microRNA-29a通過PI3K/AKT/mTOR信號途徑抑制子宮內膜癌的發生①

王彩霞 夏 敏 王 潔 喬世聰 萬 丹 姚 瑤（重慶市中醫院婦科，重慶400021）

子宮內膜癌（endometrial carcinoma，EC）是一種常見的婦科惡性腫瘤，約占女性生殖系統惡性腫瘤的1/3［1］。近年來，隨著人們生活方式及飲食結構的改變，EC的發病率在世界范圍內呈上升趨勢，且發病年齡日趨年輕化，有研究報道5%至10%的EC患者年齡在45歲或以下［2］。而臨床治療方面，早期診斷的EC患者可進行單獨手術治療和（或）輔助化療或放療的聯合治療［3］；而中晚期EC患者的治療方法包括根治性子宮切除術、雙側輸卵管卵巢切除術、腹腔淋巴結消掃術，并根據疾病的分級及分期再進行化療或放療［4］。故EC嚴重威脅女性的生殖及生命健康。但迄今為止EC的發病原因尚未完全闡明，因此積極深入地從基因、分子層面探索其病因及發病機制對尋找及研發有效治療EC的靶向藥物具有重要意義。microRNA（miRNA）是一類由19～25個核苷酸組成的短鏈非編碼小RNA分子，可通過與目的基因的3′非翻譯區（3′UTR）進行配對結合，并對后者的mRNA進行降解或抑制其翻譯，從而參與調控細胞的增殖、凋亡和侵襲等生物學行為，并在腫瘤的發生發展中起著重要的調節作用［5-6］。近年來，有研究表明microRNA與EC的發生、發展、侵襲及轉移等過程密切相關［7-8］。miR-29a位于染色體7q32.3上，是mi-29家族最新發現的成員之一。有學者報道在黑色素瘤中，miR-29a能通過NF-κB及Wnt/β-catenin信號通路調控BMI1基因的表達從而抑制黑色瘤細胞的生長、遷移及侵襲功能，從而發揮抑癌基因的作用［9］。在前列腺癌中，閻成全等［10］應用基因芯片檢測發現miR-29a在腫瘤組織中的表達顯著降低，進一步研究發現miR-29a可能通過抑制前列腺癌細胞中賴氨酸特異性去甲基化酶4B（KDM4B）的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長并誘導其發生凋亡。但miR-29a在EC中的報道還十分罕見，有待進一步探究。本研究分別從基因芯片，生物信息學及細胞生物學技術方面探索miR-29a在EC發生發展中的生物學功能及相關機制，從而為尋求新的子宮內膜癌的靶向治療藥物提供實驗室基礎及理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本 選取2018年4月至2019年4月于重慶市中醫院住院接受手術治療，且術后病理確診為EC的15例患者（EC組），其平均年齡（53.3±2.7）歲。對照組為同期在我院住院因子宮肌瘤切除子宮，經病理證實為正常子宮內膜的15例患者（normal組），其平均年齡（54.1±6.9）歲。兩組患者的年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。用于提取RNA的子宮內膜組織在離體后迅速置于液氮中保存。所有受試對象術前均未接受任何放療、化療及激素治療且無內分泌、免疫、代謝性等疾病。本研究經醫院倫理委員會審批，患者及家屬知情同意并簽署相關知情同意書。

1.1.2 細胞系及試劑 子宮內膜癌細胞系HEC-1A細胞購于中國科學院上海細胞庫；胎牛血清（FBS）、DMEM/F12、Opti-MEM購自Gibco公司；Trizol、Lipofectamine2000、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自Invitrogen公司；逆轉錄與實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒、基質膠購自BD公司；MTT試劑盒、青鏈霉素混合液（均為100 U/ml）購自Sigma公司；miR-29a mimic、miR-29a inhibitor及對應的陰性對照隨機序列（mimic-scramble及inhibitor-scramble）、PI3K野生型（WT）及突變型（MUT）熒光素酶報告基因質粒購自上海吉瑪；熒光酶檢測試劑盒購自Promega公司；Transwell小室（孔徑8μm）購自Millipore公司；PI3K、p-AKT、mTOR抗體、GAPDH購自Abcam公司；實時熒光定量PCR引物購自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片技術篩選差異表達miRNA 參考相關文獻［11］選取3對EC組與對照組內膜組織中的RNA，委托北京博奧生物公司進行檢測以篩選差異表達miRNA，簡述如下：按照miRNeasy Mini Kit試劑盒使用說明從3對受試者的內膜組織中提取等量的總RNA進行純化。分光光度計檢測RNA純度與濃度后，每個樣本取1μg的RNA并按照Hy3/Hy5 Power Labeling Kit說明對RNA樣本進行標記。將上述標記后的RNA與miRCURYTMLNA Array進行雜交，再采用GenePix 4000B芯片掃描儀讀取芯片的原始信號強度。然后通過芯數據的標準化校正后，統計學顯著性檢驗與聚類分析篩選獲得在EC內膜組織樣品與正常對照組樣品中具有顯著差異表達的miRNA譜，并以熱圖的形式展出。其中篩選標準為表達上調或下調倍數變化值≥2.0的miRNA分子。

1.2.2 細胞培養、轉染及分組 HEC-1A細胞常規復蘇后用含有10%FBS與1%青鏈霉素的DMEM/F12培養液培養，置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中，待細胞生長融合至70%～80%時用0.25%的胰酶進行消化，室溫下800 r/min離心5 min，棄上清，DMEM/F12培養基重懸后進行傳代。轉染前一天，將處于對數生長期的HEC-1A細胞常規消化后接種于24孔細胞培養板中，調整細胞密度至2×105個/孔，置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養過夜。參考文獻［12］進行脂質體瞬時轉染，簡述如下：將DMEM/F12培養基更換為Opti-MEM培養液，并根據脂質體Lipofectamine 2000說明書分別將miR-29a mimic、in?hibitor、mimic-scramble和inhibitor-scramble，按終濃度50 nmol/L轉染入HEC-1A細胞內。并將細胞分為：miR-29a過表達組，即轉染miR-29a mimic組；mimic-scramble組，即轉染miR-29a mimic陰性對照隨機序列；miR-29a抑制組，即miR-29a inhibitor組；inhibitor-scramble組，即轉染miR-29a inhibitor陰性對照隨機序列；正常對照組即為無任何處理的HEC-1A細胞。于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養6 h后更換為含10%FBS的DMEM/F12常規培養液。收集轉染48 h后的細胞用于后續實驗研究。

1.2.3 MTT細胞增殖實驗 參考文獻［13］進行MTT細胞增殖實驗，簡述如下：取處于對數生長期的細胞，細胞常規消化后接種于96孔板中，調整細胞密度至1×104個/孔，并向每孔加入200μl含10%FBS和1%青鏈霉素的DMEM/F12培養液。置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中進行培養，分別于12、24、48、72 h向每孔加入5 mg/ml的MTT試劑20μl后，于培養箱中繼續培養4 h，棄除原培養液后，每孔加入150μl的二甲基亞砜（DMSO）溶液，室溫下振蕩10 min使形成的紫色甲瓚結晶充分溶解。酶標儀490 nm檢測每孔吸光度值（A490）。根據公式：（正常對照組A490-實驗組A490）/正常對照組A490，計算并分析各組細胞的增殖率。每組設定5個復孔，實驗單獨重復3次。

1.2.4 Transwell細胞侵襲實驗 參考文獻［12］進行Transwell細胞侵襲實驗，簡述如下：基質膠4℃溶解后，用不含FBS的DMEM/F12培養基以1：5進行稀釋，并取40μl稀釋后的基質膠包被Transwell上室，于37℃下靜置4 h，使基質膠凝固后備用。收集處于對數生長期的HEC-1A細胞，用含1%FBS與1%雙抗的DMEM/F12培養液進行饑餓培養24 h后，用0.25%胰酶進行常規消化，用不含FBS的DMEM/F12培養基重懸細胞，調整密度至4×105個/ml。向Transwell小室中加入無血清細胞懸液200μl，下室加入500μl含10%FBS的常規DMEM/F12培養液。每組設定3個復孔，于37℃、5%CO2恒溫培養箱培養48 h。取出上室，PBS沖洗2次，并用濕棉簽輕輕擦拭小室上層未穿出細胞，無水酒精固定15 min，室溫下晾干。0.1%結晶紫于室溫下染色30 min，PBS沖洗2次后于倒置顯微鏡下觀察穿出細胞數，每組隨機選取5個視野進行計數。實驗單獨重復3次。

1.2.5 細胞劃痕實驗 參考文獻［13］進行細胞劃痕實驗，簡述如下：預先在6孔板每個孔底部使用marker筆劃2條間隔為5 mm的橫線，再將細胞接種于6孔板中，每孔加入2 ml含10%FBS與1%雙抗的DMEM/F12培養液，并使每孔細胞達2×105個，于37℃、5%CO2恒溫細胞培養箱進行培養，待細胞密度達到80%左右時使用200μl移液器槍頭在細胞培養面垂直于marker筆劃線，PBS沖洗細胞3次以去除刮除掉的細胞。再向每孔加入含2%FBS的DMEM/F12培養液，于細胞培養箱中繼續培養24 h，倒置顯微鏡下拍攝，使用Image J軟件測量細胞間距離并進行分析。實驗單獨重復3次。

1.2.6 Annexin V-FITC細胞凋亡實驗 參考相關文獻［10］進行Annexin V-FITC細胞凋亡實驗，簡述如下：收集處于對數生長期的細胞，每孔加入1 ml的0.25%胰酶進行常規消化，收集細胞懸液至5 ml離心管中，1 200 r/min離心5 min，棄上清，取細胞沉淀并加入195μl Annexin V-FITC結合液重懸細胞，調整細胞濃度至7×105個/ml，并依次加入5μl An?nexin V-FITC及10μl的碘化丙啶（PI）染色液，輕輕搖晃離心管以充分混勻后，室溫下避光孵育半小時。最后流式細胞儀檢測。實驗單獨重復3次。

1.2.7 RT-qPCR實驗 參考文獻［10］進行RT-qP?CR實驗，簡述如下：收集處于對數生長期的細胞，按照Trizol法提取組織或細胞中總RNA，經純度檢測與定量后，根據逆轉錄試劑說明書逆轉錄為cDNA，再按照RT-PCR試劑說明書及預實驗確定的反應時間與溫度進行實時定量，RT-PCR反應條件為：95℃（10 min）預變性后，變性95℃（7 s）→退火60℃（20 s）→72℃（38 s），40個循環周期。RT-PCR引物為：miR-29a上游引物5'-CGACTCTAGAAACACAAGAGCA-3'，下 游 引 物5'-AAGGTTAGCTTACTGTCACAC?GCTT-3'；PI3K上 游 引物5'-ATACCGCGGACTGT?GTTTCCAGTACACCT-3'，下 游 引 物5'-ACTGT?GTTTCCAGTACACCTACTGACCGTGACATCCTC-3'；GAPDH上游引物5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下 游 引 物5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。以GAPDH為內參，采用2-??Ct方法分析相關基因的表達量。

1.2.8 雙熒光素酶基因報告實驗 參考文獻［11］進行雙熒光素酶基因報告實驗，簡述如下：采用miR?NA靶基因在線數據庫TargetScan預測miR-29a靶基因并篩選PI3K進行驗證。取處于對數生長期的HEC-1A細胞，調整細胞密度為2×104個/孔，接種于96孔板中，于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養過夜，待細胞完全貼壁后，利用Lipofectamine2000將PI3K野生型（WT）及突變型（MUT）熒光素酶報告基因質粒分別轉入HEC-1A細胞中，再將miR-29a mimic及mimic-scramble分別轉入PI3K野生型及突變型細胞中，每組設5個復孔，轉染48 h后，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測PI3K啟動子的熒光強度。

1.2.9 Western blot實驗 參考文獻［14］進行West?ern blot實驗，簡述如下：收集處于對數生長期的細胞，4℃預冷的PBS洗滌細胞3次后，加入RIPA細胞裂解液及蛋白酶抑制劑提取細胞總蛋白。BCA法進行蛋白定量，按照1：4向上清液中加入5×蛋白上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。取35μg的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，采用濕轉法將分離的蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h，分別加入PI3K（1：800），p-AKT（1：500）、mTOR（1：500）、GAPDH（1：1 000）一抗，4℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次，5 min/次，以辣根酶標記的二抗（1：5 000）室溫孵育1 h，用TBST溶液清洗3次，5 min/次。最后均勻滴加ECL發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。Image J軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內參GAPDH的比值作為其相對含量。上述實驗重復3次。

1.3 統計學分析 采用SPSS18.0和GraphPad Prism5.0對數據進行統計學分析，數據結果以±s表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行多組間分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。顯著性檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-29a在EC組織與正常子宮內膜組織中的差異表達 采用miRNA芯片篩選出在EC組與正常對照組的子宮內膜組織中差異表達的miRNA，發現有36種miRNAs存在不同程度的差異性表達，將差異倍數（fold change，FC）≥2作為篩選標準，同時選取在3例EC患者中表達一致下調的，且下調趨勢最為顯著（大于3倍）的miR-29a進行研究。隨后通過RT-PCR實驗對所有15例內膜癌組織與正常對照組織進行檢測，結果表明與正常對照組相比，miR-29a在EC患者的內膜組織表達顯著降低（P=0.021）。見圖1。

2.2 轉染miR-29a mimic/inhibitor后EC細胞中miR-29a的表達 HEC-1A細胞在轉染miR-29a mimic、inhibitor后，RT-PCR實驗結果顯示，與正常對照組HEC-1A細胞相比，miR-29a mimic組細胞中miR-29a的表達顯著升高（P=0.019），而miR-29a in?hibitor組HEC-1A細胞中miR-29a的表達明顯降低（P=0.021），mimic-scramble及inhibitor-scramble組細胞中miR-29a的表達無明顯變化（P=0.887、P=0.925）。見圖2。

圖1 miR-29a在EC中異常低表達Fig.1 miR-29a was significantly under-expressed in EC tissue

圖2 轉染miR-29a mimic/inhibitor后EC細胞中miR-29a的表達Fig.2 Expression level of miR-29a in EC cells after trans?fection with miR-29a mimic/inhibitor

2.3 miR-29a對EC細胞增殖的影響 MTT實驗結果顯示與正常對照組HEC-1A細胞相比，miR-29a mimic組細胞增殖能力明顯減弱（P=0.011），而miR-29a inhibitor組細胞增殖能力顯著增強（P=0.038），mimic-scramble及inhibitor-scramble組細胞的增殖能力無明顯變化（P=0.753、P=0.696）。見圖3。

2.4 miR-29a對EC細胞侵襲能力的影響 Tran?swell實驗結果顯示與正常對照組HEC-1A細胞相比，miR-29a mimic組細胞的侵襲能力顯著下降（P=0.004），miR-29a inhibitor組細胞的侵襲能力明顯增強（P=0.008），mimic-scramble及inhibitor-scramble組細胞的侵襲能力無明顯變化（P=0.871、P=0.834）。見圖4。

2.5 miR-29a對EC細胞遷移能力的影響 遷移實驗結果顯示與正常對照組HEC-1A細胞相比，miR-29a mimic組細胞遷移能力顯著下降（P=0.004），miR-29a inhibitor組細胞遷移能力明顯增強（P=0.027），mimic-scramble及inhibitor-scramble組細胞的遷移能力無明顯變化（P=0.468、P=0.620）。見圖5。

2.6 miR-29a對EC細胞凋亡的影響 Annexin VFITC凋亡實驗結果顯示與正常對照組HEC-1A細胞相比，miR-29amimic組細胞凋亡發生率顯著升高（P=0.007），miR-29a inhibitor組細胞凋亡發生率明顯降低（P=0.029），mimic-scramble及inhibitor-scramble組細胞的凋亡發生率無明顯變化（P=0.943、P=0.886）。見圖6。

圖3 miR-29a對EC細胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of miR-29a on proliferation of EC cells

圖4 miR-29a對EC細胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect of miR-29a on invasion of EC cells

2.7 miR-29a在EC細胞中與PI3K的靶向關系 miRNA靶基因在線數據庫TargetScan結果顯示PI3K基因的3′-UTR區存在能與miR-29a的結合序列，這提示PI3K基因可能為miR-29a的潛在靶基因。利用雙熒光素酶基因報告實驗進行驗證，如圖7B所示，與mimic-scramble相比，miR-29a mimic能使PI3K-WT組的熒光酶活性顯著降低（P=0.021），而PI3K-MUT組的熒光酶活無明顯變化（P=0.447）。見圖7。

圖5 miR-29a對EC細胞遷移能力的影響Fig.5 Effect of miR-29a on migration of EC cells

圖6 miR-29a促進EC細胞發生凋亡Fig.6 Effect of miR-29a on EC cell apoptosis

2.8 miR-29a對EC細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響 Western blot實驗結果顯示與正常對照組HEC-1A細胞相比，miR-29a mimic組細胞中PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表達均明顯降低（P=0.023、P=0.037、P=0.019），而miR-29a inhibitor組細胞中PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表達均顯著增加（P=0.044、P=0.039、P=0.028），mimic-scramble及inhibitor-scramble組細胞中上述蛋白均無明顯變化（P=0.573、P=0.639、P=0.954與P=0.125、P=0.944、P=0.778）。見圖8。

圖7 miR-29a在EC細胞中靶向調控PI3K的表達Fig.7 miR-29a targets expression of PI3K in EC cells

3 討論

EC是發生于子宮內膜的一種上皮惡性腫瘤，好發于圍絕經期及絕經后婦女，常表現為陰道不規則出血或流液［12］。據報道，每年有接近20萬的新發病例，且發病年齡日趨年輕化，嚴重危害女性身體及生殖健康［2］。miRNA是近年來癌癥研究的熱點，因其具有多靶點及組織特異性等特點，使其調控網絡復雜龐大，且研究證實多種腫瘤具有其特征性的miRNA表達譜，如在乳腺癌、胃癌、肺癌等腫瘤中均發現特異性表達差異的miRNAs［6，15-17］。miRNA在腫瘤細胞中通過調控其下游靶基因，參與調節細胞的分化、增殖、侵襲、凋亡等多種生物學行為，從而發揮促癌或抑癌基因的作用［13］。GONG等［18］發現在宮頸癌組織中miR-29a表達顯著下調，進一步研究證實miR-29a通過下調DNA甲基化轉移酶1（DNM1）的表達，下調細胞因子信號傳導抑制因子1（SOCS1）的啟動區甲基化水平，從而調控宮頸癌細胞的增殖、侵襲及凋亡等生物學行為，最終發揮抑癌基因的作用。在膠質瘤組織中，miR-29a表達水平同樣存在顯著降低現象，其可能通過負向調控參與腫瘤免疫逃逸的重要負性因子B7-H3（CD276）的表達，進而下調趨化因子CXCR4，最終抑制膠質瘤細胞惡性侵襲能力［14］。在肝癌中，miR-29a通過靶向抑制細胞間連接蛋白CLDN1的表達，從而抑制腫瘤細胞的生長及遷移［19］。本研究通過基因芯片篩選EC患者與健康對照組子宮內膜中差異性表達的miRNAs，發現miR29a顯著低表達于EC患者的子宮內膜組織中，同時PR-PCR實驗結果同樣證實，在EC細胞系HEC-1A中miR29a的表達亦顯著降低。為進一步明確miR-29a是否影響EC的發生發展，我們又通過脂質體瞬時轉染技術對HEC-1A細胞中miR-29a進行過表達或抑制處理，并利用MTT、Transwell、劃痕實驗及Annexin V-FITC凋亡實驗分別檢測miR-29a對EC細胞的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響，結果顯示過表達EC細胞中的miR-29a，可明顯抑制細胞的增殖、侵襲、遷移能力，并促進細胞發生凋亡，而抑制其表達，EC細胞的增殖、侵襲、遷移能力顯著提高，且細胞的凋亡率明顯下降。生物信息學結果顯示PI3K可能是miR-29a的潛在靶基因，雙熒光素酶基因報告實驗及Western blot驗證了兩者的靶向關系。這提示在EC中，miR-29a可能通過下調PI3K的表達，抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移能力，促進其發生凋亡。

近年來，研究發現PI3K/AKT/mTOR信號通路在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤的發生發展中具有重要地位，且該通路與細胞生存、增殖及凋亡等生物學行為密切相關［20］。磷脂酰肌醇-3（phos?phatidyl inositol 3-kinase，PI3K）是一種異質二聚體，其通過與細胞表面各種受體如生長因子、G蛋白偶聯受體等相互作用，引起自身構象的改變而被激活［21］。激活的PI3K通過磷酸化細胞內的第二信使4，5-二磷酸酯酰肌醇，并使其活化下游的主要效應蛋白——蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）從細胞膜轉移至細胞質，并促使構象改變，發生磷酸化（p-AKT）而被激活。而激活后的p-AKT通過啟動下游靶基因mTOR，從而參與調節促進細胞增殖、轉移、凋亡等生物學行為［22］。最新的研究表明，促進PI3K/AKT/mTOR信號通路同樣能夠增強針對腫瘤的固有免疫反應，進而加強機體對腫瘤的免疫監視來延緩病情的進展［23］，如在黑色瘤的小鼠模型中，應用PI3K抑制劑GSK2636771能夠顯著促進腫瘤組織中CD8+T細胞的浸潤，延緩小鼠的生存期［24］。本研究通過Western blot實驗在過表達與抑制miR-29a表達的EC細胞中檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路PI3K、p-AKT、mTOR蛋白的表達，結果顯示上調EC細胞中miR-29a的表達，可明顯抑制PI3K、p-AKT、mTOR的表達，而抑制細胞中miR-29a的表達，PI3K、p-AKT、mTOR的表達卻顯著增強。這提示在EC中，miR-29a可能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路影響腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移及凋亡能力。

綜上所述，我們發現在子宮內膜癌中低表達miR-29a可能通過抑制PI3K的表達，從而下調PI3K/AKT/mTOR信號通路，抑制內膜癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力，并促進細胞發生凋亡，從而發揮著抑癌基因的作用。本研究證實miR-29a是子宮內膜癌中重要的抑癌miRNA，糾正EC中miR-29a的異常低表達可能成為子宮內膜癌基因治療的有效手段。眾所周知，腫瘤微環境是腫瘤發生發展的土壤，其主要由免疫細胞、成纖維細胞及細胞外基質等成分共同構成［25］，而鑒于miR-29a及靶基因PI3K在腫瘤相關免疫中的重要地位，下一步我們課題組將從miR-29a是否能夠通過PI3K/AKT/mTOR信號通路影響腫瘤微環境中的相關免疫細胞功能方面繼續深入探究miR-29a在EC中的其他作用，以期為針對miR-29a在子宮內膜癌中的靶向治療提供新的證據。