多發性硬化患者IL-23R基因多態性和γδT及Treg細胞關聯性分析①

林再紅 傅增輝 金 艷 姜 巖 劉 晶 于繪麗 張廣萍

（齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院神經內科，齊齊哈爾161002）

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種炎癥性脫髓鞘性神經疾病（inflammatory demyelinating diseases，IDD）。白細胞介素23A（interleukin-23A，IL-23A）通過與其受體IL-23R相互作用調節和協調免疫細胞活性，并在免疫炎癥疾病的致病機理中發揮關鍵作用。MS是一種自身免疫性疾病，該疾病的發生發展涉及IL-23和其受體。LI等［1］發現IL-23R基因中rs1884444位點與MS患者發病風險有關。有研究發現，IL-23R基因rs11209032、rs11209026、rs11465804位點與強直性脊柱炎和潰瘍性結腸炎等自身免疫疾病的發病風險有關［2-3］。γδT細胞屬于固有免疫細胞，可調控適應性免疫應答。已有研究報道，γδT細胞表達IL-23R，參與多種自身免疫性疾病的病理形成［4］。在實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）動物模型實驗中，EAE模型動物腦脊液中的γδT細胞比例增加，而CD4+CD25+Foxp3+Treg比例降低，γδT細胞通過抑制CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞發揮抑制免疫功能［5］。本研究對132例漢族非急性加重期MS患者的IL-23R基因進行分析，評估IL-23R基因內rs11209032、rs11209026、rs11465804位點，流式細胞術檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg和γδT細胞比例，ELI?SA檢測MS患者血清IL-23水平，發現MS患者外周血IL-23水平和γδT細胞比例高于健康人群，但CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例低于健康人群，同時MS患者IL-23R基因位點rs11209032 AA基因型及A等位基因檢測率明顯高于健康人群，可能是MS發病的危險遺傳易感基因之一。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 收集齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院神經內科門診和病房2015年1月至2018年12月確診的漢族MS患者作為研究對象。納入要求：符合《多發性硬化診斷和治療中國專家共識》診斷標準和McDonald診斷標準的非急性加重期MS患者［6-7］。需排除項目：①肝炎病毒感染；②濫用酒精；③合并其他免疫相關疾病，如系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、腫瘤等患者。本研究共入選132例MS患者，所有MS患者進行擴展殘疾狀況評分量表（ex?panded disability status scale，EDSS）評分。另選本院體檢中心、實習學生等與病例組在性別、年齡相匹配的132例健康志愿者作為對照組。研究經齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院倫理委員會批準，均符合赫爾辛基宣言［8］要求，所有研究對象知情同意。

1.1.2 主要試劑與儀器 ELISA檢測試劑盒、全血DNA基因組試劑盒、PE標記的γδ單抗、CD25單抗和APC標記的Foxp3單抗、FITC-標記的CD4單抗和CD3單抗、IgG1-FITC、IgG2-PE均購于BD公司。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 所有研究對象空腹采肘靜脈血，分別加入無抗凝劑干燥管和EDTA-K2抗凝管（5 ml/管），用于后續全血DNA提取、流式細胞術檢測及ELISA檢測。

1.2.2 流式細胞術檢測 調節外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）濃度至1×106個/ml，Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。加入熒光標記的鼠抗人單克隆抗體于PBMC：PE標記的γδ單抗、CD25單抗和APC標記的Foxp3單抗，FITC-標記的CD4單抗和CD3單抗。以IgG1-FITC和IgG2-PE為對照。胞內細胞因子的標記以Fixation/perme?abilization溶液進行破膜固定后，再用Permeabiliza?tion緩沖液洗滌，加入APC標記的Foxp3單抗行細胞內染色，流式細胞術測定CD4+CD25+Foxp3+Treg和γδT細胞比例，采用CellQuest V3.2軟件分析。

1.2.3 IL-23檢測 ELISA法檢測IL-23水平，實驗步驟嚴格按照說明書操作。

1.2.4 DNA提取 試劑盒提取全血DNA，嚴格按說明書操作。DNA提取后，電泳檢測其完整程度，紫外分光光度儀檢測其濃度及純度，達標后用于后續檢測。

表1 IL-23R基因引物序列Tab.1 Primer sequences of IL-23R gene

1.2.5 基因多態性檢測 利用Primer Premier 5軟件設計引物，具體見表1。采用PCR?RFLP及基因測序法檢測PBMC細胞的IL-23R基因SNP類型。PCR反應體系的建立：總體積6.4μl，其中10μmol/L的上下游引物各0.2μl、PreMix TaqDNA聚合酶3μl、DNA模板1μl、去核酸酶水2μl。PCR反應條件；95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環36次，72℃延伸5 min。取2μlHsp92Ⅱ限制性內切酶加入5μl的PCR擴增產物，37℃下孵育6 h，將3%的瓊脂糖凝膠加入酶切后的PCR產物，Goldview染色后于250 V下電泳，Bio-Rad凝膠成像儀檢測結果，紫外燈下切膠，回收并檢測PCR產物。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 5統計軟件對所測數據進行統計學分析，計量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗；計數資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，樣本遺傳平衡檢驗采用Hardy-Weinberg計算法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 對照組132例（男36例，女96例），平均年齡（39.17±12.01）歲；MS組132例（男35例，女97例），平均年齡（38.20±11.47）歲。對照組和MS組的年齡和性別分布如表2所示，年齡、性別相比差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.2 兩組IL-23R基因rs11209032位點多態性分布 對照組和MS組PBMC細胞IL-23R基因位點rs11209026、rs11465804和rs11209032位點實際基因型分布與Hardy-Weinberg平衡狀態下的理論分布差異均無統計學意義（χ2=1.290，P＝0.223；χ2=1.941，P＝0.303；χ2=2.130，P＝0.401），符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，達到遺傳平衡，具有群體代表性。所有研究對象均基因分型成功。對照組和MS組rs11209026和rs11465804位點的基因型均為純合子，無法用于后續研究。這與HapMap數據庫的報道一致，僅rs11209032位點用于病例對照研究。PCR擴增片段可被限制性內切酶切為2個小片段，其中出現1條帶的稱為AA型，2條帶的稱為GG型，3條帶的稱為A/G型。MS組與對照組基因型頻率相比差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

2.3 兩組外周血中IL-23含量及CD4+CD25+Foxp3+Treg和γδT細胞比例比較 MS組血清中IL-23含量為（365.12±43.45）pg/ml，明顯高于對照組的（150.14±30.23）pg/ml，差異有統計學意義（t=3.196，P=0.003）；MS組CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例為（3.93±0.55）%，明顯均低于對照組的（7.42±1.03）%，差異有統計學意義（t=2.247，P=0.008）；MS組γδT細胞比例為（5.15±0.65）%，明顯均高于對照組的（3.12±0.45）%，差異有統計學意義（t=2.540，P=0.009）。

表2 兩組一般資料的比較（±s）Tab.2 Comparison of general data between two groups（±s）

表2 兩組一般資料的比較（±s）Tab.2 Comparison of general data between two groups（±s）

Index Control MS χ2/t P n 132 132 Age（years）39.17±12.01 38.20±11.47 1.014 0.339 Male 36（27.27%）35（26.52%）0.019 0.889 Female 96（72.73%）97（73.48%）EDSSscore-3.60±1.78- -Onset Age（years）-32.46±9.35- -

表3 兩組IL-23R基因rs11209032多態性的分布Tab.3 Distribution of rs11209032 polymorphism of IL-23R gene in two groups

表4 MS組基因型外周血IL-23含量比較（±s）Tab.4 Comparison of IL-23 content in MSgroup genotype peripheral blood（±s）

表4 MS組基因型外周血IL-23含量比較（±s）Tab.4 Comparison of IL-23 content in MSgroup genotype peripheral blood（±s）

Note：Compared with A/A，1）P＜0.05.

Item IL-23（pg/ml）CD4+CD25+Foxp3+Treg cell（%）γδTcell（%）A/A 535.01±71.31 2.51±0.30 6.50±0.57 A/G 382.19±40.131）3.80±0.411）5.21±0.541）G/G 262.30±63.221）4.93±0.521）4.01±0.611）t 2.501 1.038 1.934 P 0.009 0.003 0.005

2.4 MS組基因型外周血中IL-23含量及CD4+CD25+Foxp3+Treg和γδT細胞比例比較 如表4所示，MS組IL-23R基因位點rs11209032 AA基因型IL-23水平和γδT細胞比例顯著高于其他基因型，差異有統計學意義（P＜0.05）；而MS組IL-23R基因位點rs11209032 AA基因型CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例顯著低于其他基因型，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

目前為止，MS的病因尚不明確，可能與環境、免疫及遺傳因素等有關。迄今，已發現眾多與MS相關的SNP位點，IL-23R基因為其中之一［9］。IL-23R可誘導多種細胞因子和趨化因子的表達，從而加劇神經髓鞘的破壞［10］。IL-23由抗原提呈細胞產生，在炎癥疾病中扮演關鍵角色，同時在固有或先天免疫之間有橋梁作用［11］。另外，在初始的CD4＋T細胞轉化為Th17細胞的過程中，IL-23也發揮關鍵作用，可增加Th17細胞的數量并維持其活性，導致致炎細胞因子IL-17產生，這種IL-23/Th17/IL-17軸在MS等自身免疫病中有關鍵作用［12］。IL-23R在CD4+T細胞分化成為Th17淋巴細胞亞群的過程中起重要作用，是細胞因子IL-23異二聚體受體的特異性構成。在IL-23R基因敲除的C57BL/6小鼠模型中，分泌IL-17的Th17淋巴細胞亞群能導致骨、神經及腸道等組織的破壞［13］。還有研究表明，IL-23R的變異使患者對多發性硬化等自免疫疾病的易感性增加，該基因是解釋這些疾病易感的因素［14-15］。本研究中，所有健康志愿者和MS患者PBMC細胞IL-23R基因rs11209026和rs11465804位點的基因型均為純合子，僅rs11209032位點的基因型頻率在健康志愿者和MS患者PBMC細胞間差異顯著。通過檢測研究對象血清IL-23水平，發現MS患者IL-23水平高于對照組，與課題組的前期研究相符［16］。

MS是一種T細胞介導的自身免疫病，其中調節性T細胞的數量及功能異常在MS發病中起鎖鑰作用［17］。調節性T細胞主要包含數群具有免疫調節功能的T細胞，如CD4+CD25+Foxp3+Treg、Tr1、Th3及CD8+CD28-Treg等，在維持機體免疫及自身免疫耐受穩態中起紐帶作用，按其來源又可分為胸腺自然生發的nTreg及與外周血通過轉化生長因子β等誘導產生的iTreg［18］。T細胞按其表面抗原識別受體（Tcell receptor，TCR）所含肽鏈的區別，分為αβT和γδT細胞，后者能迅速識別TCR信號和模式識別信號，被認為是一種固有免疫細胞，是固有免疫與適應性免疫應答的紐帶［19］。有研究發現，γδT細胞表面IL-23R與IL-23結合，進一步分泌IL-17等炎癥因子，IL-17可進一步通過與Naive CD4+T細胞表面IL-17R結合，促進其向分泌IL-17的Th17細胞分化，而IL-21可抑制Naive CD4+T細胞向Treg細胞分化［20-21］。那么在MS中，IL-23是否通過與γδT細胞表面的IL-23R結合，進而活化γδT細胞并引起Th17/Treg免疫失衡？本研究發現，MS患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例較健康人降低，故CD4+CD2 5+Foxp3+Treg的異常與MS發病有關，這與MARINA等［22］的研究相似。T細胞中約有5%的γδT細胞，是一群表達T細胞抗原受體γδ鏈的T細胞亞群。在EAE小鼠模型中的研究中，表達IL-23受體的γδT細胞可通過IL-23依賴的機制抑制CD4+CD25+Foxp 3+Treg細胞功能，從而促進CD4+效應性T細胞增殖，促進EAE發病［23］。本研究中，MS患者外周血中γδT細胞比例較健康人顯著升高，γδT細胞在促進MS的發病中具有重要作用。課題組前期的臨床研究發現，IL-23與IL-17表達具有關聯性，推測MS中可能存在IL-23-Th17/IL-17軸的優勢活化，IL-23水平升高可誘導Th17的增殖分化并分泌IL-17，最終導致Th17/Treg免疫失衡，促進MS的發生發展［16］。

MS患者外周血IL-23水平和γδT細胞、IL-23R基因位點rs11209032多態性具有一定關聯，IL-23R基因位點rs11209032可能是MS發病的危險遺傳易感基因之一。IL-23R基因位點rs11209032基因多態性、外周血IL-23水平和γδT細胞三者協同可能有利于MS患者的早期診斷。本研究存在一定的局限性，存在樣本量較少且單一的弊端，尚需對不同地區、不同人群因遺傳背景和生活環境因素的不同的人群進行研究；本研究入選的MS均為非急性加重期，尚需進一步研究與急性加重期患者相關指標進行對比，進一步深入研究將有助于MS的發病機制的理解，并為MS的診斷、治療和預后判斷提供可能的標志物。