神經病理性疼痛表達譜及核心基因的生物信息學分析*

李宗吉 朱佳佳 李 琳

1 寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏銀川市 750004；2 寧夏醫科大學醫學科學技術中心；3 寧夏回族自治區人民醫院

慢性痛越來越成為危害人類身心健康的重要疾病。據相關研究統計，美國約有1.16億成年人遭受慢性痛的折磨，每年花費在慢性痛上的醫療費用遠遠超出心血管疾病、癌癥和糖尿病三種疾病的總花費，在歐洲每5人就有1人患慢性痛[1-3]。神經病理性疼痛是臨床最常見的慢性疼痛，是指由于傳入神經、脊髓或中樞神經系統等部位受到損傷而引起的疼痛綜合征，多呈難治性，可伴發睡眠障礙、焦慮、抑郁等神經精神疾病，使患者的身心健康及生活質量受到極大影響[4-6]。神經痛的發病機制十分復雜，雖然大量文獻報道免疫、神經遞質、離子通道等參與神經痛的發生、發展的過程，但發病分子機制并不清楚，臨床仍然缺乏理想的治療藥物[7-9]。因此，深入研究神經病理性痛的發病機制具有重要的理論及現實意義。

近幾十年來，隨著高通量測序技術、微陣列芯片技術以及生物信息學技術的快速發展，使研究人員能夠更系統全面地開展疾病相關生物學機制的研究，更有效地確定影響疾病發生、發展、治療和預后的關鍵分子。在本研究中，我們從基因表達綜合數據庫中檢索神經病理性疼痛模型小鼠的芯片檢測數據。隨后分析鑒定了一系列差異表達基因，進一步通過生物信息學技術綜合分析神經病理性疼痛模型小鼠差異表達基因。本研究旨在為神經病理性疼痛提供新的治療靶點和早期診斷標志物，并幫助理解神經性疼痛潛在的神經病理機制。

1 材料和方法

1.1 數據集獲取 在美國國立生物中心(NCBI)的 GEO 數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索并下載神經病理性疼痛mRNA 表達譜芯片數據集GSE89224。該數據集含有9個手術處理的小鼠 (8～12周)和7個假手術對照組小鼠。手術組：小鼠行選擇性神經損傷模型(Spared nerve injury,SNI)，脛神經和腓總神經用5.0絲結扎，遠端切斷，切除2～4mm遠端神經殘端，同時保留腓腸神經完整。假手術組坐骨神經暴露但未結扎。SNI 7d后，L4～5腰椎取損傷同側脊髓背角神經結，進行總RNA提取。基因表達檢測平臺為GPL341(Affymetrix大鼠表達230A陣列)。

1.2 差異表達基因篩選 差異表達基因是通過GEO2R分析從GEO數據庫中獲得的芯片數據，校準后以P<0.05和|logFC|>2.0作為差異表達基因篩選準則。

1.3 差異表達基因生物信息學分析

1.3.1 分子功能及通路富集分析：將預測到的差異表達基因在DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)網站在線進行基因本體論(GO)富集分析，使用Enrichr在線工具(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)進行基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析。

1.3.2 蛋白互作網絡(PPI)構建及核心基因篩選：在string(https://string-db.org/cgi/input.pl)網站在線進行靶基因間的蛋白互作分析；采用 Cytoscape3.6.0 軟件對差異表達蛋白之間的互作關系進行網絡分析，根據蛋白連接度篩選出調控作用網絡中起關鍵作用的核心基因。

1.3.3 相關藥物預測：在DGIdb數據庫(http://dgidb.genome.wustl.edu/)中，預測靶向核心基因的治療藥物，預測結果在cytoscape3.6.0 中可視化。

2 結果

2.1 差異表達基因的鑒定 為確保分析結果的可靠性，我們首先進行數據背景校正和標準化(見圖1)。然后，我們分析篩選發現了121個差異表達基因(120個上調，1個下調)，見表1。

圖1 SNI實驗組與假手術對照組基因表達值箱線圖

表1 SNI小鼠差異表達基因

2.2 GO和KEGG信號通路富集分析 對差異表達基因進行GO功能分析和KEGG信號通路富集分析，GO分析包括生物學過程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)及細胞成分(Cell component，CC)。見表2。

2.3 蛋白互作網絡分析(PPI Network) 在cytoscape中對121個分子進行互作關系可視化分析(見圖2)，并依據分子間的連接度在PPI網絡中篩選出10個核心調控基因。見圖3。

2.4 hub基因—藥物網絡 在DGIdb基因—藥物作用數據庫中，篩查靶向hub調控基因的藥物。黃色節點代表核心基因，綠色節點代表相關藥物。網絡中共有5個核心基因和16種這些基因的靶向藥物。見圖4。

3 討論

本研究中，我們從GEO數據庫下載神經病理性疼痛SNI模型小鼠和假手術對照組小鼠基因表達芯片檢測數據集GSE89224，采用GEO2R篩選差異表達基因共121個，之后進一步生物信息學分析這些差異表達基因的生物學特性并從中構建蛋白互作網絡，篩選出關鍵調控作用的核心基因。GO和KEGG富集分析的結果顯示出這些分子的功能和富集通路都與免疫炎癥相關，以往大量研究也表明，神經損傷后神經細胞免疫功能的激活是引起神經病理性疼痛的主要原因和重要機制之一[10-12]。

在篩選的hub基因中，Ctss、Rac2、Laptm5、Cd53、C1qb、Ptprc、Tyrobp、Csf1r、Ptpn6、Cd68分子在所有白細胞上都有表達，稱為白細胞共同抗原(Leukocyte

表2 GO與KEGG富集分析結果

圖2 121個差異表達基因的分子互作(PPI)網絡圖

圖3 PPI網絡中10個hub基因

圖4 藥物與核心基因作用網絡

common antigen,LCA)。Ptpn6是細胞質中的重要磷酸酶，其最主要的功能是抑制自身免疫病以及IL-1受體依賴、caspase-1非依賴的自身炎癥性疾病的發生，中性粒細胞中特異性刪除Ptpn6會自發IL-1受體依賴的自身免疫性疾病，這說明Ptpn6會抑制IL-1產生和分泌，但是其中的具體機制還不清楚[13]。Tyrobp基因編碼跨膜信號傳導多肽，在其胞質結構域中包含基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)，編碼的蛋白質可能與膜糖蛋白的殺傷細胞抑制受體(KIR)家族相關，并且可以充當激活信號轉導元件，該蛋白可能與Zeta鏈(TCR)相關的蛋白激酶70kDa(ZAP-70)和脾酪氨酸激酶(SYK)結合，并在信號傳導、骨骼建模、腦髓鞘形成和炎癥中發揮作用，該基因內的突變與多囊性脂膜性骨質增生伴有硬化性白質腦病(PLOSL)有關，也被稱為納蘇—哈科拉病。它的特定受體觸發在髓樣細胞2(TREM2)上表達的受體，也會引起PLOSL[14]。Rac2基因編碼RAS超家族成員的鳥苷三磷酸(GTP)代謝蛋白，編碼的蛋白質定位于質膜，在質膜上調節分泌、吞噬和細胞極化等多種過程。這種蛋白的活性也與活性氧的生成有關，該基因突變與中性粒細胞免疫缺陷綜合征有關[15]。Cd68是巨噬細胞最可靠的標記，Cd68表達于以下細胞中：單核細胞、巨噬細胞、粒細胞嗜堿性粒細胞、大淋巴細胞、破骨細胞、肥大細胞[16]。

此外，4個基因(Cd68、Ctss、Laptm5、Cd53)參與了小膠質細胞的活動，多項研究表明激活的小膠質細胞是引發神經病理性疼痛的關鍵因素。Cd68是一種被廣泛應用的生物標記物，用于檢測活化的巨噬細胞或小膠質細胞，其過度表達代表巨噬細胞及小膠質細胞功能表型改變，促炎M1細胞直接誘發神經痛。Ctss和Laptm5都是小膠質細胞中溶酶體相關蛋白[17]。Ctss在維持神經病理性疼痛中的作用已被證實，而Laptm5在神經痛中的作用暫未明確[18]。神經損傷后，細胞表面黏附分子Cd53在小膠質細胞中表達升高，可能與神經損傷后細胞表面黏附分子介導小膠質細胞遷移有關。考慮到在神經病理性疼痛發生的中早期即有小膠質細胞的活化，所鑒定的5個基因有可能成為神經病理性疼痛的早期診斷生物標志物。小膠質細胞有兩個不同的激活狀態，其中M1促炎反應，而M2抑制炎癥反應。M1小膠質細胞釋放促炎或神經毒性因子誘導神經痛，而M2小膠質細胞釋放抗炎因子抑制炎癥，從而減輕神經痛。最近的研究表明，雖然M1和M2小膠質細胞在神經損傷后都被激活，但小膠質細胞隨著神經痛的發展傾向于向M1表型發展。這個或許可以解釋為什么抑制小膠質細胞的激活可以減輕神經痛，而可不管其表型如何[19-21]。因此，調節小膠質細胞極化，抑制M1型小膠質細胞反應，促進M2小膠質細胞的抗炎作用是神經性疼痛的一種有效治療方法。GO和KEGG富集分析也顯示差異表達基因主要集中在免疫系統，包括細胞與受體作用，FcrR介導吞噬、抗原處理和呈遞，自然殺傷細胞介導的細胞毒作用，Th17細胞分化，T細胞受體信號通路等。這些分析結果為我們提供了神經痛發生發展的分子基礎。

我們通過構建神經免疫相關基因的蛋白質互作網絡，并篩選出核心調控基因，對這些分子的深入探索或可闡釋神經痛的分子病理機理及為神經痛的治療提供藥物作用靶點。我們在DGIdb基因—藥物作用數據庫中，篩查靶向核心調控基因的藥物，網絡中共篩出5個核心基因和16種藥物，這些藥物主要作用于調節小膠質細胞的活化和抑制炎癥反應。這些藥物對神經痛的療效還需進一步展開實驗研究。本研究加深了我們對神經病理性疼痛的神經免疫機制的認識，生物信息學篩查出的疾病相關的核心基因可能會成為神經痛早期診斷生物標志物或者藥物治療靶點。后續還需進一步對這些基因在神經痛中的作用和分子機理展開深入的研究，以期早日明確神經病理性疼痛的分子機理并探索有效的治療方法。