馬鈴薯StCML基因家族鑒定及表達分析

張滿倉，張 超,2，趙 朋，陳 越，陳 勤，盧海彬*

(1 西北農林科技大學 農學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊陵 712100；2 陜西省土地工程建設集團有限責任公司，西安 710753；3 西北農林科技大學 食品科學與工程學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室,陜西楊陵 712100)

植物在生長發育中會受到外界環境的多種脅迫作用，為了適應多變的環境，植物需要對環境信號做出反應，而Ca2+作為信號傳遞的第二信使具有至關重要的作用。當植物受到外界刺激時，會引起Ca2+內流[1-2]，Ca2+信號的強弱和持續時間與刺激的性質有關[3]。鈣感受器可以接收Ca2+信號并將其傳遞至下游[4]。

Ca2+感受器主要有鈣調蛋白(calmodulin,CaM)、類鈣調蛋白(CaM-like protein,CML)、鈣依賴型蛋白激酶 (calcium-dependent protein kinase,CDPK)和類鈣調神經素B (calcineurin B-like protein,CBL)[5]。CML是一類重要的鈣離子感受器,含有數目不等的EF-hand結構域且不具有其他結構域[6]。EF-hand結構由29個氨基酸組成螺旋-環-螺旋(helix-loop-helix)結構，位于中心的12個氨基酸殘基形成一個與Ca2+結合相關的轉環(turn-loop)結構[7-8]。EF-hand結構中的天冬氨酸和谷氨酸與Ca2+結合，具有高度的保守性[9]。CML參與植物生長發育和多種外界脅迫的響應當中，對植物的生長有著重要的作用[10-12]。

目前已在多種植物中發現了CML基因，如擬南芥中鑒定到50個CML基因[13]，水稻中有32個CML基因[14]，番茄含有52個CML基因[15]，大豆含有144個CML基因[16]。已有研究發現在NaCl處理、低溫處理和脫落酸(ABA)處理下都能誘導擬南芥AtCML9基因的表達，其中NaCl對種子萌發的抑制作用主要通過ABA介導[17]。AtCML25可以通過調節K+內流調控擬南芥花粉萌發和花粉管的伸長[18]。AtCML42參與茉莉酸(JA)信號的轉導，使用JA處理Atcml42突變體植株發現產生了更高的Ca2+內流，提高了對根長的抑制效果并且降低了食草性昆蟲的取食,表明AtCML42負調控植物對JA的敏感性，進而提高了植物對草食性昆蟲的抗性。此外，干旱脅迫下Atcml42植株的脫落酸含量升高,這表明AtCML42在干旱脅迫下抑制ABA的生物合成[19]。擬南芥AtCML43基因在根尖中特異表達，在水楊酸(SA)處理后表達量升高，進而調控植物免疫[20]。在番茄中，CML43參與了對丁香假單胞桿菌的免疫反應[21]。水稻類鈣調蛋白基因OsMSR2在低溫、干旱和高溫多種環境脅迫下表達量均強烈上調。OsMSR2轉基因擬南芥對ABA表現出超敏反應，表明OsMSR2通過ABA途徑調控植株對干旱和鹽分脅迫響應[22]。

馬鈴薯作為主要的糧食作物之一，具有種植范圍廣、產量高、營養價值豐富的特點[23-24]。本研究通過對馬鈴薯基因組數據庫的篩選獲得80個StCML基因，利用生物信息學分析了StCML家族基因的系統進化、保守基序、基因結構、基因復制、RNA-seq表達譜、GO富集分析和種間共線性，并檢測了7個基因在低溫、高溫、鹽脅迫和青枯菌侵染下基因的表達量，對StCML表達分析做了初步研究，對后續功能驗證提供了思路，也為研究馬鈴薯StCML基因在生長發育和抗逆作用中的分子機制提供了理論基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料

以馬鈴薯Désirée品種為實驗材料。切取長勢一致的脫毒苗頂芽放于含有MS培養基的組培瓶中，在植物生長箱生長15 d后進行相關實驗。培養條件：溫度22 ℃、光照時間16 h光照/8 h黑暗，相對濕度70%，光照強度10 000 Lx。

1.2 方 法

1.2.1 馬鈴薯StCML基因家族成員鑒定與系統進化分析在馬鈴薯基因組數據庫網站下載蛋白序列(http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/)，在Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org/)下載CML家族的結構域模型文件(EF-hand_1：PF00036、EF-hand_6：PF13405、EF-hand_7：PF13499、EF-hand_8：PF13833)，使用HMMER軟件篩選馬鈴薯蛋白序列中含有EF-hand結構域的序列。將篩選到的蛋白序列在Pfam網站(http://pfam.xfam.org/search)和SMART網站(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行結構域比對。使用Expasy網站(https://web.expasy.org/protparam/)分析StCML蛋白的理化特性。

使用MEGA10.1.7軟件將馬鈴薯StCML和擬南芥AtCML蛋白序列構建系統進化樹。采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)，選用Poisson model，進行1 000次 bootstrap測試,AtCML蛋白序列由文獻獲得[13]。

1.2.2 馬鈴薯StCML染色體定位與基因復制分析在馬鈴薯基因組數據庫網站下載基因的gff文件獲取基因位置信息，使用TBtools軟件[25]繪制染色體定位圖。將序列相似性在70%以上且基因間隔在5個基因以內的基因定義為串聯重復基因；在植物基因組復制數據庫PGDD(http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/)中查找StCML基因的片段復制基因。

1.2.3 馬鈴薯StCML基因保守基序、基因結構與順式作用元件分析在MEME網站(http://meme-suite.org/)在線分析StCML蛋白基序種類及組成。從馬鈴薯基因組數據庫網站下載StCML基因外顯子、內含子和染色體位置數據文件，使用TBtools軟件繪制基因結構圖。選取基因前1 500 bp序列提交到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網站分析順式作用元件，使用GSDD2.0網站(http://gsds.gao-lab.org/index.php)繪圖。

1.2.4 馬鈴薯StCML基因GO富集與種間共線性分析提交StCML的氨基酸序列到Blast2GO軟件(https://www.blast2go.com/)進行GO富集，分析分子功能、生物學過程和細胞組成。

使用perl腳本比對擬南芥AtCML與馬鈴薯StCML間的共線性基因，比對參數設為E≤10-10。

1.2.5 馬鈴薯StCML基因表達模式分析與多種脅迫處理在馬鈴薯基因組數據庫網站下載StCML基因轉錄組測序數據，刪除所有組織和脅迫下FPKM值均小于1的基因，計算Log2值并使用TBtools繪制熱圖。

選取長勢一致的組培苗進行脅迫處理：低溫處理將組培苗放入4 ℃植物生長箱培養6 h；高溫處理組培苗放入35 ℃植物生長箱培養6 h；鹽脅迫處理在超凈工作臺內將組培苗從培養基取出，轉移到含有 150 mmol/L NaCl溶液的組培瓶中(使用dH2O配制并滅菌處理)，放回植物生長箱培養12 h；青枯菌侵染在超凈工作臺內將組培苗從培養基取出，轉移到含有GMI1000菌液(OD600= 0.01)的組培瓶中(使用dH2O配制并滅菌處理)，放回植物生長箱培養12 h。使用未經處理的組培苗作為實驗對照，每個處理有3個生物學重復。低溫、高溫和鹽脅迫處理后，取植物的葉和莖；青枯菌處理后取植物的根系組織，使用液氮速凍后在-80 ℃冰箱保存。使用Thermo RNA提取試劑盒(#K0801)提取馬鈴薯植株RNA,使用艾科瑞逆轉錄試劑盒(AG11711)合成cDNA,使用QuantStudio 7熒光定量儀進行qRT-PCR反應。定量試劑使用Genestar 試劑盒(A301)。反應條件：95 ℃預變性 30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 30s，72 ℃延伸 30 s，40個循環，使用2-ΔΔCT計算基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 StCML基因家族鑒定與系統進化分析

利用CML結構域模型文件，使用HMMER軟件篩選出200個馬鈴薯蛋白序列，在Pfam網站和SMART網站分析序列的結構域，剔除無EF-hand結構的序列和含有其他結構域的序列后剩余97個蛋白，刪除冗余基因和鈣調蛋白基因后鑒定到80個StCML基因(表1)。使用Expasy網站預測蛋白生化特征，發現StCML蛋白的氨基酸數量主要在69～344之間，只有3個StCML蛋白的氨基酸數量大于500，蛋白分子質量主要在8.05～36.52 kD之間，有3個大于56 kD,等電點在3.69～9.48之間，大部分為酸性(88.75%)。

表1 馬鈴薯StCML基因家族序列特征Table 1 Sequence information of StCML genes in potato

為了分析馬鈴薯StCML基因的進化關系，使用相應蛋白質的氨基酸序列構建了系統進化樹(圖1)，包含擬南芥的50個AtCML和馬鈴薯的80個StCML。它們被分為5個亞家族，每組所含蛋白質個數差異不大，分別含有32、24、20、25和29個蛋白，其中馬鈴薯StCML分別為18、12、14、12和24個。StCML和AtCML在5個亞家族中均有分布，StCML數目多于AtCML可能是馬鈴薯作為四倍體植物的基因組復雜性所致。

2.2 StCML染色體定位與基因復制分析

為了確定StCML基因在染色體的分布，在馬鈴薯網站查找了基因位置并繪制染色體定位圖(圖2)。StCML在12條染色體上均有分布，4號染色體最多，含有12個基因，8號染色體最少，只有1個基因，StCML1-4可能由于在染色體gap區域附近未被定位到12條染色體上。

StCML中含有13個串聯復制基因，其中2組在4號染色體，另2組分別在10號和11號染色體。StCML中還含有18個片段復制基因，其中大部分集中在2號染色體，有2對基因均位于2號染色體，5對基因中的1個在2號染色體。由此推測StCML基因家族的擴張是由串聯復制和片段復制共同作用產生的，其中2號染色體是片段復制的重要區域。

薊色為第1亞家族；粉藍色為第2亞家族；粉紅色為第3亞家族；淺紫色為第4亞家族；淺青色為第5亞家族圖1 馬鈴薯與擬南芥CML基因家族系統進化分析The thistle color is the first subfamily;powder blue is the second subfamily;pink is the third subfamily;lavender is the fourth subfamily;and light cyan is the fifth subfamilyFig.1 Phylogenetic relationship of CML genes in Arabidopsis and potato

2.3 StCML基因保守基序、基因結構與順式作用元件分析

CML基因特征為具有EF-hand結構域，使用MEME網站預測StCML基序，結果顯示StCML主要含有5個保守基序(圖3，A)，它們的長度在21～33個氨基酸(表2)。通過查詢Pfam網站發現基序Motif 2、Motif 3、Motif 4屬于EF-hand結構域。所有StCML均含有EF-hand結構域，其中除StCML32、StCML40和StCML70外均含有Motif 2；44個StCMLs中含有Motif 3基序；33個StCMLs含有Motif 4。Motif 2在5個亞家族中廣泛分布，Motif 3和Motif 4主要分布在第1、2和4亞家族中，表明這3個亞家族具有更高的保守性，而不同亞家族間不同的基序結構則可能表明了它們功能的多樣性。

表2 StCML蛋白保守基序信息表Table 2 List of the conserved motifs of StCML proteins

StCML基因結構如圖3，B所示，外顯子數目在1～14個之間，其中大部分基因(61個，76.25%)沒有內含子；5個基因有1個內含子；其余14個基因含有多個內含子。第1、2和第3亞家族基因結構都較為保守，大部分基因均只有1個外顯子，其比例分別為88.99%、91.67%和85.71%。第4和第5亞家族基因結構差異較大，表明StCML基因結構較為復雜。

左側比例尺表示染色體長度，綠色方框表示串聯重復基因，紅色連線表示片段復制基因，染色體藍色線條表示基因密度圖2 StCMLs染色體定位和基因復制The scale on the left provides the relative length of chromosomes,green boxes indicate tandem duplicate genes,red lines indicate segmentally duplicate genes,blue lines on chromosomes indicate gene densityFig.2 Chromosomal location and gene duplication of StCMLs

為了研究StCML基因可能受到的調控機制，將基因起始密碼子前1 500 bp序列提交到PlantCARE網站預測順式作用元件分布，并使用GSDS2.0在線網站繪制順式元件分布圖(圖4)。本研究發現2個與馬鈴薯生長發育相關的順式作用元件：調節晝夜節律元件(circadian)和調控分生組織表達元件(CAT-box)；與5種激素相關的順式作用元件：脫落酸(ABRE)、茉莉酸甲酯(CGTCA-motif)、水楊酸(TCA-element和W-box)、生長素(TGA-element)、乙烯(ERE)；5個脅迫響應的相關順式作用元件：缺氧脅迫(ARE)、機械損傷(WUN-motif)、低溫(MBS)、光照(I-box)和TC-rich repeats反應元件。StCML15啟動子含有的順式作用元件最多，有20個，StCML5啟動子含有順式作用元件最少，只有2個。StCML基因共含有126個ABRE，分布在56個基因中；含有103個ARE，分布在58個基因中；含有97個ERE，分布在52個基因中。響應逆境的相關順式作用元件在所有StCML基因中均有分布。順式作用元件分析表明StCML基因可能參與到了植物生長發育和多種激素及脅迫響應中。

2.4 StCML基因GO富集與種間共線性分析

為了進一步了解StCML蛋白功能，使用Blast2GO軟件進行了GO富集，分析它們在生物學過程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF) 和細胞成分(Cellular component，CC)中的作用(圖5，A)。由GO富集分析發現80個StCML蛋白均具有離子結合能力(ion binding)，這表明了它們可能具有Ca2+結合功能。在生物學過程分析中，發現27個蛋白參與了細胞對刺激的反應(cellular response to stimulus)，除StCML78外，其余26個蛋白(StCML1～3、5、6、22～24、27～29、32、33、43、44、46、50、57、58、66、70、73～76、80)還參與了細胞調節(regulation of cellular process)、細胞通訊(cell communication)和信號轉導(signal transduction)，其中17個蛋白(StCML1、5、22、23、27～29、32、33、43、50、57、70、73～76)還參與了細胞成分的構成(cellular component organization or biogenesis)，并且這17個蛋白在分子功能中具有酶調節活性(enzyme regulator activity)。具有這些功能的StCML主要分布在第1亞家族和第4亞家族。8個蛋白(StCML4、6、7、11、27、46、58、66)參與細胞質(cytoplasm)的構成，它們與StCML30、StCML47和StCML20共11個蛋白參與了細胞器(organelle)和細胞內部結構(intracellular anatomical structure)的構成。根據結果推測StCML在環境刺激下通過接收Ca2+信號參與了細胞調控并且可能參與了細胞多個成分的構成。

繪制AtCML和StCML基因共線性圖發現存在20對共線性基因(圖5，B)，在5個亞家族中均有共線性基因分布。馬鈴薯2號染色體是含共線性基因最多的染色體(7個)；擬南芥3號染色體含共線性基因最多(6個)。StCML15和StCML21均與AtCML45和AtCML46為共線性基因；StCML19與AtCML23和AtCML24為共線性基因；StCML31與AtCML26和AtCML27為共線性基因。AtCML45與StCML15、StCML21和StCML30是共線性基因。其中StCML15、StCML21和StCML31為片段復制基因，AtCML23和AtCML24與AtCML26和AtCML27分別為2對片段復制基因[13]。這表明了馬鈴薯與擬南芥CML基因具有一定的相似性。

2.5 StCML基因表達分析

為了研究StCML基因在馬鈴薯生長發育和脅迫響應下的表達，在馬鈴薯基因組數據庫網站查找StCML基因在不同組織中和多種脅迫下的RNA-seq數據并繪制熱圖(圖6)。共統計了StCML基因在花、葉、葉柄、根、芽、雄蕊、匍匐莖、塊莖、愈傷、花瓣、心皮和萼片中的組織表達，以及植株在鹽(Salt)、熱(Heat)、6-芐氨基嘌呤(BAP)、甘露醇(Mannitol)、脫落酸(ABA)、生長素(IAA)、赤霉素(GA3)、晚疫病菌(P.infestans)、β-氨基丁酸(BABA)和苯并噻二唑(BTH)處理下基因的表達。6個基因(StCML10、24、25、28、47、71)在公共數據庫各個組織中表達量未被檢測到，12個基因(StCML6、10、12、15、20、24、25、26、28、47、71、78)在公共數據庫多種脅迫處理下未被檢測到表達。除去這些表達量極低的基因，其余基因至少在一個組織中表達。特異表達的組織主要有花、葉柄、芽、雄蕊、匍匐莖和塊莖，分別有8、5、7、12、18和4個基因特異表達。StCML基因主要響應鹽、熱、干旱和赤霉素處理，分別有13、10、8和9個基因表達量顯著上調。

2.6 StCML基因多種脅迫響應分析

為了進一步研究StCML基因對非生物脅迫的響應，使用低溫、高溫、鹽和青枯病菌GMI1000處理馬鈴薯材料Désirée進行qRT-PCR檢測StCML基因的表達，選取7個在轉錄組數據中表達量較高且對鹽和熱脅迫有響應的基因(StCML8、11、13、21、39、53、60)作為研究對象(圖7)。結果發現在4種脅迫處理下均有基因響應，且不同基因的表達存在較大差異。與未處理的植株相比，在低溫脅迫下StCML13、StCML21和StCML53表達量分別上調至6.47、6.76和2.47倍；高溫脅迫下StCML11、StCML21和StCML39表達量分別上調至3.43、2.43和6.20倍，StCML8和StCML60下調至0.49和0.29倍；鹽脅迫下StCML21和StCML60表達量上調至8.2倍和4.5倍。青枯菌處理下只有StCML53上調至2.6倍，StCML8、StCML13、StCML21和StCML60分別下調至0.35、0.03、0.04和0.13倍。StCML21在4種處理下均有響應，其他基因也至少在一種處理下表達量有顯著變化，這表明StCML基因在多種環境脅迫中都可能具有作用。

下方比例尺表示蛋白長度(A)和基因長度(B)圖3 StCML基因家族保守基序(A)及基因結構(B)分析The scales below provide the length of proteins (A) and genes (B) respectivelyFig.3 Conserved motif(A)and gene structure(B)analysis of StCML genes

下方比例尺表示基因啟動子長度圖4 StCML啟動子順式作用元件預測The scales below provide the length of promotersFig.4 Predicted cis-elements in StCML promoters

圖5 StCMLs蛋白的GO富集分析(A)及擬南芥和馬鈴薯CMLs共線性分析(B)Fig.5 The information of gene ontology of StCMLs(A) and Orthologous relationship of CML genes in Arabidopsis and potato(B)

圖例表示標準化的FPKM值。紅色表示高表達水平，藍色表示低表達水平圖6 StCML基因在不同組織和器官中的表達譜(A)及多種脅迫下的表達模式(B)Legends represent the normalized FPKM values.Red means high expression level,while blue means low expression levelFig.6 Expression profiles of StCMLs in different tissues and organs (A) and expression patterns under different stresses(B)

不同小寫字母表示基因表達量存在顯著差異(P<0.05)圖7 多種脅迫下StCML基因的相對表達Different lowercase letters indicate significant difference in gene expression (P<0.05)Fig.7 Relative expression levels of StCML genes under different stresses

3 討 論

本研究通過生物信息學方法鑒定到了80個馬鈴薯StCML基因，StCML具有典型的EF-hand結構域，在馬鈴薯12條染色體上均有分布。與擬南芥AtCML構建系統進化樹發現StCML可分為5個亞家族，每個亞家族都有至少12個StCML，分布較為均衡。StCML基因家族中分別含有13個(16.25%)串聯復制基因和18個(22.5%)片段復制基因?；驈椭剖录饕l生在2號染色體。擬南芥中含有11個(22%)串聯復制基因和27個(54%)片段復制基因[13]。相比之下擬南芥中基因復制的比例更高。

馬鈴薯StCML基因中61個(76.25%)基因沒有內含子，與之相似的是擬南芥AtCML基因家族中有37個(74%)基因不含內含子[13]，水稻OsCML基因家族中有24個(75%)基因不含內含子[14]，番茄SlCML基因家族中有31個(59.62%)基因不含內含子[15]。有研究表明無內含子或內含子較少的基因在植物中可以更快地表達，這使得植物可以迅速應對外界刺激[26]，這可能是CML基因快速參與調控的一個原因。

馬鈴薯StCML與擬南芥AtCML具有20對共線性基因，每對共線性基因均在同一亞家族，這表明了StCML同組間基因的保守性。與StCML具有共線性的擬南芥基因已有多個被報道。如與StCML49共線性的AtCML5位于高爾基體，參與內小泡的運輸[27]；與StCML24共線性的AtCML8基因突變體Atcml8在水楊酸和NaCl處理下表達量均上調[28]，并且在抵御丁香假單胞桿菌的侵染中發揮作用[29]；與StCML49共線性的AtCML24和AtCML23共同參與調控植物對光照時間的感知，通過Ca2+信號調節NO的積累，調控植物開花[30]；與StCML15共線性的AtCML46是植物免疫的負調節因子，負調節水楊酸的積累，雙突變體cml46cml47提高了對丁香假單胞桿菌的抗性[31]。

通過馬鈴薯基因組數據庫網站的RNA-seq數據和qRT-PCR實驗發現StCML基因在多種脅迫下均有響應，這與預測到的順式作用元件功能相吻合，但不同基因間的表達具有較大差異。前人研究表明番茄SlCML在低溫、干旱、鹽、脫落酸和乙烯利處理下均有基因響應[15];白菜BrCML在高溫脅迫下38個基因上調，18個基因下調[32]；潘那利番茄SpCML在干旱、鹽和低溫脅迫下根中分別有14、12和21個基因表達量上調，在脫落酸、赤霉素和水楊酸處理下，葉片中分別有24、40和44個基因表達量上調[33]。這些研究表明CML基因在多種脅迫下均有響應，可能參與到多種植物對脅迫的調控作用，也印證了StCML基因功能的多樣性。

本研究鑒定了馬鈴薯StCML基因家族成員，通過生物信息學方法研究了基因的物理特性、家族進化、基因結構、順式作用元件、基因定位和基因復制等方面，并通過qRT-PCR分析了其在多種環境脅迫下的表達。為后續深入研究StCML基因的功能奠定了基礎，也為尋找脅迫調控基因提供了參考。