羽扇豆炭疽病病原鑒定及室內藥劑篩選1)

姜蘇月 靳俊媛 劉靜 劉寶玉 孫福慶 白慶榮

(吉林農業大學，長春，130118)(巴彥淖爾市植保植檢站) (雙遼市園藝特產站) (吉林農業大學)

羽扇豆(Lupinusmicranthus)俗稱魯冰花，是薔薇目豆亞目豆科蝶形花亞科羽扇豆屬一年生或多年生草本植物，有觀賞和食用2種用途。羽扇豆自然分布非常廣泛，品種繁多，主要分布在東半球的非洲和地中海地區以及西半球的美洲。觀賞羽扇豆基生掌狀復葉，葉形有橢圓、卵圓、窄葉等，頂生總狀花序，花期達2個多月。花色有單色和復色，具有較高的觀賞價值，可用于室內和室外的綠化[1]。炭疽病是常見的真菌病害，且寄主范圍極為廣泛，目前國內外報道的炭疽病原菌侵染的寄主主要有玉米(Zeamays)、芒果(Mangiferaindica)、茶樹(Camelliasinensis)、辣椒(Capsicumannuum)、葫蘆科(Cucurbitaceae)作物等重要經濟作物，對植物的根、莖、葉和果實均可危害[2-6]。2017年6月在長春市百花園種植的羽扇豆受到一種病害的嚴重威脅。該病害在羽扇豆的苗期發生，發病率超過40%，發病嚴重的葉邊緣出現大量圓形或橢圓形病斑，莖部和生長點受害嚴重的扭曲壞死，嚴重影響了羽扇豆的經濟價值和觀賞價值。該病害在美國[7]、韓國[8]等地有所報道，但國內報道較少，江西農業大學的Zou et al.[9]也僅是將羽扇豆炭疽病病原菌鑒定為Colletotrichumlupini。因此,進一步研究該病原菌的生物學特性，篩選出高效的防治藥劑，對該病害的預防與防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病害標本的采集及癥狀觀察

2017年6月，在長春市百花園培育的盆栽羽扇豆幼苗上發現病害，對病害癥狀進行數碼拍照記錄，用剪刀從根部剪取病害植株放入采集袋中，以備后期制成病害標本保存，并在實驗室對其進行顯微鏡觀察。

1.2 病原菌分離、純化和致病性測定

采用組織分離法對病原菌進行分離，剪取罹病植株病健交界處組織2～5 mm2，在體積分數75%的乙醇中消毒30 s，然后用無菌水沖洗3次，置PDA平板上，每皿4塊，25 ℃恒溫培養。挑取菌落邊緣的菌絲，移植到PDA培養基上進行純化，純化的菌種保存備用[10]。

將純化的分離物在PDA培養基上培養10 d，配成105個·mL-1的孢子懸液，然后將孢子懸液噴灑到已消毒的5株健康羽扇豆幼苗上，用無菌水噴灑的植株作為對照，22～25 ℃溫室中塑料袋保濕培養72 h，去掉塑料袋，定期觀察并記錄植株發病情況。

1.3 病原菌形態特征及DNA序列測定

觀察培養基上病原菌的菌落形態、顏色及生長狀況。顯微鏡下觀察病原菌的產孢結構，孢子的形態，并測量孢子(100個)大小，做好記錄。

采用CTAB法[11]提取病原菌菌絲體的總DNA。以總DNA為模板，利用ITS4/ITS5(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增病原菌的ITS區段，利用特異性引物CHS-79F/CHS-345R(5′-TGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG-3′)/(5′-TGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTG-3′)擴增查爾酮合成酶基因、利用GDF/GDR(5′-GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA-3′)/(5′-GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT-3′)擴增3-磷酸甘油醛脫氫酶基因、利用T1/Bt-2b(5′-AACATGCGTGAGATTGATAGT-3′)/(5′-ACCCTCAGTGTSGTGACCCTTGGC-3′)擴增β-Tubulin基因。送至生工生物工程公司進行測序，并將所得的序列與GenBank核酸數據庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的相關序列進行同源性比較。

1.4 病原菌生物學特性測定

培養基對病原菌菌絲生長及產孢的影響：將直徑為8 mm的菌餅分別放置在PDA培養基、PCA培養基、PSA培養基、WA培養基、OA培養基、CA培養基、黃瓜培養基和V8培養基中培養，3次重復。采用十字交叉法5 d后測量菌落直徑，10 d血球計數板計算產孢量[12](測定方法下同)。

光照對病原菌菌絲生長及產孢的影響：將病原菌放置在不同光照條件下(全光照、12 h光照-12 h黑暗和完全黑暗)培養，3次重復。5 d后測量菌落直徑，10 d計算產孢量。

溫度對病原菌菌絲生長及產孢的影響：將培養在PDA平板上的病原菌分別放置在培養箱中，4、10、15、20、25、30、35 ℃恒溫培養，3次重復[13]。5 d后測量菌落直徑，10 d計算產孢量。

氮源對病原菌菌絲生長及產孢的影響：以查氏培養基為基礎培養基，稱取等量的硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨、L-丙氨酸、L-胱氨酸、甘氨酸、硝酸銨代替查氏培養基中的氮源[14]，每個處理做3次重復。25 ℃恒溫培養，5 d后測量菌落直徑，10 d計算產孢量。

碳源對病原菌菌絲生長及產孢的影響：以查氏培養基為基礎培養基，稱取等量的果糖、乳糖、淀粉、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、木糖代替查氏培養基的碳源，每個處理3次重復[15]。25 ℃恒溫培養，5 d后測量菌落直徑，10 d計算產孢量。

pH對病原菌菌絲生長及產孢的影響：用HCl(1 mol·L-1)和NaOH(1 mol·L-1)調試滅菌后的PDA培養基pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，將8 mm的病原菌菌餅接在不同pH的平板上，3次重復[16]。5 d后測量菌落直徑，10 d計算產孢量。

病原菌菌絲及孢子的致死溫度：將培養好的病原菌斜面試管，分別放在水浴鍋中35、40、45、50、55、60、65、70 ℃恒溫處理10 min。完成后放置冷水中冷卻到室溫，再將試管內的菌絲轉入PDA平板中，25 ℃恒溫培養，3次重復，觀察菌絲是否生長，確定菌絲的致死范圍，再以1 ℃為梯度確定菌絲的致死溫度。配制成孢子懸液，注入滅菌后的2 mL試管中，分別置35、40、45、50、55、60、65、70 ℃恒溫處理10 min，完成后放入冷水中冷卻，3次重復，恒溫培養觀察孢子是否萌發，確定孢子致死范圍，再以1 ℃為梯度確定孢子的致死溫度。

采用DPS2.0軟件對試驗數據進行統計分析，并用Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗。

1.5 室內藥劑敏感性測定

供試菌株：YSD01、YSD02由吉林農業大學植物保護學院植物病理實驗室分離鑒定并保存。

供試藥劑：質量分數10%苯醚甲環唑WG、250 g·L-1嘧菌酯SC、質量分數75%百菌清WP(先正達作物保護有限公司)；質量分數60%唑醚·代森聯WG(巴斯夫有限公司)；質量分數75%肟菌·戊唑醇WG(拜耳作物科學有限公司)；質量分數50%多菌靈WP(江蘇藍豐生物化工股份有限公司)；質量分數70%代森錳鋅WP(利民化工股份有限公司)；250 g·L-1咪鮮胺EC(允發化工有限公司)；質量分數50%克菌丹WP(安道麥馬克西姆有限公司)；質量分數70%代森聯WG、250 g·L-1吡唑醚菌酯EC(巴斯夫植物保護有限公司)；質量分數40%腈菌唑WP(運城綠康實業有限公司)；體積分數22.5%啶氧菌酯SC(美國杜邦公司)；質量分數25%咪鮮胺·多菌靈WP(上海惠光化學有限公司)；質量分數65%代森鋅WP(上海惠光環境科技有限公司)；體積分數15%氟硅唑EW(廣東中迅農科股份有限公司)；500 g·L-1甲基硫菌靈SC(江蘇龍燈化學有限公司)；質量分數50%異菌脲WP(蘇州富美實植物保護劑有限公司)；質量分數40%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽WP(日本曹達株式會社)；430 g·L-1戊唑醇SC(江蘇豐州集團股份有限公司)。

采用生長速率法[17]，比較病原菌在不同混藥平板中生長受抑制的程度。將不同藥劑配置成1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mg·L-16個質量濃度。將配置好的藥劑溶液按照質量濃度由低到高分別取1 mL加入滅菌后冷卻的含有9 mL PDA培養基的三角瓶中，充分混勻配置成混藥平板。每種藥劑3次重復。對照培養基加入等體積的無菌水。將病原菌打成8 mm菌餅放置在混藥平板中，25 ℃恒溫培養。待對照病原菌菌絲長至培養皿2/3時，十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長的抑制率。

孢子萌發法：制備105個·mL-1的孢子懸液，取0.1 mL孢子懸液涂布于藥劑質量濃度為1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8mg·L-1的WA混藥平板上，25 ℃恒溫培養，每2 h對孢子萌發情況進行觀察，以芽管長度超過孢子最大直徑長度的一半作為該孢子是否萌發的標準。當對照平板上孢子萌發率達到80%以上時，4 ℃冷藏終止孢子萌發，逐一觀察不同處理平板上孢子萌發情況，計算孢子萌發抑制率。

孢子萌發抑制率=(對照孢子萌發數-處理孢子萌發數)/對照孢子萌發數×100%。

查機率值與抑制率換算表，用最小二乘法建立毒力回歸方程，計算各藥劑對病原菌的有效中濃度(EC50)，比較病原菌對各種藥劑的敏感程度。

2 結果與分析

2.1 癥狀描述

病害多從羽扇豆葉片邊緣開始發生，病斑半圓形或橢圓形，病斑蒼白色或枯草色，邊緣清晰，深褐色，病健交界明顯；嫩莖受害，形成深褐色梭形病斑，生長點受害，幼嫩部分扭曲畸形直至干枯死亡(見圖1)。

圖1 羽扇豆炭疽病病害癥狀

2.2 病原菌分離、純化及致病性

經組織分離和單孢純化，分別從葉片和莖部獲得2株分離物，命名為YSD01，YSD02。采用孢子懸液噴霧法接種健康的羽扇豆幼苗植株，接種7 d后羽扇豆開始發病，10 d后葉片出現明顯的病斑，莖部扭曲壞死。不同分離部位得到的菌株所引起的癥狀相同(見圖2)。從發病部位再分離后得到的分離物與接種的菌株形態相同，證實分離獲得的菌株為致病菌。因菌株YSD01與YSD02形態特征一致，為同一株菌，故后續試驗均以YSD01為樣本。

A.對照植株；B、C.發病植株；D.葉片發病癥狀；E.莖部發病癥狀。

2.3 病原菌的形態特征及分子生物學

形態特征：病原菌在PDA培養基上25 ℃培養4 d，菌落近圓形，白色至淺灰色，產生氣生菌絲體，背面深墨綠色，菌落直徑為30～44 mm，菌落7～10 d長滿直徑90 mm平板。分生孢子產生于單個或分支的菌絲頂端，無色，圓柱形，一端尖，一端圓潤，有時兩端圓潤，無分隔，直或稍彎曲，大小為(10.84～22.21)μm×(3.58～6.74)μm(見圖3)。

病原菌分子生物學：利用通用引物ITS4/ITS5、特異性引物CHS-79F/CHS-345R、GDF/DFR和T1/Bt-26對代表菌株進行PCR擴增。測序結果與GenBank中相關序列進行同源性比較，ITS序列(GenBank登錄號為MH178095)與Colletotrichumlupini(Accession No.KF207599.1)序列同源性為99%，CHS序列(GenBank登錄號為MK052978)與Colletotrichumlupini(Accession No.JQ948822.1)序列同源性為100%，GADPH序列(GenBank登錄號為MK036022)與Colletotrichumlupini(Accession No.KU974983.1)序列同源性為100%，TUB序列(GenBank登錄號為MK036021)與Colletotrichumlupini(Accession No.JQ949812.1)序列同源性為100%，系統發育樹顯示，菌株YSD01與C.lupini聚為一個進化枝，且支持率100%，查閱文獻[18]，結合形態特征和多基因系統發育樹確定該病原菌為Colletotrichumlupini。

A.PDA菌落正面形態；B.PDA菌落背面形態；C、D.分生孢子。

圖4 基于CHS、GAPDH、TUB三基因合并序列的系統發育樹

2.4 培養條件對病原菌菌絲生長及產孢的影響

2.4.1 培養基的影響

菌株YSD01在8種培養基上均能生長和產孢，在PDA培養基上菌絲生長和產孢最好，在V8培養基上菌絲生長最慢，在WA培養基中產孢量較低(見表1)。

表1 不同培養基培養時病原菌菌株YSD01菌絲生長及產孢量

2.4.2 光照的影響

菌株YSD01在不同光照條件下生長和產孢量不同，光照有利于菌絲生長和產孢，黑暗條件下菌絲生長較慢且產孢量低(見表2)。

表2 不同光照培養時病原菌菌株YSD01菌絲生長及產孢量

2.4.3 溫度的影響

菌株YSD01在20～30 ℃菌絲生長良好，在25 ℃時菌絲生長最好；10～30 ℃均能產生孢子，25 ℃時產生孢子最多。在5 ℃和35 ℃時不產生孢子(見表3)。

表3 不同溫度培養時病原菌菌株YSD01菌絲生長及產孢量

2.4.4 氮源的影響

菌株YSD01在以蛋白胨為氮源的培養基上菌絲生長速度最快；在以硝酸鉀為氮源的培養基中產孢最好；在以硫酸銨和硝酸銨為氮源培養基中未產孢(見表4)。

表4 不同氮源培養時病原菌菌株YSD01菌絲生長及產孢量

2.4.5 碳源的影響

菌株YSD01在以葡萄糖為碳源的培養基中菌絲生長速度最快，其次為麥芽糖為碳源的培養基；以山梨醇為碳源的培養基中產孢最好；在以木糖為碳源的培養基中產孢較低(見表5)。

2.4.6 pH的影響

菌株YSD01在pH=4～11條件下菌絲均能生長，pH=7時菌絲生長和產孢最佳，pH=4菌絲生長和產孢較差(見表6)。

表5 不同碳源培養時病原菌菌株YSD01菌絲生長及產孢量

表6 不同pH培養時病原菌菌株YSD01菌絲生長及產孢量

2.4.7 病原菌菌絲及孢子的致死溫度

以5 ℃為梯度，確定病原菌菌絲和孢子的致死溫度均在50～55 ℃，再以1 ℃為梯度，確定病原菌菌絲致死溫度為51 ℃，孢子致死溫度為52 ℃。

2.5 病原菌對不同室內藥劑的敏感性

由表7可見，在20種供試藥劑中，病原菌菌絲對質量分數50%多菌靈、質量分數75%肟菌戊唑醇和質量分數10%苯醚甲環唑敏感性較高，其EC50<0.1 mg·L-1；250 g·L-1吡唑醚菌酯、430 g·L-1戊唑醇、質量分數60%唑醚代森聯、250 g·L-1咪鮮胺、質量分數25%咪鮮多菌靈、體積分數22.5%啶氧菌酯、體積分數15%氟硅唑敏感性次之，其0.1 mg·L-1≤EC50<1.0 mg·L-1；質量分數80%克菌丹、500 g·L-1甲基硫菌靈、質量分數40%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽、質量分數75%百菌清、質量分數65%代森鋅敏感性較差，其EC50>20.0 mg·L-1。

病原菌孢子對質量分數80%代森錳鋅、質量分數75%百菌清、質量分數70%代森聯、質量分數80%克菌丹、質量分數60%唑醚代森聯、250 g·L-1吡唑醚菌酯敏感性較高，其EC50<1.0 mg·L-1；250 g·L-1嘧菌酯、體積分數15%氟硅唑、質量分數65%代森鋅、質量分數40%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽、體積分數22.5%啶氧菌酯、質量分數75%肟菌戊唑醇、250 g·L-1咪鮮胺、430 g·L-1戊唑醇、質量分數10%苯醚甲環唑敏感性次之，其0.1 mg·L-1≤EC50<10.0 mg·L-1；質量分數40%腈菌唑、質量分數50%異菌脲、500 g·L-1甲基硫菌靈敏感性差，其EC50≥20.0 mg·L-1(表7)。

表7 病原菌菌絲和孢子對20種藥劑的敏感性

3 結束語

本研究在長春市百花園采集到的羽扇豆病害樣本，經分離純化、致病性測定，再分離得到的結果進一步證實獲得的分離物為致病菌，再通過形態特征和多基因序列分析，確定引起該病害的病原菌為Colletotrichumlupini。

2002年Nirenberg et al.[19]將羽扇豆炭疽病病原菌鑒定為Colletotrichumlupini。2014年美國的Rosskopf et al.[7]首次報道該病害在美國弗羅里達州發生；同年，Han et al.[8]在韓國龍仁市發現該病害并進行了首次報道。2019年江西農業大學的Zou et al.[9]首次報道了國內發生的羽扇豆炭疽病，但這些報道僅對羽扇豆炭疽病的病原菌進行了鑒定、對病害癥狀和病原菌的形態特征進行了描述，但對病原菌的生物學特性及其防治沒有進行研究。本研究從羽扇豆炭疽病分離得到的病原菌與Zou et al.[9]報道的病原菌形態特征一致。本研究還對羽扇豆炭疽病病原菌的生物學特性進行了測定，掌握了病害發生規律，并采用菌絲生長速率法和孢子萌發法進行藥劑敏感性測定，結果表明病原菌菌絲和孢子對質量分數60%唑醚代森聯和250 g·L-1吡唑醚菌酯都具有敏感性，建議生產中可選擇這2種殺菌劑進行防治，有效控制病害發生。