氧化鋯表面結構化對成纖維細胞活力的影響

何新鳳 何新珍

1 暨南大學附屬惠州口腔醫院·惠州口腔醫院，廣東省惠州市 516000；2 惠東縣何新珍口腔診所口腔科

牙齒缺失常見于老年人，不及時治療者可影響咀嚼功能及面部美觀度，嚴重者影響患者正常心理生理功能及日常生活質量。目前，臨床上牙列缺損、缺失者常采用口腔種植技術修復牙齒。隨著口腔醫療技術的發展，口腔種植牙齒的技術發展愈來愈成熟，其在修復效果方面令患者相當滿意。目前，種植體常用材料為鈦，雖獲得臨床醫師廣泛認可接受，但其仍存在弊端，如鈦本身顏色所致牙齦出現色素沉著、影響X線局部組織成像[1]。與鈦相比，氧化鋯等材料針對患者的需求順勢而生，憑借良好的生物相容性、機械性能、結構致密及美學性能等優勢，獲得患者及臨床醫師的廣泛認同[2]。種植成功的關鍵在于兩個方面，一為種植體與骨組織良好的結合，二為種植體與軟組織良好的結合。研究發現[3]，袖口結構有利于種植體與牙槽骨結合，并抑制口腔內免受細菌的侵入，但其如何保障種植體的穩定性及生物學屏障作用仍需深入研究。多項研究證實[4-5]，種植體的基臺穿齦部分與牙齦纖維之間的結合方式可影響人牙齦成纖維細胞(Human gingival fibroblast，HGF)的增殖等生物學活性以及種植體周圍組織的封閉作用，其中HGF對保障種植體與軟組織良好的結合有重要意義，因此筆者就氧化鋯表面結構化對成纖維細胞活力的影響展開報道，旨在為臨床提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 該研究制作12個氧化鋯試件樣品，直徑約為15mm，厚度約為1mm的圓形瓷塊，根據處理方式不同，將其分為對照組(6例)和研究組(6例)。牙齦組織選取我院口腔科2020年1—9月收治的患者，納入標準：(1)均為牙周冠延長術者；(2)患者或家屬知曉且簽署知情同意書；(3)均經本院倫理委員會批準。

1.2 方法 使用電腦設計將氧化鋯試件樣品制作成圓盤狀，直徑約為15mm，厚度約為1mm。其中對照組的氧化鋯試件樣品表面無須處理，保持表面光滑即可；研究組的試件樣品使用精細加工切片系統制作微溝槽，主軸轉速控制為30 000r/min，步進為120μm，切割深度為15μm，切片厚度為60μm。將切除的牙齦組織置于含有3% 雙抗(青霉素 300U/ml，鏈霉素300mg/L，Sigma 公司，美國)的杜氏伊戈爾培養基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM，Gibco BRL公司，美國)中保存備用。將牙齦組織置于杜氏伊戈爾培養基中浸泡3次，并剪成1mm×1mm×1mm的組織塊，最后置入培養皿中。將培養皿置入二氧化碳培養箱(長沙長錦科技有限公司)中恒溫培養2～3h，然后加入含有3% 雙抗培養液，2～3d換培養液，繼續置于二氧化碳培養箱中恒溫培養到細胞生長面積為培養皿總面積的80%～90%，最后進行傳代。將兩組試件樣品分別依次消毒、磷酸鹽緩沖液沖洗3次，并使試件樣品表面干燥，最后將試件置于24孔板中。將4～7代HGF的細胞密度調整為1×105個/孔，并接種于24孔板中，靜置半小時，并加入含有3% 雙抗的培養液。培養6、24、72、120h后，立即取出培養皿并檢測不同時間段HGF增殖情況。

1.3 檢測方法 表面粗糙度測量：對照組的每個試件樣品均采用原子力顯微鏡(Cypher，美國)測量，每個試件隨機測量5個線段，選取6個試件分別進行測量，記錄并取其平均值。靜態接觸角測量：每個試件樣品均采用接觸角測量儀(布魯克， 美國)測量，取1μl去離子水加入試件樣品表面，待液滴穩定后使用接觸角測量儀進行測量，每組測量6個試件樣品，每個試件測量5次，記錄并取其平均值。表面元素百分比測量：對照組的每個時間樣品均使用能量色散X射線分析儀(蔡司，德國)測量表面元素情況。HGF增殖水平檢測：HGF培養6、24、72、120h后，于不同時間點取出測定HGF增殖情況。使用磷酸緩沖液沖洗未黏附的細胞，沖洗3次，取出試件放入新的24孔板中，并加入DMEM培養基及50μl細胞增殖—毒性檢測液。置入二氧化碳培養箱中恒溫培養2h后接種于96孔板中，100μl/孔。使用酶標儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司]測量450nm波長處的吸光值(A值)，每個試件測量3次，記錄并取其平均值。

1.4 觀察指標 (1)分析對照組的表面粗糙度、表面元素百分比以及研究組的溝槽尺寸；(2)比較兩組的靜態接觸角；(3)比較不同時間點的成纖維細胞增殖水平。

1.5 統計學方法 采用SPSS22.0專業統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，并采用t檢驗，P<0.05 評價為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 對照組的表面粗糙度、表面元素百分比以及研究組的溝槽尺寸 對照組的表面粗糙度為(24.62±2.86)nm，表面元素主要為鋯(51.63%)，其余包括氧、碳、鉀等元素；研究組的溝槽寬度為(59.85±0.31)μm，溝槽頂寬度(59.74±0.29)μm，深度(9.93±0.78)μm。

2.2 兩組的靜態接觸角比較 對照組的靜態接觸角為(67.73±5.24)°，明顯高于研究組的(50.75±2.86)°,兩組差異有統計學意義(t=6.967，P=0.000)。

2.3 不同時間點的成纖維細胞增殖水平比較 對照組于6、24、72、120h的成纖維細胞增殖水平明顯低于研究組(P<0.01)，詳情見表1。

表1 不同時間點的成纖維細胞增殖水平比較

3 討論

自口腔種植技術引進應用于臨床，隨著醫療技術的發展，其在種植修復牙齒效果方面逐步扮演重要的角色。近幾年，牙列缺失、缺損者廣泛使用種植修復技術恢復牙齒正常咀嚼功能及牙齒的美觀度。近幾年，興起的氧化鋯材料憑借良好的美觀性能及生物相容性廣泛應用于口腔修復的各個領域。氧化鋯屬于生物惰性材料，具備穩定的化學性能，同時具備類似恒牙釉質的折光系數，可用于前牙變色的牙齒美學修復[6]。氧化鋯作為前景應用最為廣泛的全瓷材料，研究的熱點多傾向于如何保障種植體與軟組織更好的結合。保障良好的軟組織封閉作用，有助于種植體免受微生物等細菌的侵蝕，同時保護種植體與骨組織結合[7]。

研究發現[8]，保障種植體與周圍軟組織良好的結合關鍵在于使HGF可以黏附增殖于氧化鋯種植體表面。影響HGF附著增殖的因素頗多，如表面粗糙度、潤濕性、表面形貌及表面化學成分等因素。既往大多研究認為[9]，光滑表面有利于HGF生長增殖，其實是細胞平行排列生長于光滑表面，并不利于其生長增殖。王麗波等人[10]報道，微粗糙表面通過增加HGF附著的面積，從而有利于HGF細胞黏附增殖；氧化鋯表面經噴砂處理后可產生接觸誘導現象，同時短時間內可以促進細胞黏附，提高HGF的黏附率。鄭苗等人[11]報道，不改變氧化鋯表面粗糙度及表面形態為前提下，通過增加氧化鋯表面潤濕性，可有利于HGF早期黏附增殖。賴穎真等人[12]報道，氧化鋯表面經微溝槽處理后與氧化鋯光滑表面相比，其可增加細胞附著的面積，進而促進HGF黏附增殖。同時微溝槽的結構可誘導細胞沿種植體垂直方向增殖生長，進而有利于軟組織環繞種植體的基臺穿齦部分，從而形成穩定的軟組織邊緣封閉結構。本文結果顯示對照組的表面粗糙度為(24.62±2.86)nm，表面元素主要為鋯、氧，對照組的靜態接觸角明顯高于研究組；表明氧化鋯表面的粗糙度、元素組成及潤濕性與HGF黏附增殖有關，一定程度上來說，氧化鋯表面微粗糙及提高表面潤濕性有利于HGF早期附著增殖；對照組于6、24、72、120h的成纖維細胞增殖水平明顯低于研究組，加以證實氧化鋯表面采取結構化可增加細胞黏附的面積，有利于HGF在氧化鋯表面黏附，其培養時間是否影響HGF生長增殖，仍需深入研究。

綜上所述，氧化鋯表面采取結構化通過增加細胞黏附的面積，有效誘導細胞沿種植體垂直方向生長，有助于形成穩定的軟組織邊緣封閉結構，同時提高HGF黏附增殖能力。