脈沖電磁場對模擬高原環境下大鼠骨折愈合的影響

柏 鑫，樊 佳，侯雪峰，高玉海，吳思敏，任 莉，陳克明

骨折愈合是一個復雜的生物學修復過程，骨折愈合程度和時間受年齡、基礎疾病、受傷程度、骨折部位、骨折類型及治療方法等因素影響[1]，常需手術治療，且延遲愈合、骨不連是術后常見并發癥。研究發現，高原地區骨折愈合時間較平原地區延長，且骨折延遲愈合、骨不連發生率高于平原地區[2]，原因可能與高原地區氧分壓低致缺氧、大氣壓低、氣候干燥寒冷等多種因素對骨折愈合產生負面影響有關[3]。1974年Basset首次應用脈沖電磁場(PEMFs)治療骨不連取得較滿意效果[4]，PEMFs以無創傷、無接觸、安全性高、療效顯著等優點被廣泛應用于臨床新鮮舟骨骨折、脛骨骨折延遲愈合等的治療[5]。本實驗以大鼠為研究對象，采用股骨橫斷骨折加克氏針髓內固定法建立動物模型，通過觀察動物生活習性、影像學、生物力學等評判電磁場干預對高原環境下骨折愈合的影響。

1 材料與方法

1.1實驗試劑 水合氯醛(天津大茂化學試劑公司，中國)、注射用青霉素(山東魯抗醫藥股份有限公司，中國)、碘伏皮膚消毒液(上海利康消毒高科技有限公司，中國)、0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業股份有限公司，中國)。

1.2實驗儀器 電磁場治療儀(本實驗室自行研制，專利號：ZL201120528586.0)，DYC-3070型模擬高原低壓低氧動物實驗艙群(貴州風雷航空軍械有限責任公司)，AG-X系列臺式電子萬能試驗機(島津公司，日本)，High Resolutionin-vivo X-ray Microtomograph(布魯克科技有限公司，德國)，X線照片機(HOLOGIC公司，美國)，-20℃低溫冰箱(三洋公司，日本)，1.2 mm鈦合金克氏針(張家港市華陽醫療器械廠，中國)，骨科鉆(上海紫靄醫療器械有限公司，中國)，可吸收縫合線(上海浦東金環醫療用品股份有限公司，中國)；圓鋸，彎剪若干，手術刀，止血鉗若干，3-0可吸收縫合線等相關手術器械。

1.3動物分組與處理 36只6～8周齡、體質量(220±10)g的雄性Wistar大鼠，購自蘭州大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(甘)2018-0002。36只大鼠在本院SPF級動物實驗中心適應性飼養1周后按隨機數字表法分為平原對照組、高原對照組、高原電磁場治療組，每組12只。

1.4造模方法 將大鼠禁食24 h后經10%水合氯醛(0．3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，麻醉成功后將大鼠右下肢剃毛，局部皮膚碘伏消毒，鋪無菌洞巾。沿右側股骨切開皮膚，鈍性分離肌肉并充分暴露股骨，使用直徑0.8 mm克氏針垂直于股骨平行鉆孔，間距約1 cm，使用圓鋸垂直鋸斷股骨，切割同時使用生理鹽水沖洗，防止過熱損傷相應組織，將可吸收縫合線依次穿過斷端0.8 mm孔洞備用，使用1.2 mm克氏針固定股骨，確認固定牢靠后將可吸收縫合線打結，保證骨折斷端穩定性。逐層縫合傷口，術后連續3 d肌內注射青霉素預防感染。術后行X線檢查，確認骨折類型為股骨中段橫斷骨折或短斜形骨折，骨折斷裂間隙≤0.5 mm，骨折對位良好、無移位，即為造模成功[6]。

1.5干預措施 等待大鼠麻醉蘇醒后將高原對照組及高原電磁場治療組大鼠分別放入低壓氧艙，以20 m/min的速度上升至海拔5000 m高度[7]，平原對照組大鼠飼養于本院SPF級動物實驗中心(海拔1400 m)，高原電磁場治療組大鼠采用50 Hz、0.6 mT、50%占空比的PEMFs處理，90 min/d[8]，其余2組大鼠做相同處理，但設備不通電。共干預8周，干預期間大鼠自由進食、攝水。

1.6觀察項目與方法

1.6.1動物生活習性、體質量及臟器系數：實驗期間密切觀察大鼠生理反應和生活習性的變化，注意皮毛色澤、手術傷口是否發生感染、可吸收縫合線是否脫落及是否出現健肢代償。每2周稱量大鼠體質量1次，開始實驗8周后采取頸椎脫臼法處死大鼠，立即取出心臟、肝臟、脾臟、肺及腎臟并稱重，計算各臟器與體質量的比值即為臟器系數[9]。

1.6.2X線骨痂評分：每2周對大鼠行X線檢查，掃描時先麻醉大鼠，后俯臥位拍攝每只大鼠。通過X線片觀察各組大鼠骨痂生長情況，并根據X線骨痂評分標準請2名骨科醫師及1名影像學醫師評定大鼠骨痂生長情況。骨折斷端未見骨痂為Ⅰ級；骨折斷端邊緣模糊，少見骨痂為Ⅱ級；斷端邊緣進一步模糊，骨痂量增多但尚未填滿骨折缺損部位為Ⅲ級；斷端邊緣已完全消失，骨折缺損部位被骨痂填滿為Ⅳ級。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級分別記為0、1、2、3分。

1.6.3生物力學指標：開始實驗8周后，各組隨機取6只大鼠，頸椎脫臼法處死，迅速分離術側股骨，剔除軟組織，拔出髓內釘，迅速用生理鹽水浸泡紗布包裹保存于-20℃冰箱中待用，檢測時樣本室溫下自然晾干后置于AG-IS生物力學萬能試驗機上行三點彎曲試驗，支點跨距17 mm，中點為加壓點，加載速度為2 mm/min，計算機記錄載荷-位移曲線，得出彈性模量和最大載荷骨生物力學指標值[10]。

1.6.4顯微CT掃描結果：開始實驗4、8周后隨機從各組取3只大鼠，過量麻醉處死，取出術側股骨，剔除軟組織，拔出髓內釘后用4%多聚甲醛固定后室溫保存。使用SkyScan1276顯微CT掃描儀，源電壓85 V，源電流200 μA，中度分辨率，感興趣區域為以骨折線為中心的前后4 mm區域。使用CTvox軟件對股骨建模，使用NRecon軟件進行三維重建。

2 結果

2.1大鼠一般情況 實驗期間3組大鼠體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。開始實驗8周后3組大鼠臟器系數比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。實驗期間大鼠飲食飲水無明顯變化，皮毛色澤正常、手術傷口無感染、縫合線自然脫落，未出現健肢代償，飼養于模擬高原環境下大鼠活動稍減弱。

表1 3組大鼠實驗期間體質量變化情況

表2 3組大鼠開始實驗8周后臟器系數比較情況

2.2X線骨痂評分及X線檢查結果比較 實驗期間，平原對照組及高原電磁場治療組骨折X線骨痂評分均高于高原對照組(P<0．05)，平原對照組與高原電磁場治療組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組大鼠實驗期間X線骨痂評分情況分)

造模后及開始實驗2、4、6、8周后3組大鼠股骨X線檢查情況見圖1。開始實驗2周后3組均有骨痂形成，但高原對照組骨痂量相對較少。開始實驗4周后平原對照組及高原電磁場治療組骨折周圍可見梭形骨痂影，骨折線模糊，而高原對照組雖有骨痂形成但骨折線仍清晰可見。開始實驗6周后平原對照組及高原電磁場治療組骨折周圍梭形影逐漸規則、致密，而高原對照組仍可見模糊骨折線。開始實驗8周后平原對照組及高原電磁場治療組股骨應力軸線以外的骨痂較前減少，說明此時骨折已進入骨痂塑形期，而高原對照組骨折斷端仍有不規則骨痂，由此可見高原對照組骨折愈合較其他2組緩慢。

2.3生物力學指標比較 開始實驗8周后，高原對照組股骨彈性模量、最大載荷均低于平原對照組與高原電磁場治療組(P<0．05)，平原對照組與高原電磁場治療組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 3組大鼠實驗8周后股骨生物力學指標比較

2.4顯微CT掃描結果比較 開始實驗4周后顯微CT掃描感興趣區骨痂平面橫切圖(圖2)、立體重建圖(圖3)及立體縱切圖(圖4)可見，平原對照組與高原電磁場治療組骨折斷端出現大量骨痂包裹，骨折斷端邊緣模糊，缺損區域幾乎被骨痂填滿。高原對照組骨折斷端生成的骨痂較少，骨折斷端邊緣仍清晰可見，缺損區域較大且僅有少量骨痂填充。開始實驗8周后顯微CT掃描感興趣區骨痂平面橫切圖(圖5)、立體重建圖(圖6)及立體縱切圖(圖7)可見平原對照組及高原電磁場治療組股骨應力軸線以外的骨痂較開始實驗4周后減少，骨小梁排列規則、致密，骨折部位形成骨性連接，而高原對照組骨折周圍仍可見梭形骨痂，骨折線仍可見。進一步證明高原對照組骨折愈合較其他2組緩慢。

圖2 3組大鼠開始實驗4周后顯微CT掃描平面橫切圖

圖3 3組大鼠開始實驗4周后顯微CT掃描立體重建圖

圖4 3組大鼠開始實驗4周后顯微CT掃描立體縱切圖

圖5 3組大鼠開始實驗8周后顯微CT掃描平面橫切圖

圖6 3組大鼠開始實驗8周后顯微CT掃描立體重建圖

圖7 3組大鼠開始實驗8周后顯微CT掃描立體縱切圖

3 討論

骨折是臨床骨科常見疾病，骨折延遲愈合、不愈合是骨折術后常見并發癥，而在高海拔、低氣壓、低氧、低溫環境下骨延遲愈合、骨不連的發生率均高于平原地區，嚴重影響患者的生活質量。近年來隨著高原醫學的發展，高原低壓缺氧環境對骨組織的影響逐漸受到人們的關注[11]。

本實驗通過觀察大鼠一般情況、測量體質量及計算臟器系數來比較不同飼養環境對大鼠身體狀況的影響，結果顯示整個實驗過程中飼養于模擬高原環境下大鼠活動稍減弱，3組大鼠體質量比較差異無統計學意義，臟器系數比較差異無統計學意義，3組大鼠一般情況良好，精神狀態佳，提示本實驗所用電磁場設備具有較好的安全性。通過X線骨痂評分及圖像比較骨痂生長情況及骨折愈合情況。X線骨痂評分結果顯示，實驗期間平原對照組及高原電磁場治療組X線骨痂評分均高于高原對照組，差異有統計學意義，而平原對照組與高原電磁場治療組X線骨痂評分比較差異無統計學意義。X線圖像比對顯示，實驗期間平原對照組及高原電磁場治療組愈合情況較接近，而高原對照組骨痂形成緩慢且數量相對較少，骨折愈合較其他2組緩慢，同時顯微CT掃描結果進一步證實了上述結論。通過股骨三點彎曲試驗來檢測骨生物力學性能，骨生物力學參數可以直接反映出骨的抗骨折能力，骨最大載荷可以客觀反映出骨整體的抗骨折能力，彈性模量可客觀反映骨自身的相對韌性[12]。本實驗結果顯示，開始實驗8周后平原對照組及高原電磁場治療組彈性模量及最大載荷均高于高原對照組，差異有統計學意義，而平原對照組與高原電磁場治療組彈性模量及最大載荷比較差異無統計學意義。提示電磁場治療提高了高原環境下骨折骨組織的生物力學性能，使高原環境下骨折骨組織的生物力學性能與平原低海拔地區相近。

綜上，PEMFs干預可以有效加速模擬高原環境下股骨骨折大鼠骨折愈合，促進骨痂形成，縮短骨折愈合時間，提高股骨強度,使骨折愈合情況與平原低海拔地區相近，但具體作用機制仍需進一步研究。