mm區(qū)域。使用CTvox軟件對(duì)股骨建模，使用NRecon軟件進(jìn)行三維重建。

1.4.5骨組織病理學(xué)檢測：開始實(shí)驗(yàn)4周后，脫頸處死2組大鼠，迅速取出術(shù)側(cè)股骨固定于4%多聚甲醛溶液中，1周后進(jìn)行包埋、切片、染色處理，處理后使用病理切片掃描儀進(jìn)行掃描，生成圖像后使用NDP.veiw軟件進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1SEMFs安全性分析 開始實(shí)驗(yàn)8周后，2組大鼠主要臟器的器官指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1；開始實(shí)驗(yàn)8周后，2組大鼠主要器官的組織病理學(xué)表現(xiàn)也未見明顯異常改變，見圖2。提示長期給予50 Hz、1.8 mT SEMFs治療對(duì)生長期大鼠未產(chǎn)生明顯的毒副作用。

圖1 開始實(shí)驗(yàn)8周后股骨骨折2組大鼠主要臟器器官指數(shù)

圖2 開始實(shí)驗(yàn)8周后股骨骨折2組大鼠主要臟器的組織病理學(xué)檢查結(jié)果(HE染色)

2.22組大鼠X線檢查結(jié)果比較 X線檢查結(jié)果顯示，SEMFs組股骨骨痂生長速度及質(zhì)量均明顯優(yōu)于MC組。開始實(shí)驗(yàn)4周后，SEMFs組骨折線幾乎消失，骨痂大量生長形成骨橋連結(jié)，骨痂基本填滿骨折缺損部位；開始實(shí)驗(yàn)6周后，可見骨痂進(jìn)一步鈣化，并且開始骨痂塑形；開始實(shí)驗(yàn)8周后骨痂塑形基本完成。MC組開始實(shí)驗(yàn)4周及6周后仍然可見明顯的骨折縫隙，縫隙中骨痂含量較少，至開始實(shí)驗(yàn)8周后觀察僅有一半的骨橋連結(jié)相對(duì)完整，另一半骨折線仍清晰可見。見圖3。骨痂評(píng)分結(jié)果顯示，SEMFs組各階段骨痂評(píng)分均高于MC組(P<0.01)，見圖4。

圖3 股骨骨折2組大鼠X線檢查骨折愈合情況

圖4 股骨骨折2組大鼠X線骨痂評(píng)分比較

2.32組大鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果比較 開始實(shí)驗(yàn)8周后2組大鼠股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果顯示，SEMFs組彈性模量顯著升高(P<0.01)，而2組最大載荷與斷裂點(diǎn)載荷比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。提示SEMFs可增強(qiáng)骨折愈合后股骨的韌性。

表1 股骨骨折2組大鼠實(shí)驗(yàn)8周三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果

2.42組大鼠顯微CT結(jié)果比較 顯微CT掃描結(jié)果顯示，開始實(shí)驗(yàn)4周后SEMFs組骨折斷端部位骨痂填充良好，骨橋連結(jié)完整，而MC組骨折斷端部位骨痂填充較少，骨橋尚未連接。開始實(shí)驗(yàn)8周后，SEMFs組明顯可見骨痂塑形基本結(jié)束，股骨形態(tài)基本恢復(fù)，而MC組骨痂尚未完全吸收，見圖5、6。顯微CT三維立體重建結(jié)果顯示，SEMFs組骨痂生長塑形進(jìn)程明顯快于MC組，開始實(shí)驗(yàn)8周后SEMFs組股骨表面較MC組平整，基本恢復(fù)股骨原有形態(tài)，見圖7。

圖5 股骨骨折2組大鼠股骨顯微CT平面橫切圖

圖6 股骨骨折2組大鼠股骨顯微CT立體橫切圖

圖7 股骨骨折2組大鼠股骨顯微CT三維立體重建圖

2.52組大鼠股骨組織病理學(xué)觀察 開始實(shí)驗(yàn)4周后，SEMFs組骨痂組織中見大量成熟的骨組織，排列相對(duì)整齊，而MC組骨折斷端主要以纖維軟骨細(xì)胞為主，鈣化不明顯。見圖8。提示SEMFs在促進(jìn)骨折愈合方面具有良好效果，且無明顯毒副作用。

圖8 股骨骨折2組大鼠股骨組織病理學(xué)檢查結(jié)果(HE染色)

3 討論

骨折常由于跌撲撞擊等外力作用導(dǎo)致，常通過手術(shù)解剖復(fù)位，但其修復(fù)時(shí)間漫長，且術(shù)后常有骨延遲愈合及骨不連的發(fā)生，發(fā)生率為8%～10%[9]。如何促進(jìn)骨折修復(fù)，縮短病程，減輕患者痛苦成為創(chuàng)傷骨科的一大難題。

近年來，物理療法因便捷有效逐漸成為醫(yī)療研究的熱點(diǎn)。相關(guān)研究表明，電磁場作為一種可調(diào)節(jié)的恒強(qiáng)磁場對(duì)體內(nèi)的細(xì)胞、基因、蛋白可產(chǎn)生多種影響[10]。本課題組前期研究證實(shí)1.8 mT的SEMFs可促進(jìn)體外培養(yǎng)大鼠股骨組織的骨形成，提高骨組織中堿性磷酸酶活性，并抑制骨吸收，調(diào)節(jié)骨骼重塑[11]。同時(shí)本課題組研究發(fā)現(xiàn)，50 Hz的SEMFs具有雙強(qiáng)度窗效應(yīng)，即在1.8 mT和3.6 mT作用下最為明顯[12-13];進(jìn)一步研究證實(shí)，治療時(shí)間為1.5 h的1.8 mT、50 Hz的SEMFs可促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的成熟及礦化[14]。除此之外，SEMFs對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化成熟也有一定影響，SEMFs以時(shí)間依賴性的方式誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化，且以1.8 mT強(qiáng)度干預(yù)效果最為明顯[15-17]。SEMFs發(fā)揮作用主要是通過激活Wnt10b/β-catenin、BMP-Smad及NO-cGMP-PKG等多條信號(hào)途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化成熟與礦化，同時(shí)通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞前列腺素E2分泌影響OPG/Rankl的基因表達(dá)，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性[18-22]。

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，SEMFs組X線骨痂評(píng)分明顯優(yōu)于MC組，且通過不同時(shí)間的X線觀察可以確定SEMFs組骨折愈合速度明顯加快，顯微CT結(jié)果進(jìn)一步表明SEMFs組的骨折修復(fù)效果優(yōu)于MC組。SEMFs組骨痂組織中可見大量成熟的骨組織，排列相對(duì)整齊，而MC組骨折斷端主要以纖維軟骨細(xì)胞為主，鈣化不明顯，說明SEMFs在促進(jìn)骨折愈合方面具有良好效果，且無明顯的毒副作用。另外，在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，生物力學(xué)指標(biāo)未表現(xiàn)出明顯的差異性，開始實(shí)驗(yàn)8周后，SEMFs組骨折塑形基本完成，而MC組尚有大量骨痂存在，可能為最大載荷及斷裂點(diǎn)載荷未表現(xiàn)出差異性的原因。

綜上，SEMFs對(duì)骨折愈合具有良好的促進(jìn)作用，可明顯促進(jìn)骨痂生長，改善骨組織形態(tài)學(xué)，促進(jìn)大鼠股骨骨折的愈合。本研究僅初步證明了SEMFs對(duì)骨折愈合具有一定的作用，雖然本課題組前期的體外研究已經(jīng)闡明了一些作用機(jī)制，但是由于機(jī)體相對(duì)于組織細(xì)胞更系統(tǒng)、更復(fù)雜，故其具體作用機(jī)制仍需在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示驗(yàn)證。