川陳皮素經AKT/GSK 3β/NF-κB通路抑制Kupffer細胞活化減輕大鼠原位肝移植后缺血再灌注損傷①

王敬元 李生偉 吳涯昆（重慶醫科大學附屬第二醫院肝膽外科，重慶400010）

肝移植可作為各種晚期肝病的治療方法，但肝移植誘導的肝臟缺血再灌注損傷（ischemia-reperfu?sion injury，IRI）可影響移植肝的功能，并加重免疫排斥反應［1］。既往研究表明，IRI由活性氧釋放、巨噬細胞活化、黏附分子以及細胞凋亡等多種因素共同參與［2-4］。庫普弗細胞（kuppffer cells，KCs）是肝臟中的常駐巨噬細胞，參與肝臟多種免疫反應，可通過改變自身活化狀態，從而調節肝臟炎癥水平，其中M1型KCs可誘導促炎因子的分泌，促進肝臟的炎癥水平，加重IRI程度，因此，通過抑制KCs的M1型極化和后續的炎癥級聯反應可以有效減輕IRI程度［5-7］。

川陳皮素是一種主要存在于柑桔果皮中的聚甲氧基黃酮，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化及抗糖尿病等調節免疫功能的生物學特性［8-10］。川陳皮素還可通過抑制活性氧的產生來減輕腦和心肌IRI，但其在肝臟IRI中的作用研究還尚有欠缺［11-12］。因此，我們使用川陳皮素預處理大鼠，以研究該藥在大鼠肝移植后肝臟IRI模型中的作用及其機制，為肝移植后肝臟IRI的藥物治療奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（6～8周齡，200～250 g）購自重慶醫科大學實驗動物中心，SPF級喂養，自由飲食，光照/黑暗每12 h進行交替。所有實驗操作均遵守重慶醫科大學倫理委員會發布的倫理及管理指南。

1.1.2 試劑及儀器 川陳皮素購自西安小草植物科技有限公司；COX2、AKT、p-AKT均購自美國Cell Signaling Technology公司；MCP-1、iNOS、GSK3β、p-GSK3β、NF-κB P65、p-P65、Cleaved-caspase3、Cas?pase3、Bcl-2、Bax均購自美國Abcam公司；ELISA試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；PCR試劑盒購自TaKaRa；TUNEL試劑盒購自博士德公司；HE染色試劑盒購自碧云天公司；氯膦酸二鈉脂質體（clodronate liposomes，CL）購自美國Encapsula Nano?Sciences；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自MCE公司；全自動生化儀購自美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 肝移植模型構建 肝移植供體及受體均為SD大鼠，根據Kamada肝移植操作方法［13］稍做改動，麻醉方法采用戊巴比妥鈉進行腹腔注射（60 mg/kg）。川陳皮素處理組中，采用DMSO充分溶解川陳皮素后，使用生理鹽水稀釋至6 mg/ml，供體大鼠每天經尾靜脈注射川陳皮素（50 mg/kg）一次，持續1周［14］。LT+CL+川陳皮素組中，術前48 h對供受體尾靜脈注射CL（4μl/g）阻斷KCs功能，其余處理同前［15］。移植肝冷缺血時間為60 min，再灌注3 h、6 h、12 h、24 h后獲取血清及組織標本進行ELISA、自動生化儀檢測、Western blot、HE等實驗分析。

1.2.2 提取KCs 根據LI等［16］所提到的方法，經門靜脈灌注含0.05%Ⅳ型膠原酶的PBS至肝臟變黃變軟。使用差速離心法將非實質細胞和實質細胞分開，采用Percoll溶液將KCs從非實質細胞中分離出來，將提取的KCs置于37℃，5%CO2，濕度為95%的培養箱中，10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM中培養。采用CD68進行細胞免疫熒光染色，其中CD68陽性者為KCs。細胞實驗中，川陳皮素組使用不同濃度（0、5、10、20、40μmol/L）川陳皮素處理24 h，再使用LPS（Sigma；100 ng/ml）處理3 h，收集各組細胞及上清液進行實驗分析。

1.2.3 Western blot 根據蛋白提取試劑盒說明將PMSF與RIPA按1：100的比例配制，使PMSF終濃度為1 mmol/L，將其加入各組細胞或肝組織中進行裂解并提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據蛋白分子量不同，將蛋白加入10%或12%的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，并轉印于PVDF膜（Millipore）上，采用5%脫脂奶粉封閉1 h，將PVDF膜與一抗4℃孵育過夜，將膜洗滌后與辣根過氧化物酶結合的IgG抗體于37℃孵育1 h，滴加ECL發光液，采用凝膠成像系統（Bio-Rad）進行檢測，采用ImageJ軟件對結果進行分析。

1.2.4 ELISA 使用ELISA試劑盒檢測KCs上清液以及血清中的炎癥細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10，并按提供的公式計算各因子濃度。將對應一抗按100μl/孔加入白板置于37℃下孵育4 h，棄去板中液體，加入封閉液于37℃封閉1 h，棄去封閉液，洗滌液洗滌5 min×3遍，拍干孔中殘余液體，按100μl/孔加入血清或細胞上清液，37℃下孵育1 h，洗滌5 min×3遍，加入酶標抗體于37℃下孵育1 h，洗滌5 min×3遍，加入底物，37℃下避光反應5 min，加入終止液終止反應，酶標儀進行檢測。

1.2.5 TUNEL細胞凋亡染色 TUNEL染色依據說明書（博士德）進行操作，取出石蠟切片脫蠟并按無水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，75%乙醇，水的順序進行水化，配制Proteinase K，滴于樣片室溫消化15 min，TBS洗滌2 min×3次，加標記緩沖液保持樣片濕潤，用1μl TdT+1μl DIG-d-UTP+18μl標記緩沖液室溫標記2 h，再次洗滌后用山羊血清室溫封閉30 min，與生物素化抗地高辛抗體室溫孵育30 min，洗滌后與SABC-FITC孵育30 min，使用DAPI進行細胞核染色10 min，滴加封片劑后采用熒光顯微鏡（Olympus）觀察采圖。

1.2.6 HE染色 將肝組織浸入10%多聚甲醛中固定，制成石蠟包塊后切片，根據碧云天HE染色試劑盒說明進行操作，進行蘇木精和伊紅染色，于光學顯微鏡下觀察采圖，使用SUZUKI法［17］對各組進行評分。

1.2.7 肝功測定 血清丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）采用全自動生化儀（Beckman CX7）進行檢測。

1.3 統計學分析 實驗結果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，所有數據采用GraphPad Prism 7軟件進行統計，當P＜0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 川陳皮素抑制LPS活化的KCs中炎癥因子的表達 根據LI等［16］的方法提取正常SD大鼠KCs，培養至細胞狀態穩定后，使用CCK-8法檢測不同濃度（5、10、20、40μmol/L）川陳皮素對KCs活力的影響，結果顯示40μmol/L組有明顯降低（P＜0.05），而其余3組無明顯差異（圖1A），表明40μmol/L濃度的川陳皮素抑制KCs的活力，因此選擇5、10、20μmol/L進行后續實驗。研究表明，KCs的活化及炎癥因子的釋放在肝臟IRI中起著重要作用，因此，檢測了LPS活化的KCs中炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6的蛋白水平，結果顯示，LPS（100 ng/ml）處理后，與未用LPS處理組相比，其IL-1β、TNF-α和IL-6的蛋白表達水平都明顯升高，而川陳皮素處理能夠抑制其炎癥因子的表達，并具有一定的劑量依賴性（P＜0.05，圖1B、C）。ELISA檢測了各組細胞上清中炎癥因子的水平，結果表明川陳皮素能夠抑制促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的水平，促進抑炎因子IL-10的分泌（P＜0.05，圖1D）。以上結果表明川陳皮素能夠抑制KCs中炎癥因子的分泌。

圖1 川陳皮素對KCs炎癥因子的影響Fig.1 Effectsof nobiletin on inflammatory cytokinesin KCs

圖2各濃度川陳皮素對KCs中AKT/GSK 3β/NF-κB信號通路的影響Fig.2 Effects of nobiletin at different concentrations on AKT/GSK3β/NF-κB pathway in KCs

2.2 川陳皮素通過AKT/GSK3β/NF-κB信號通路抑制KCs活化 AKT/GSK3β/NF-κB信號通路參與巨噬細胞的活化以及多種炎癥性疾病的發生發展［18］。NF-κB的過度激活及其下游炎癥級聯反應在肝臟IR損傷過程中發揮重要作用［19］。為驗證川陳皮素影響KCs的活化及功能的機制，采用Western blot檢測了AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、NF-κBP65和p-P65的水平，結果顯示，AKT/GSK3β/NF-κB通路的磷酸化水平在LPS處理組明顯高于對照組，而川陳皮素能夠有效降低p-GSK3β和p-P65的表達水平，這與p-AKT的表達一致（P＜0.05，圖2A、B）。以上結果表明川陳皮素可能通過抑制AKT/GSK3β/NF-κB通路來抑制KCs的活化及功能。

2.3 川陳皮素預處理減輕肝移植后IRI 我們通過檢測血清轉氨酶水平及觀察HE染色結果評估川陳皮素預處理對大鼠肝移植后肝臟IRI程度的影響。結果顯示術后各時間點血清ALT、AST水平均高于假手術組，提示肝移植術后肝臟明顯受損，然而，各時間點LT+川陳皮素組血清ALT、AST的水平較LT組都明顯降低，這提示川陳皮素可有效減輕肝移植術后肝臟IRI（P＜0.05，圖3A）。肝組織（再灌注24 h）HE染色結果進一步證實川陳皮素對IRI肝臟的保護作用，HE染色結果顯示假手術組的肝小葉形態基本正常，無明顯炎癥細胞浸潤，LT組可見肝小葉周邊細胞腫脹明顯，胞漿空泡化，并有大量淋巴細胞或中性粒細胞浸潤，與之相比，LT+川陳皮素組腫脹細胞明顯減少，且胞質空泡化和炎癥細胞浸潤程度也明顯減輕（P＜0.05，圖3B）。

2.4 川陳皮素預處理減輕IRI肝臟的凋亡水平肝移植后，IRI可誘導肝實質細胞凋亡，我們使用TUNEL實驗來檢測川陳皮素對肝移植肝臟IRI誘導的細胞凋亡的影響，結果表明LT組的肝組織顯示TUNEL陽性細胞數量高于假手術組，此外，LT+川陳皮素組TUNEL陽性細胞數明顯低于LT組（P＜0.05），在使用CL阻斷肝臟KCs后，移植肝中TU?NEL陽性細胞數較川陳皮素處理組明顯增加（P＜0.05），而與LT組無顯著差別（圖4A）。以上結果提示川陳皮素可有效抑制肝移植后肝臟中的凋亡水平，并且在一定程度上依賴KCs發揮作用。我們從蛋白水平也證實川陳皮素能夠有效降低缺血再灌注肝臟的凋亡蛋白Cleaved-caspase3和Bax的水平，并抑制抗凋亡蛋白BCL-2的表達（P＜0.05，圖4B）。以上結果表明，川陳皮素能夠通過抑制肝臟細胞凋亡有效減輕肝移植后肝臟IRI引起的肝損傷。

圖3 體內實驗中川陳皮素對缺血再灌注肝臟的影響Fig.3 Effects of nobiletin on ischemia-reperfusion liver in vivo

2.5 川陳皮素抑制KCs的M1型極化并減輕肝移植后肝臟IRI引起的肝臟炎癥反應 KCs是肝臟中的常駐巨噬細胞，在調節機體免疫平衡中起重要作用。其中M1型KCs在促進肝臟炎癥發生中起重要作用，我們用流式細胞術檢測了M1型極化（CD68和CD86雙陽性）KCs的比例，結果顯示，川陳皮素明顯抑制CD68+CD86+KCs的比例（P＜0.05，圖5A）。表明川陳皮素能夠明顯抑制肝移植后肝臟中KCs的M1型極化。采用ELISA法進一步檢測血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，結果顯示與LT組相比，LT+川陳皮素組中炎癥因子顯著降低（P＜0.05），這表明川陳皮素可抑制肝移植后肝臟IRI引起的炎癥反應（圖5B）。為了進一步驗證其機制，我們還檢測了各組KCs中AKT/GSK3β/NF-κB信號通路的活性，結果提示與LT組相比，LT+川陳皮素組p-AKT、p-GSK3β、p-P65的蛋白水平明顯降低（P＜0.05，圖5C）。以上結果進一步證實AKT/GSK3β/NF-κB信號通路可能參與川陳皮素對肝移植后肝臟IRI的調節作用。

圖4 川陳皮素對缺血再灌注肝臟凋亡水平的影響Fig.4 Effects of nobiletin on the cell apoptosis in liver af?ter ischemia-reperfusion

圖5 川陳皮素對缺血再灌注肝臟KCs活化及炎癥水平的影響Fig.5 Effects of nobiletin on KCs activation and inflam?mation in ischemia-reperfusion liver

3 結論

肝臟腫瘤切除、低血容量性休克和肝移植過程都可引起肝臟IRI，尤其是在肝移植手術中，IR可引起肝功受損，進而加重肝移植后急慢性排斥反應的發生［20］。由于IRI缺少有效的治療方法，因此對相關藥物的研究很有必要。以往研究表明，肝臟IRI由多種因素引起，包括巨噬細胞和樹突狀細胞的激活、氧化應激以及先天性和適應性免疫反應中產生的促炎因子［21-22］，其中巨噬細胞的活化及其下游炎癥反應在IRI過程中起著至關重要的作用［23］，因此，調節巨噬細胞活化程度及其下游炎癥通路有助于減輕肝臟IRI。

川陳皮素作為柑橘類水果的主要成分，在抗糖尿病、抗癌、抗氧化應激及炎癥疾病中都有研究［8-10］。川陳皮素能夠有效減輕腦及腎臟IRI，但在肝臟IRI中的作用研究尚有欠缺［11-12］。KCs是肝臟巨噬細胞的主要部分，具有吞噬、抗原呈遞及釋放炎癥因子等免疫調節功能，在肝臟IRI中發揮重要作用［24-25］。肝移植后可引起KCs活化，進而啟動黏附分子的表達并促進T淋巴細胞的激活，此外，KCs還可釋放活性氧及炎癥介質進一步加重肝損傷［26-27］。考慮到川陳皮素對其他缺血器官的保護作用，結合川陳皮素的抗炎特性，對川陳皮素在調節肝臟KCs活化、炎癥水平以及對大鼠肝移植誘導的冷缺血再灌注損傷方面進行了研究。

本研究在體外使用LPS處理活化KCs，Western blot檢測到炎癥相關因子如IL-1β、TNF-α、IL-6的蛋白表達增加，ELISA檢測到細胞上清液中促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的水平升高。然而，在川陳皮素處理組中，促炎因子的水平明顯降低，這表明川陳皮素抑制了KCs的活化和分泌促炎因子的功能。同時我們檢測到AKT/GSK3β/NF-κB信號通路參與巨噬細胞的活化以及IRI過程，川陳皮素可抑制AKT/GSK3β/NF-κB信號通路中p-AKT、p-GSK3β、p-P65的表達，表明川陳皮素可能經該通路發揮對缺血再灌注肝臟的保護作用，但川陳皮素還可能通過其他途徑如JAK/STAT通路發揮作用，這有待進一步研究來證實。本研究在體內實驗檢測血清轉氨酶ALT、AST的水平，表明川陳皮素預處理可以緩解IR誘導的肝功能損傷程度，且HE染色結果證明其能夠有效減輕IRI，同時川陳皮素能夠降低血清IL-1β、TNF-α、IL-6的水平，證明其具有明顯的抗炎作用。TUNEL實驗進一步證實川陳皮素能夠降低缺血再灌注肝臟內細胞的凋亡水平。

以上數據共同表明川陳皮素能夠有效抑制KCs活化及其炎癥因子的分泌，減輕肝移植后肝臟IRI，且AKT/GSK3β/NF-κB信號通路參與了該保護作用，但尚有其他可能機制參與其中，需要進一步研究。