番茄SlGRAS4基因特征分析和耐熱功能鑒定

朱珍花，蔣芳玲，文軍琴，石瀟瀑，吳翠云，劉 敏，吳 震

(南京農業大學 園藝學院，農業農村部華東地區園藝作物生物學與種質創新重點實驗室，南京 210095)

高溫對植物的生長發育和產量均造成不利影響，為此植物進化形成相應的調節機制和調控網絡。熱激轉錄因子(heat shock transcription factors，Hsfs)和熱激蛋白(heat shock proteins，Hsps)是高溫脅迫響應機制的重要組成部分。Hsfs通過調控自身及靶基因的轉錄水平來響應高溫脅迫[1]。HSP在復原熱激變性蛋白質以及調節蛋白質質量方面起關鍵作用。活性氧(ROS)是高溫脅迫引起的應激信號分子[1]。植物中的ROS水平會影響Hsfs和Hsps的表達，從而對高溫脅迫做出響應[2-3]。ROS信號轉錄因子ZAT10和ZAT12參與高溫逆境調節[4-5]。這些發現表明高溫信號和ROS信號轉導之間是相互關聯的。活性氧(ROS)清除酶是熱激誘導的主要功能蛋白，包括過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸酶(APX)等，它們在高溫脅迫下清除植物體內過量產生的ROS，從而減輕植物遭受的氧化傷害[1,6]。除了Hsf和ZAT兩個轉錄因子家族外，目前報道參與高溫逆境脅迫響應的轉錄因子家族還包括NAC、ERF、WRKY、bZIP和MYB等[7]。

GRAS是植物體內普遍存在的轉錄因子家族，包括3個初始成員GAI(gibberellin-acid insensitive)、RGA(the repressor of GA1-3 mutant)和SCR(scarecrow)，這3個成員的表達產物具有高度的結構和序列相似性，因此GRAS家族就取GAI、RGA、SCR的關鍵字母進行命名[8]。GRAS在植物發育和信號轉導途徑中起關鍵作用，包括芽分生組織狀態維持[9]，腋芽分生組織進化[10]，配子發生[11]，植物鉻信號以及葉綠素a和b信號傳導[12]，植物休眠[13]，赤霉素的生物合成和信號轉導[14]，生長素信號轉導[15]等。GRAS家族基因在植物抵抗非生物脅迫方面也具有重要作用。研究表明，胡楊GRAS家族基因PeSCL7在擬南芥中的過表達株系表現出更好的耐旱性和耐鹽性[16]；過表達OsGRAS23水稻株系的耐旱和抗氧化能力均有增強[17]；葡萄GRAS家族基因VaPAT1在擬南芥中的過表達株系抗旱性、抗冷性和耐鹽性均增強[18]；轉核桃JrGRAS2基因酵母在36 ℃脅迫下表現出更高的生存活性[19]。然而GRAS家族轉錄因子是否參與植物高溫逆境調控還缺少研究，其調控機理更少有報道。

番茄(SolanumlycopersicumL.)是重要的蔬菜作物，因其果實具有很高的營養價值，深受消費者喜愛并在全球范圍內廣泛栽培。番茄喜溫暖，但對高溫敏感。番茄中有53個GRAS家族成員[20]，前人利用轉基因技術鑒定了該家族部分成員在番茄逆境調控中的功能。研究表明，沉默SlGRAS6提高了由丁香假單胞菌引起的番茄細菌性斑點病的發病率[21]；沉默SlGRAS43番茄植株在干旱脅迫下丙二醛含量上升，脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性下降[22]；SlGRAS40過表達株系增強了番茄耐鹽和抗旱能力[23]；SlGRAS7過表達番茄株系表現出更高的抗旱性和耐鹽性[24]。目前，還未見GRAS家族成員基因參與番茄耐熱調控的報道。

在之前研究中，Wen等[25]以醋栗番茄LA2093為材料通過RNA-Seq分析發現SlGRAS4基因在高溫脅迫后顯著誘導表達，推測該基因參與番茄高溫脅迫響應，并且可能在番茄高溫脅迫響應中發揮重要作用。為分析SlGRAS4基因特征，明確其在番茄耐熱中的作用，本研究首先利用生物信息學分析法預測了SlGRAS4生物功能，然后利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測其在逆境脅迫和激素處理下的表達特征，最后利用病毒誘導基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)抑制該基因在番茄植株中的表達，測定高溫處理下相關生理指標和基因表達量變化。鑒定SlGRAS4基因在番茄中的耐熱功能，不僅證明了GRAS基因家族與番茄耐熱之間的聯系，而且豐富了番茄耐高溫調控機制。

1 材料和方法

1.1 植物材料和培養條件

試驗材料為醋栗番茄LA2093(SolanumpimpinellifoliumL.)，種子由南京農業大學蔬菜生理生態實驗室提供。番茄種子經過浸泡和催芽處理后播種于基質配比為泥炭∶蛭石∶珍珠巖(V∶V∶V)=2∶1∶1的72孔穴盤中，并放置在光培箱中培養(東南儀器，RDN-560E-4，中國)，生長條件為溫度25 ℃/18 ℃(晝/夜)、光周期14 h/10 h(晝/夜)、光合有效輻射為360 μmol·m-2·s-1、相對濕度75%，沉默植株侵染后溫度調整為22 ℃/18 ℃(晝/夜)。當第2片真葉完全展開后，將生長一致的幼苗移栽到32孔穴盤中，其中不同脅迫和激素處理的番茄幼苗經過洗根后移栽至無土栽培基質[蛭石∶珍珠巖(V∶V)=1∶1]中，試驗材料均澆1倍的田園式營養液。

1.2 方 法

1.2.1SlGRAS4生物信息學分析利用在線網站Gene Structure Display Server 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)比對SlGRAS4基因組DNA和全長cDNA，得到內含子外顯子結構圖。SlGRAS4蛋白質的分子量、等電點等通過在線計算工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)獲得。SlGRAS4蛋白結構域分析結果利用在線網站InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)獲取。利用PlantCare數據庫(http://bioinformatics.Psb.Ugent.be/webtools/plantcare/html/)對SlGRAS4基因起始密碼子上游2 000 bp啟動子區序列進行分析。利用NCBI數據庫中的Blastp同源比對工具，搜索并下載SlGRAS4同源蛋白序列。利用DNAMAN8對SlGRAS4及其同源蛋白進行比對分析，構建簡單進化樹。通過在線工具MEME(http://meme-suite.org/took/meme)獲得SlGRAS4及其同源蛋白保守基序。

1.2.2SlGRAS4在不同脅迫和激素處理下的表達分析LA2093生長至5葉1心時進行不同脅迫和激素處理。對照為蒸餾水2 L；PEG6000模擬缺水脅迫處理：蒸餾水2 L +20% PEG6000；NaCl模擬鹽脅迫處理：2 L蒸餾水+200 mmol/L NaCl；ABA處理：2 L蒸餾水+200 μmol/L ABA；SA處理：2 L蒸餾水+200 μmol/L SA。分別在處理0、4、8和12 h后取番茄幼苗自頂部向下數第2片完全展開真葉，每個時間點3次生物學重復，每個重復取2株混樣，每次取樣后的植株不再用于重復取樣，取樣后利用液氮速凍并保存至-80 ℃超低溫冰箱。

利用Trizol 試劑盒(Invitrogen，美國)提取各樣品總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣本完整性，NanoDrop 2000紫外可見分光光度計測定其濃度及純度。利用5×All-In-One RT MasterMix反轉錄試劑盒(Abm，加拿大)完成 cDNA 合成和純化。SlGRAS4的qPCR引物(表1)引用于qPrimerDB數據庫(https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/)。利用TOROGreen?qPCR Master Mix 試劑盒(Toroivd，英國)在Quantstudio3實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)上按說明進行PCR試驗。反應體系：5 μLTOROGreen?qPCR Master Mix，1 μL cDNA模板，上下游引物各0.4 μL，3.2 μL ddH2O。反應程序：95 ℃預變性60 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，40個循環。進行熔解曲線分析，范圍為60～95 ℃，以驗證每個引物對擴增特異性。Actin作為內參基因，通過2-ΔΔCT計算SlGRAS4基因相對表達量。

1.2.3 VSlGRAS4植株獲取利用Sol Genomics Network(https://solgenomics.net/)中VIGS Tool工具選取SlGRAS4基因CDS區500 bp序列作為沉默片段，利用諾唯贊公司(南京，中國)CE Design V1.04軟件單片段克隆法設計正反向5′端引入線性化載體兩末端同源序列的引物(表1)，以LA2093葉片的cDNA為模板克隆該沉默片段并測序。用限制性內切酶XbaⅠ-HF和KpnⅠ(NEB，中國)將TRV2載體線性化，利用同源重組試劑盒Clone Express Ⅱ One Step Cloning Kit(諾唯贊，南京)將其與測序結果正確的SlGRAS4沉默序列連接，并轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，菌落經PCR鑒定后，進一步測序獲得正確陽性克隆。提取陽性克隆中的質粒轉化農桿菌GV3101，即得到陽性工程菌。分別將農桿菌pTRV1、pTRV2、pTRV2-SlGRAS4單菌落擴大培養并重懸于滲透緩沖液(10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES、200 μmol·L-1AS，pH5.6)中，調節緩沖液中菌液OD600為1.0，室溫黑暗靜置3 h。將含有pTRV1農桿菌的滲透液分別與含有pTRV2、pTRV2-SlGRAS4農桿菌的滲透液按1∶1比例混合配置成侵染液。待醋栗番茄LA2093幼苗第1片真葉顯現時，用1 mL注射器將配置好的侵染液注射到番茄子葉中。其中pTRV1農桿菌和pTRV2農桿菌混合侵染植株作為對照植株(V-empty，Ve)，pTRV1農桿菌和pTRV2-SlGRAS4農桿菌混合侵染植株作為沉默植株(VSlGRAS4)，并于接種第20天取第2片葉檢測SlGRAS4的表達量。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.4 VSlGRAS4植株耐高溫能力鑒定Ve植株和VSlGRAS4植株生長至5葉1心時，對其進行高溫(40 ℃/40 ℃，晝/夜)處理和相關指標測定。在高溫處理0、12、24 h時，從上往下數取第3片葉測定過氧化氫(H2O2)含量和光系統Ⅱ最大光化學量子產量(Fv/Fm)，取第4片葉測定電導率(REL)；在高溫處理0、4、8 h時，從上往下數取第2片葉測定基因表達量，取第3片葉測定SOD、POD、APX活性。REL和Fv/Fm測定使用新鮮樣品，其他樣品取樣后立即用液氮速凍并儲存在-80 ℃超低溫冰箱。各項指標測定均≥3次生物學重復，每個重復取2株混樣，每次取樣后的植株不再用于重復取樣。

REL的測定參照Cao等報道的方法[26]；Fv/Fm利用便攜式熒光儀測量；H2O2含量測定參照Uchida等報道的方法[27]。SOD、POD和APX活性測定參照Beyer和Nakano等報道的方法[28-29]。

1.2.5 VSlGRAS4植株高溫和ROS信號應答基因表達量分析將樣品從超低溫冰箱中取出，參考1.2.2 方法完成總RNA提取和反轉錄，Actin作為內參基因，高溫信號應答基因HsfA1a、HsfA1b、Hsp90和ROS信號應答基因ZAT10、ZAT12、CuZnSOD、FeSOD、CAT、APX1、APX2定量引物引用于qPrimerDB數據庫(表1)。利用上述相同PCR體系和程序完成試驗，通過2-ΔΔCT法計算各基因的相對表達量。

1.3 數據處理

測定結果均為3次生物學重復的平均值±SE。利用SPSS(25.0)統計軟件進行方差分析和差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 SlGRAS4生物信息學分析

為研究SlGRAS4基因特征和生物功能，本研究對SlGRAS4進行了生物信息學分析。SlGRAS4前體mRNA通過不同的剪接方式產生兩條成熟mRNA。mRNA1沒有內含子，CDS長度為2 000 bp；mRNA2在5′非翻譯區(5′-UTR)區有一個內含子，CDS長度為1 928 bp，mRNA2是與mRNA1編碼序列完全相同的一段序列(圖1，A)，因此本研究僅對mRNA1編碼蛋白進行生物信息學分析。SlGRAS4蛋白長度為666 aa，分子量為75 737.72 Da，理論等電點為6.31，含有GRAS轉錄因子家族典型的結構域，主要集中在C末端的277～657 aa之間(圖1，B)。利用PlantCare數據庫檢測到SlGRAS4啟動子區域的多種逆境響應元件，包括脫落酸響應元件ABRE，茉莉酸響應元件CGTCA-motif、TGACG-motif，傷口響應元件WUN-motif等(圖1，C)。利用NCBI查找SlGRAS4同源蛋白序列，發現SlGRAS4與煙草NtGRAS1(Nicotianatabacum)、麻風樹JcGRAS05(jatrophacurcas)、楊樹PtSCL14(Populus)、擬南芥AtSCL14(Arabidopsisthaliana)蛋白具有相似性，其中與NtGRAS1蛋白親緣關系最近，同源序列主要集中在C端，包含3個保守基序(conserved motif)(圖2，A-C)，由此推測SlGRAS4可能與其同源基因具有相似的生物功能。

2.2 SlGRAS4在不同逆境脅迫和激素處理下的表達分析

為了探究SlGRAS4非生物脅迫響應功能，本研究分析了SlGRAS4在不同非生物脅迫和激素處理下的表達水平。在高溫、低溫、干旱和鹽脅迫以及ABA和SA激素處理下，SlGRAS4均被誘導表達。SlGRAS4在高溫、低溫、鹽和干旱脅迫處理12 h內表達量不斷上升，且在處理12 h時表達量升至最高，分別增加到對照的8.86、4.86、55.38和7.63倍。SlGRAS4在ABA和SA激素處理12 h內表達量先上升后下降，且在處理8 h時表達量達到峰值，分別增加到對照的120.72和3.55倍(圖3)。這說明SlGRAS4可能參與了多種非生物脅迫響應和激素信號傳導。

圖3 SlGRAS4在不同非生物脅迫和激素處理下表達分析Fig.3 Expression analysis of SlGRAS4 gene under different abiotic stress and hormone treatments

2.3 沉默SlGRAS4降低了番茄耐高溫脅迫能力

PCR擴增條帶和大腸桿菌菌落PCR鑒定結果均為500 bp左右，與目標SlGRAS4沉默片段(527 bp)大小相一致(圖4，A)，經測序確認正確并進行特異性分析后獲得陽性工程菌。取7株五葉一心的VSlGRAS4植株進行沉默效率檢測，相對于Ve植株，VSlGRAS4植株中SlGRAS4表達量均有不同程度的下降，下降范圍在34%～82%之間(圖4，B)，這說明SlGRAS4基因被有效沉默。

為了研究沉默SlGRAS4基因對番茄耐高溫脅迫能力的影響，本研究檢測了高溫脅迫下VSlGRAS4和Ve植株表型以及生理指標變化。取VSlGRAS4和Ve植株各8株進行表型差異分析，分別在高溫處理前和二者表型出現差異時拍照記錄。高溫處理36 h時，Ve植株正常生長，VSlGRAS4植株葉片高度聚攏，部分葉片出現萎蔫，表現出高溫傷害癥狀(圖5，A)。VSlGRAS4和Ve植株的各項生理指標在正常溫度下均無顯著性差異(圖5，B-G)。高溫處理12 h時，VSlGRAS4植株REL和H2O2含量顯著高于Ve植株(圖5，B、C)。在高溫處理24 h內，隨著處理時間的延長，VSlGRAS4和Ve植株的Fv/Fm均下降，且在處理12和24 h時，VSlGRAS4植株Fv/Fm分別下降為Ve植株的95.27%和46.76%(圖5，D)。高溫處理8 h時，VSlGRAS4植株SOD和POD活性相對于Ve植株顯著降低(圖5，E、F)；高溫處理下，VSlGRAS4植株APX活性相對于Ve植株降低，但差異性不顯著(圖5，G)。這些結果均表明SlGRAS4提高了番茄耐高溫脅迫能力。

A.內含子外顯子結構；B.編碼蛋白結構域；C.啟動子區順式作用元件；標尺在圖A和B中分別代表mRNA和蛋白長度，在圖C中代表順式元件在啟動子區域位置圖1 SlGRAS4基因特征分析A.Intron and exon structure;B.Coding protein domain;C.Cis-acting elements in the promoter region The ruler represents the length of the mRNA and protein in Fig.A and B,and represents the position of the cis-element in the promoter region in Fig.CFig.1 SlGRAS4 gene characteristic analysis

A.多序列比對；B.蛋白進化樹，標尺表示遺傳距離，數值表示從1 000次重復計算得到的 Bootstrap；C.保守基序圖2 SlGRAS4蛋白同源性分析A.Multiple sequence alignment;B.Protein homology tree,the scale represents the genetic distance,the value represents the percentage of Bootstrap obtained from 1 000 repetitions;C.Conserved motif;Fig.2 SlGRAS4 protein homology analysis

2.4 沉默SlGRAS4降低了番茄高溫和ROS信號應答基因表達水平

為了揭示SlGRAS4轉錄因子調控番茄耐高溫脅迫可能的分子機制，對高溫和ROS信號應答基因的表達水平進行了檢測。正常溫度下，高溫信號轉導關鍵基因HsfA1a、HsfA1b和Hsp90表達量在VSlGRAS4和Ve植株中無顯著性差異(圖6，A-C)，高溫處理后表達量顯著上調。VSlGRAS4植株中的HsfA1b表達量在高溫處理8 h時顯著低于Ve植株(圖6，B)，Hsp90表達量在高溫處理4 h時顯著低于Ve植株(圖6，C)，這說明高溫脅迫下SlGRAS4基因沉默影響了正常的高溫信號轉導。正常溫度下，ROS信號轉導相關基因ZAT10和ZAT12的表達量在VSlGRAS4和Ve植株中無顯著性差異，在高溫處理4和8 h時，ZAT10和ZAT12在VSlGRAS4植株中的表達量均顯著低于Ve植株(圖6，D、E)，這說明高溫脅迫下SlGRAS4基因沉默影響正常的ROS信號轉導。ROS清除酶編碼基因(包括CuZnSOD、FeSOD、CAT、APX1和APX2)是ROS信號的主要應答基因，在正常溫度下，這些基因表達量在VSlGRAS4和Ve植株中無顯著性差異。CuZnSOD、FeSOD、CAT和APX2表達量于高溫處理8 h內，在VSlGRAS4和Ve植株中不斷上升，且在處理8 h時表現為VSlGRAS4植株顯著低于Ve植株；在高溫處理4 h時，APX1在VSlGRAS4植株中表達量顯著低于Ve植株(圖6，F-J)。說明高溫脅迫下沉默SlGRAS4基因可以通過降低ROS清除酶編碼基因的表達量來降低番茄耐熱性。

VSlGRAS4.沉默SlGRAS4基因番茄植株；Ve.對照番茄植株(V-empty)；A.瓊脂糖凝膠電泳鑒定(M.DL2000；1.PCR 擴增結果；2.大腸桿菌菌落PCR結果)；B.SlGRAS4基因qRT-PCR結果，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖4 VSlGRAS4植株的鑒定VSlGRAS4.SlGRAS4-silencing tomato plants;Ve.Control plants (V-empty);A.Agarose gel electrophoresis identification(M.DL2000;1.PCR amplification results;2.E.coli colony PCR results);B.qRT-PCR qualitative analysis of SlGRAS4 gene,different letters are significant at 0.05 levelFig.4 Identification of VSlGRAS4 plants

VSlGRAS4.沉默SlGRAS4基因番茄植株；Ve.對照番茄植株(V-empty)；星號表示在Student’s t test檢驗中，Ve與VSlGRAS4的差異顯著性，*代表P<0.05，**代表 P <0.01，***代表 P <0.001，下同圖5 SlGRAS4對番茄耐高溫(40 ℃/40 ℃，晝/夜)脅迫能力的影響VSlGRAS4.SlGRAS4-silencing tomato plants;Ve.Control plants (V-empty)；Asterisks indicate significant differences between VSlGRAS4 and Ve with Student’s t test,* represents P <0.05,** represents P <0.01,and *** represents P <0.001;the same as belowFig.5 Effects of SlGRAS4 silencing on tomato heat tolerance (40 ℃/40 ℃,day/night)

圖6 高溫和ROS信號應答基因的表達分析Fig.6 Expression levels of response genes involved in heat and ROS signaling

3 討 論

3.1 SlGRAS4參與番茄對逆境脅迫的響應

前人研究表明，SlGRAS4和AtSCL14屬于GRAS基因家族中SCL9亞家族分支成員[20]，過表達AtSCL14通過增強β-CCA介導的保護性逆行反應降低有毒過氧化物和羰基化合物的水平，提高擬南芥對干旱脅迫耐受性，降低嫩葉組織對高光脅迫的敏感性[30-31]。序列比對和進化樹分析發現SlGRAS4與AtSCL14具有相同保守基序和較近親緣關系，這表明SlGRAS4可能具有與AtSCL14相似參與調控干旱和高光脅迫的生物功能。研究表明轉錄因子在響應不同脅迫時具有顯著的重疊和交叉性[32]。本研究中，在高溫和低溫脅迫以及ABA和SA激素處理下，SlGRAS4同時被顯著誘導表達，而干旱和鹽脅迫處理下，SlGRAS4被顯著誘導表達則發生在之后，并且本研究中在SlGRAS4啟動子區域預測到ABA和SA響應元件，推測SlGRAS4可能通過ABA和SA依賴型脅迫應答途徑交叉響應4種逆境脅迫，此外，SlGRAS4可能還通過其他途徑參與番茄對溫度脅迫的響應。這些結果均表明SlGRAS4參與番茄對逆境脅迫響應。

3.2 SlGRAS4可以提高番茄耐高溫脅迫能力

Huang等[20]和牛義嶺等[22]通過全基因組分析均在番茄中鑒定出53個SlGRAS轉錄因子，并分析了這些轉錄因子的基因與蛋白結構、進化關系以及在番茄不同組織和非生物脅迫處理下的表達模式。其中，Huang等[20]發現53個SlGRAS基因中有30 個在高溫脅迫下顯著誘導表達，且SlGRAS4在高溫處理下的表達量較高，相比對照上調了30倍。本實驗室通過轉錄組測序也發現SlGRAS4在高溫脅迫下顯著上調表達，但SlGRAS成員均未做耐熱功能鑒定。因此，本研究選取對高溫脅迫較為敏感的SlGRAS4利用VIGS技術進行耐熱功能鑒定。本研究發現VSlGRAS4植株相對于Ve植株在高溫脅迫下更容易萎蔫，Fv/Fm以及SOD和POD抗氧化酶活性顯著降低，REL和H2O2含量顯著升高，這說明在高溫脅迫下沉默SlGRAS4使番茄植株細胞膜氧化損傷加重，光合能力降低，ROS清除酶活性減弱。前人研究表明VaPAT1擬南芥轉基因株系在鹽脅迫下的黃化程度和干旱脅迫下的萎蔫程度均顯著輕于野生型株系[18]。轉ZmSCL7煙草在鹽脅迫下與對照相比Fv/Fm和葉綠素含量上升，丙二醛含量下降[33]。過表達SlGRAS7番茄株系在干旱和鹽脅迫下的SOD、CAT和APX 活性顯著高于野生型株系[23]。過表達VaPAT1擬南芥株系在鹽和干旱脅迫下POD活性顯著高于野生型株系[18]。這與本研究結果一致，說明SlGRAS4在高溫脅迫下通過增強光合和抗氧化能力來提高番茄耐高溫脅迫能力。

3.3 SlGRAS4可以通過調控高溫和ROS應答基因表達來影響番茄耐熱性

植物在高溫脅迫下會激發體內的多個信號通路，這些信號應答基因形成復雜的調控網絡來調控植物對高溫脅迫耐受性。本研究VSlGRAS4植株中高溫信號應答關鍵基因HsfA1b以及ROS信號應答基因ZAT10和ZAT12表達水平均顯著低于Ve植株，表明SlGRAS4轉錄因子可以通過調控高溫和ROS信號轉導來影響番茄耐熱性。ROS清除酶是熱激響應性轉錄因子的靶基因，高溫脅迫下植物通過轉錄因子來調節ROS清除酶編碼基因的表達水平。研究表明，逆境脅迫下擬南芥中GRAS家族成員DELLAs通過提高ROS去氧化酶編碼基因CuZnSOD和FeSOD的表達，使ROS處于較低水平，延緩細胞死亡[34]。過表達OsGRAS23水稻株系在干旱脅迫下POD和GST表達量相對于野生株系顯著上調[17]。過表達SlGRAS40番茄株系在干旱和鹽脅迫下ROS清除酶編碼基因APX、CAT、SOD、POD表達量均顯著高于野生型株系[23]。前人通過ChIP-seq和酵母單雜實驗證明ROS清除酶包括POD、APX和谷胱甘肽轉移酶(GST)編碼基因是番茄SlGRAS4轉錄因子的靶基因，它們的啟動子被SlGRAS4高度激活[35]。本研究檢測了ROS清除酶編碼基因的表達量，發現VSlGRAS4植株中CuZnSOD、FeSOD、APX1、APX2、CAT表達量顯著低于Ve植株，說明SlGRAS4轉錄因子可以通過提高ROS清除酶編碼基因的表達來增強番茄耐熱性。

本研究為了解GRAS類轉錄因子特征和功能提供信息，同時對研究番茄耐熱遺傳育種有重要的理論意義。目前通過VIGS僅證明了SlGRAS4正向調控番茄耐高溫脅迫響應，然而SlGRAS4是否依賴激素信號轉導途徑，以及與高溫和ROS信號轉導間的聯系都不清楚，因此后續將深入研究SlGRAS4耐高溫脅迫調控機制。