沙棘HrTCP轉錄因子家族鑒定及其干旱脅迫下的表達分析

姚 瑩，王 偉，孫永媛，曹金鋒，魏建榮，劉建鳳*

(1 河北大學 生命科學學院，生命科學與綠色發展研究院，河北保定 071002；2 滄州市農林科學院，河北省農作物耐鹽堿評價與遺傳改良重點實驗室，河北滄州 061001)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡頹子科、沙棘屬落葉性灌木或小喬木，其具有耐旱、抗風沙、適應性強的特性，可在鹽堿化或各種惡劣環境下生長良好[1-2]，其根系可有效降低水土流失、改善土壤理化性質[3-4]。此外，沙棘果實、莖和葉等各器官均含有豐富的營養物質和活性物質，尤其果實中含有大量的維生素C，被稱為“維生素C之王”[5-6]。因此，沙棘已發展為中國重要的經濟兼生態型樹種，被廣泛應用于黃土高原植被造林中。目前諸多學者致力于沙棘果實營養價值的開發和利用，但對沙棘自身的抗旱特性研究較少，尤其是響應干旱脅迫的分子機制更是鮮見報道。

TCP蛋白是植物特有轉錄因子家族之一，參與植物的生長發育與逆境響應的調節過程，其家族成員已在不同物種中被陸續鑒定與驗證。TCP基因家族成員均含有一個由59個殘基組成的堿性螺旋-環-螺旋(b-HLH)保守TCP 結構域[7]。在植物進化過程中該基因家族被分為兩類TCP，Ⅰ類(GNCCC)成員也被稱為PCF亞家族，而Ⅱ類成員被進一步細分為CIN和CYC/TB1亞家族[8-9]。現已從番茄(Solanumlycopersicum)、西瓜(Citrulluslanatus)和油菜(Brassicanapus)中分別分離到30、27和39個TCP轉錄因子[10-12]。在不同棉花品種中的TCP轉錄因子家族也隨基因組測序的完成相繼被鑒定并表達[13]。近年來發現TCP轉錄因子除了在植物發育過程中對細胞增殖和側生器官發揮作用外[14-15]，它們還能通過激素信號傳導等過程參與逆境脅迫應答。如過表達OsTCP19后可調節ABI4介導的途徑提高水稻(Oryzasativa)抵御干旱脅迫的能力[16]；在草莓(Fragariavesca)中發現，FvTCPs基因家族成員受脫落酸誘導并在干旱脅迫下差異表達[17]；基于大豆(Glycinemax)干旱脅迫處理下鑒定的差異表達基因，共鑒定了147個轉錄因子，其中發現大豆中GmTCP4轉錄因子通過調節脫落酸和乙烯等植物激素信號，來提高大豆對干旱脅迫的響應能力[18]；此外，在干旱條件下，玉米(Zeamays)不同組織中發現有46個ZmTCP基因均參與了玉米植株對干旱脅迫的響應，其中ZmTCP42過表達導致種子萌發時對ABA產生超敏反應，增強了玉米植株抗旱性[19]。由此可見，TCP轉錄因子基因家族在介導植物抵御非生物脅迫中發揮著重要作用。

綜上，本研究基于實驗室前期沙棘轉錄組數據(PRJNA507906)[20]，獲得沙棘HrTCP轉錄因子基因家族序列，利用生物信息學分析方法對沙棘HrTCP轉錄因子家族成員進行鑒定，并進一步通過qRT-PCR技術分析了關鍵轉錄因子成員在干旱、高鹽脅迫及激素誘導下的表達情況，為明確沙棘HrTCP轉錄因子介導激素信號通路參與抗旱的作用機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 沙棘植株

實驗材料為2～3年生沙棘扦插苗，種植于河北大學實驗基地。該沙棘原始母株是由蒙古沙棘的實生無性系烏蘭格木(Hippophaerhamnoidessubsp.mongolica，母本)與中國沙棘(HippophaerhamnoidesL.subsp.sinensis，父本)雜交獲得的F2代無性系，取自于內蒙古磴口縣中國林業科學研究院沙漠林業實驗中心(40°25.935′N，106°43.442′E)。

1.2 方 法

1.2.1 沙棘HrTCP轉錄因子成員預測從NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gav/)分別獲得擬南芥(Arabidopsisthaliana)、棗(Ziziphusjujuba)和水稻(Oryzasativa)各12個TCP轉錄因子氨基酸序列。從沙棘轉錄組數據獲得22個TCP轉錄因子序列，利用SMART在線軟件對TCP蛋白進行功能結構的預測，去除重復序列和不含TCP保守結構域的蛋白，以棗的TCP成員作為參考對照獲得含有完整開放閱讀框的11個沙棘TCP轉錄因子家族成員，命名為HrTCP2/4/7/8/11/13/15/17/18/19/20。利用ExPASy Proteomics Server (http://expasy.org/)預測所有沙棘HrTCP蛋白的分子量和等電點。

1.2.2 沙棘HrTCP家族的生物信息學利用MEGA6.0軟件，通過Muscle進行序列比對，對上述沙棘11條HrTCPs的氨基酸序列，采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)及默認參數，校驗參數Bootstrap重復500次，構建系統進化樹。利用PlantTFDB edu.cn/)進行同源比對。利用DNAMAN軟件對沙棘HrTCP蛋白進行序列比對。在GSDS2.0在線軟件上(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對沙棘TCP轉錄因子家族進行基因結構分析。用MEME (http:// meme.nbcz.net/meme/)分析沙棘TCP蛋白的保守基序。

1.2.3 沙棘HrTCP轉錄因子家族基因的表達分析選取生長一致的沙棘扦插植株(株高為1.2～1.5 m)，進行以下處理：200 mmol/L NaCl溶液和15% PEG-6000溶液分別均勻噴施在枝條上，于處理后0、1、12和48 h取樣；0.1 mmol/L MeJA溶液和0.1 mmol/L ABA溶液分別均勻噴施在枝條上，于處理后0、1、6和12 h取樣。以上處理均取植株地上部10、70和140 cm處葉片3片混合取樣，3次獨立重復，液氮冷凍后-80 ℃保存。

利用寶生物工程(大連)有限公司的植物總RNA提取試劑盒RNAiso Kit (D326S)提取沙棘葉片的總RNA，并采用UEIris II RT-PCR system for First-Strand cDNA Synthesis (with dsDNase)試劑盒(R2028,US EverbrightInc.)，以總RNA為模板反轉錄合成cDNA。以沙棘泛素基因(HrUbi)為內參基因，使用熒光定量PCR試劑盒(2×Fast Super EvaGreen qPCR Master Mix)進行HrTCPs的基因表達量分析，引物序列信息見表1。qRT-PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 20 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35 個循環，95→65 ℃熔解曲線(0.1 ℃/s)。采用2-ΔΔCt法進行數據分析。

表1 沙棘HrTCPs轉錄因子家族成員定量引物序列Table1 The fluorescent quantitative primers for HrTCP4/7/19/20 and HrUbi

2 結果與分析

2.1 沙棘HrTCPs轉錄因子家族成員序列特征分析

基于沙棘TCP基因家族轉錄組數據，得到22條沙棘HrTCP轉錄本信息(表2)，進一步對轉錄本序列篩選獲得含有完整ORF框的TCP序列，并以棗的TCP基因家族成員信息為參考，最終獲得11條沙棘HrTCP轉錄因子家族序列(表3)。

表2 基于轉錄數據獲得沙棘TCP轉錄因子家族序列Table 2 The sequences of TCP transcription factors based on Hippophae rhamnoides transcriptional data

通過分析發現該家族的11個成員氨基酸序列長度介于218～590之間，編碼蛋白質的相對分子量介于23.44～61.78 kD之間，其中分子量最大的是HrTCP8，最小的是HrTCP11。蛋白質的等電點范圍為6.09～9.72，其中最大為HrTCP7，最小為HrTCP19。此外，對蛋白質的亞細胞定位進行預測，結果表明除了HrTCP13/17/18的定位于細胞質，其余8條均在細胞核(表3)。

表3 沙棘HrTCP基因家族成員序列特征Table 3 Characterization of H.rhamnoides HrTCP gene family

2.2 沙棘HrTCP轉錄因子家族成員進化樹分析

將沙棘11個HrTCP蛋白與擬南芥、水稻和棗TCP蛋白進行系統進化樹分析。結果顯示，沙棘TCP家族成員可分類為I亞族(PCF亞家族：HrTCP7/8/11/15/19/20)和II亞族(CIN亞族：HrTCP2/4/13/17/18)，同時發現沙棘、水稻、棗和擬南芥TCP家族基因呈現明顯的聚類現象。此外，沙棘的每一條HrTCP序列都有與其較高相似度的其他物種序列，如HrTCP20與AtTCP20，HrTCP15與ZjTCP15、OsTCP14，HrTCP17與ZjTCP5等。推測沙棘TCP基因可能與同一分支上其他物種的同源基因具有相似的生物學功能(圖1)。

Hr.沙棘;Os.水稻;At.擬南芥;Zj.棗圖1 沙棘與其他物種TCP轉錄因子家族進化分析Hr.Hippophae rhamnoides;Os.Oryza sativa;At.Arabidopsis thaliana;Zj.Ziziphus jujubaFig.1 A neighbor-joining phylogenetic analysis of TCP transcription factor family in HrTCPs and other plants

2.3 沙棘HrTCP蛋白的保守區域比對

對預測的11個HrTCP轉錄因子的結構域進行分析表明，11個沙棘TCP蛋白均含有一個結合DNA和蛋白互作所必需的TCP結構域，即bHLH結構域，且該結構域參與DNA結合及其二聚化，保守程度高，其堿性區域位于bHLH結構域的N端，PCF亞族成員(HrTCP7/8/11/15/19/20)在基本區域(Basic)缺少4個氨基酸，但均不缺少雙螺旋區的氨基酸(圖2)。

圖2 沙棘TCP蛋白保守結構域比對Fig.2 Alignment of conserved domains of TCP proteins in H.rhamnoides

2.4 沙棘HrTCPX家族蛋白保守基序分析

基于MEME等軟件分析11個沙棘HrTCP家族成員，繪制HrTCP家族成員單獨構建的系統進化樹、序列結構及保守基序信息圖譜(圖3)。HrTCP基因家族單獨構建的進化樹與之前一致，總體上分為PCF亞族和CIN亞族。基因結構分析表明TCP家族11個成員均含有一個外顯子和上/下游結構，但不同成員他們的外顯子的長度及位置具有一定差異。共選取10個motif，并將保守基序分別命名為motif1-motif10。在HrTCP蛋白中每個蛋白均含有不同數量、不同種類的motif，11個蛋白可能含有各自不同的功能特性。其中motif1、motif2和motif3比較典型，motif1存在于所有成員中，motif2僅存在于PCF亞族成員中，motif3僅存在于CIN亞族成員中。HrTCP4和HrTCP7蛋白只含有2個motif；HrTCP15和HrTCP11蛋白含有3個motif；HrTCP19和HrTCP20蛋白含有4個motif；HrTCP8、HrTCP13和HrTCP2蛋白含有5個motif；HrTCP17和HrTCP18蛋白含有6個motif，所含motif數量最多。通過進一步的分析發現，11個HrTCP 蛋白均包含的motif1與TCP蛋白的bHLH結構域序列高度一致。PCF亞族成員中motif1和motif2關聯，CIN家族成員的motif1和motif3關聯。其他motif只在某些TCP蛋白中出現，且無規律性。對每個結構域進行分析發現，motif1含有50個氨基酸且保守性較高。

圖3 沙棘HrTCP轉錄因子家族結構及基序分析Fig.3 Analysis of gene structure and motif of TCP transcription factor family in H.rhamnoides

2.5 參與沙棘抗旱的HrTCPs候選基因篩選

為了進一篩選沙棘中參與抗旱的關鍵基因，我們將沙棘TCP家族11個成員與其他物種參與抗旱的TCP成員進行聚類分析，發現HrTCP4、HrTCP7、HrTCP19和HrTCP20分別于FmTCP4、BpTCP7、OsTCP19和AtTCP20高度同源(圖4)。由此推測HrTCP4/7/19/20可能也具有調控沙棘抵御干旱脅迫的生物學功能。

Hr.沙棘;Os.水稻;At.擬南芥;Bp.白樺;Fm.水曲柳圖4 響應沙棘干旱脅迫的HrTCPs基因篩選Hr.Hippophae rhamnoides;Os.Oryza sativa;At.Arabidopsis thaliana;Bp.Betula platyphylla;Fm.Fraxinus mandshuricaFig.4 The selection of the genes which have responses to drought stress

2.6 干旱和鹽脅迫下HrTCPs的表達分析

本研究采用實時熒光定量qRT-PCR方法，對HrTCP4/7/19/20的表達量進行分析。由圖5可以看出，在PEG處理1 h后HrTCP7/19/20基因表達量分別是對照組表達量的2倍、22倍和24倍，在處理12 h后表達量降低。由此可見，沙棘受到干旱脅迫后HrTCP4/7/19/20的表達量會發生明顯的上調變化，其中HrTCP20反應最為強烈；在NaCl處理后，HrTCP4/7表達量整體呈下降趨勢，而HrTCP19/20呈上升趨勢并在12 h達到峰值，其中HrTCP20表達量上升達到極顯著水平。

2.7 激素處理后HrTCPs基因的表達分析

本研究對ABA和MeJA處理后沙棘HrTCP4/7/19/20的表達量分析發現，ABA處理后，HrTCP4/7/19/20基因在不同處理時期表達量有極大的差異(圖6)。HrTCP4轉錄因子表達量下調且變化不顯著，HrTCP7/19/20轉錄因子對ABA處理反應較為敏感，在處理1 h后表達量最高，分別是對照實驗組的5倍、16倍和12倍，其中HrTCP19對ABA處理的反應最為強烈。MeJA處理后，HrTCP4表達量先上升后趨于平穩，而HrTCP7/19/20表達量升高較為顯著，其中HrTCP20對MeJA處理的表達量升高達到極顯著水平，在處理1 h表達量最高，是對照組表達量的5倍左右。結果表明，HrTCP7/19/20受ABA誘導，HrTCP4/7/19/20受MeJA誘導(圖6)。

*和**分別表示P<0.05、P<0.01；下同圖5 非生物脅迫處理下沙棘HrTCP4/7/19/20基因表達分析* and ** mean P<0.05,P<0.01,the same as belowFig.5 Expression analysis of HrTCP4/7/19/20 in H.rhamnoides under abiotic stresses

圖6 激素處理下沙棘HrTCP4/7/19/20基因表達分析Fig.6 Expression analysis of HrTCP4/7/19/20 in H.rhamnoides under hormone treatments

3 討 論

目前，TCP轉錄因子家族已相繼在擬南芥[21]、棉花[22]、番茄[23]、黃瓜[24]及蘋果[25]等物種中獲得并鑒定，發現該家族在植物生長發育及抵御逆境脅迫中具有重要調控作用。沙棘作為中國重要的經濟兼生態型樹種，其具有抗旱、耐鹽等特性，但其TCP基因家族是否參與沙棘植株抵御逆境的響應還鮮見報道。鑒于此，本研究基于沙棘轉錄組數據，獲得具有完整開放閱讀框的11個TCP轉錄因子，該基因家族的成員數量相對較少，是否還有尚未發現的成員，有待進一步研究。同時發現沙棘HrTCP基因家族的11個成員，均含有b-HLH保守域、N-端堿性氨基酸區和 DNA識別和結合位點，這與DePaolo等的研究結果一致[26]，表明該基因家族的作用方式比較相似。HrTCP蛋白質的亞細胞定位預測，發現有8個蛋白定位于細胞核內，這與茶樹和草莓中TCP家族成員分布情況類似[17,27]，進一步說明了其作為轉錄因子主要在細胞核內發揮調控功能。此外，對沙棘TCP轉錄因子家族進行系統進化樹分析及基序分析發現不同成員含有不同基序，但同亞族的家族成員含有的基序較為一致，該結果與棗TCP基因家族基序分布情況較吻合[28]。由此，我們推測這些基序的存在可能與其相應基因發揮的生物學功能密切相關。

早期研究發現植物中茉莉酸信號突變體具有更好的耐旱性，擬南芥中一類TCPs中AtTCP20可以通過與LOX2啟動子結合調控茉莉酸途徑[29]；水稻OsTCP19基因介導ABI4通路可以提高水稻苗期和成熟期干旱脅迫耐受性[15]；木本植物水曲柳中FmTCP4 響應了寒冷、鹽與干旱等非生物脅迫以及激素信號的誘導[30]；白樺BpTCP7基因啟動子序列含有干旱與低溫響應元件，其在響應干旱和低溫應答過程中起正調控作用[31]。鑒于此，本研究將水稻、水曲柳和白樺中參與抗旱功能的TCP基因與沙棘HrTCPs轉錄因子家族成員進行聚類分析，獲得具同源一致性較高的4個關鍵基因(HrTCP4/7/19/20)，推測沙棘中這幾個關鍵基因可能在干旱脅迫響應中也發揮重要作用。

本研究利用qRT-PCR分析發現，PEG處理條件下，HrTCP4/7/19/20基因的表達量明顯上調，HrTCP20反應最為強烈；NaCl處理條件下，HrTCP19/20表達量上調，而HrTCP4/7的表達量呈下調趨勢，該結果與水稻、水曲柳和白樺樹種等物種中TCP參與抗旱的功能結果一致。本研究中導致HrTCPs基因表達上調的原因可能是由于干旱和鹽脅迫均能對植物產生一定的滲透作用，從而誘導了基因不同程度的表達，但是鹽脅迫過程中會產生離子毒害等現象，從而引起基因在鹽脅迫和干旱脅迫下的表達趨勢不同[32]。此外，ABA和JA信號通路在植物響應干旱脅迫中起著重要作用，非生物脅迫的發生會迅速激活植物體內ABA和JA激素信號通路，使相關基因的轉錄水平發生變化[33]。本研究熒光定量結果顯示，HrTCP4/7/19/20均受到脫落酸和茉莉酸甲酯激素的誘導，該結果與毛竹TCP轉錄因子成員介導ABA信號通路響應干旱脅迫結果一致[34]。另有研究發現擬南芥中miR319靶向的TCP結合LOX2啟動子并激活脂氧合酶的活性，促進JA的生物合成[35]。綜上，TCP轉錄因子家族成員可以參與相關激素的合成來抵御干旱脅迫，本研究結果進一步表明HrTCP4/7/19/20可能在ABA和JA激素介導的干旱脅迫響應中起正調控作用。這些現象為深入解析HrTCP轉錄因子家族的抗旱分子機制提供新的方向。

本研究首次鑒定了沙棘HrTCP轉錄因子家族結構特征，并對該基因家族在干旱、鹽脅迫及激素ABA與JA誘導下的表達模式進行初步分析，發現HrTCPs轉錄因子與非生物脅迫和激素誘導密切相關，尤其沙棘轉錄因子HrTCP20基因是調控沙棘抗旱的關鍵基因，該研究結果為解析沙棘抗逆性分子機制提供理論基礎，同時也為進一步培育沙棘抗逆性品種提供重要的基因資源。