miR-155表達變化對TGF-β1損傷足細胞蛋白podocin、CD2AP、synaptopo?din的影響①

凌霄雁 林 栩 鄭心彤 黃海庭 古賢君 梁 釗 覃 卿 杜秀日 唐志明 王 晨 韋美理

（右江民族醫學院附屬醫院，百色533000）

足細胞已成為治療腎臟疾病的直接靶點，幾乎腎小球疾病都涉及足突（foot procfesses，FPs）回縮消失、足細胞脫落或凋亡等足細胞損傷，最終引起蛋白尿、腎小球硬化［1］。而足細胞的正常結構和功能是由許多足細胞基因及其產物相互作用來維持的，例如裂孔隔膜相關蛋白nephrin、podocin、CD2AP和synaptopodin，它們在穩定腎小球濾過系統中共同發揮作用。相關研究發現足細胞基因的突變、缺乏會引起或加劇足細胞損傷，但是至今其中的分子病理生理機制尚未完全闡明［2-3］。

miRNA已被證明對足細胞的穩態至關重要，它是一種能靶向調節特定基因的非編碼小RNA，足細胞中miRNA的兩種必需酶Dicer或Drosha特異性損失則導致小鼠FPs消失、足細胞凋亡，出現明顯的蛋白尿并迅速發展為腎衰竭［4］。TGF-β1作為常用于誘導腎細胞損傷的因子，前期課題組已在TGF-β1誘導的足細胞損傷模型中發現miR-155表達增加，其表達水平可能與CD2AP、synapto?podin具有相關性，然而miR-155是否參與TGF-β1誘導的足細胞損傷，其中關系如何未明確，本實驗進一步深入研究miR-155與足細胞蛋白的調控關系，為miR-155在足細胞損傷中的作用提供理論和實驗依據［5］。

1 材料與方法

1.1 材料 腎小球足細胞株（MPC5，上海復旦大學細胞中心）；RPMI1640培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（以色列BI-04-002-1A）；胰蛋白酶（美國Gibco公司）；miR-155-5p模擬物（miR-155 mimics）、miR-155-5p抑制劑（miR-155 inhibitor）、miR-155 NC陰性對照（廣州RiboBio公司）；脂質體2000轉染試劑（美國Invitrogen公司）；Opti-MEM無血清培養基（美國Gibco公司）；重組人TGF-β1（美國PeproTech公司）；RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；Mir-X miRNA FirstStrand Synthesis Kit（美國Clontech公司）；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成（引物序列見表1）；Podocin、CD2AP、synaptopodin、GAPDH兔抗小鼠一抗和HRP標記的羊抗兔二抗（美國Proteintech公司）；磷酸酶抑制劑混合物、蛋白酶抑制劑混合物（北京康為世紀公司）；BCA蛋白定量試劑盒（中國碧云天公司）；蛋白質提取試劑盒、ECL發光顯影液（美國Millipore公司）；4%多聚甲醛（上海Absin公司），Alexa Fluor 594熒光素標記兔抗IgG（美國CST公司）；熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）；凝膠成像系統（上海天能公司）；免疫熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 培養方法參考本課題組的前期研究［5］。在含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，于37℃、5%CO2培養箱中培養，細胞長滿至80%～90%時用胰蛋白酶消化傳代，放入培養箱繼續培養。用細胞免疫熒光染色鑒定足細胞是否分化成熟。

1.2.2 細胞轉染與藥物處理 以0.4×105～1×105個細胞種于6孔板中，待各組細胞融合至50%～70%后分別將Cy3 miR-155 NC、miR-155 mimics/mimics NC、miR-155 inihibitor/inhibitor NC及Lipo?fectamineTM2000加入Opti-MEM無血清培養基中混勻，靜置5 min，然后相對應混合，輕輕吹打混勻，室溫靜置20 min后加入6孔板細胞中，在培養箱孵育4～6 h。①用免疫熒光倒置顯微鏡隨機取3個高倍鏡視野，觀察Cy3 miR-155 NC紅色熒光的細胞數占總細胞數的百分比（轉染細胞率=熒光表達細胞數/總細胞數×100%），取其平均值作為轉染效率。②6孔板細胞中加入TGF-β1干預，終濃度為12 ng/ml，繼續培養進行后續實驗。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primers of RT-PCR

1.2.3 細胞分組 ①檢測正常組、TGF-β1組miR-155及蛋白CD2AP表達量；②分為miR-155 mimics+TGF-β1組、miR-155 mimics NC+TGF-β1組和miR-155 inhibitor+TGF-β1組、miR-155 inhibitor NC+TGF-β1組，在轉染（0 h、24 h、48 h、72 h）收集細胞檢測miR-155表達量；③分為正常組、TGF-β1組、TGF-β1+mimics組、TGF-β1+mimics NC組、TGF-β1+inhibitor組、TGF-β1+inhibitor NC組，給予TGF-β1干預48～72 h收集細胞進行檢測。

1.2.4 RT-PCR檢測足細胞miRNA-155、Podo?cin、CD2AP、Synaptopodin mRNA的表達 按1.2.3進行干預后，用TRIzol提取各實驗組細胞的總RNA，用紫外分光光度計進行總RNA的濃度和純度檢測，按照TaKaRa試劑盒說明書進行反轉錄和qRT-PCR，以GAPDH作為內參，miRNA內參為U6，反應條件：變性95℃30 s，反應95℃5 s，延伸60℃30 s，共40個循環，以2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.2.5 Western blot檢測足細胞Podocin、CD2AP、Synaptopodin蛋白的表達 各組細胞按1.2.3進行干預后用RIPA裂解液充分裂解細胞，提取各組細胞總蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白質樣品與蛋白質上樣緩沖液混勻，100℃下反應3～5 min充分變性，冷卻至室溫，取30～50μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，300 mA恒流濕轉至PVDF膜，封閉液室溫封閉1 h，加一抗（Podocin 1∶400，CD2AP 1∶1 000，synaptopodin 1：1 000，GAPDH 1∶10 000），4℃孵育搖勻過夜。TBST洗膜3次，加入HRP標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，用化學發光液進行顯影，凝膠成像系統采集圖像，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6 細胞免疫熒光法 用PBS洗細胞3次，4%多聚甲醛室溫下固定15 min，PBS洗3次，0.3%Tri?tonX-100室溫破膜10 min，PBS洗3次，山羊血清室溫封閉1 h，加入一抗（CD2AP，1∶100），4℃搖床過夜，PBS洗3次，加入熒光二抗（1∶500）室溫避光孵育1 h，滴加DAPI復染5 min后防熒光淬滅劑封片，免疫熒光顯微鏡下觀察、攝片，Image Pro Plus圖像分析軟件分析熒光強度。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行統計分析，符合正態性分布的資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較用單因素方差分析（Oneway ANOVA），兩兩比較用LSD-t檢驗；轉染后miR-155表達隨時間變化的比較采用兩因素重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 足細胞分化鑒定 應用細胞免疫熒光染色檢測足細胞特異性蛋白CD2AP，熒光顯微鏡觀察顯示染色明顯，CD2AP分布于胞漿、細胞周邊、次級突起（圖1），此為分化足細胞CD2AP的分布的特征。用于實驗的細胞均為分化成熟的足細胞。

圖1 CD2AP在足細胞中的表達和分布（×200）Fig.1 Expression and distribution of CD2AP in podocytes（×200）

圖2 miR-155和CD2AP在TGF-β1誘導的足細胞中的表達Fig.2 Expressions of miR-155 and CD2APin podocyte in?duced by TGF-β1

2.2 TGF-β1誘導足細胞miR-155和蛋白CD2AP表達改變 用TGF-β1處理足細胞72 h后提取細胞，與正常組相比，TGF-β1處理可使足細胞中miR-155的表達顯著升高，CD2AP的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05，圖2）。這與本課題組前期實驗TGF-β1誘導足細胞損傷結果一致［5］。

2.3 miR-155轉染足細胞后不同時間的miR-155表達變化 轉染成功指示劑Cy3 miR-155 NC轉染入足細胞，24 h后用倒置熒光顯微鏡觀察轉染熒光情況，紅色熒光明顯分布于細胞內，轉染效率為90%左右（圖3A）。轉染miR-155 mimics或miR-155 in?hibitor 0 h、24 h、48 h、72 h，用RT-PCR檢測miR-155的表達。重復測量方差分析結果顯示：對照組NC+TGF-β1的0 h和24 h miR-155表達水平無明顯差異（P＞0.05）；mimics+TGF-β1組24 h和0 h相比，miR-155表達水平增加（P＜0.05）；inhibitor+TGF-β1組24 h和0 h相比，miR-155表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。轉染24 h、48 h、72 h：①不同的時間點miR-155表達差異有統計學意義（P＜0.05）；②不同組間miR-155表達差異有統計學意義（P＜0.05）；③不同轉染組和觀察時間之間存在交互作用（P＜0.05）。miR-155 mimics+TGF-β1組在轉染48 h、72 h后miR-155表達水平上升（P＜0.05），NC+TGF-β 1組轉染48 h、72 h后miR-155水平稍上調（P＜0.05），但mimics+TGF-β1組與mimics NC+TGF-β1組比，miR-155表達水平增加（P＜0.05），而miR-155 inhibitor+TGF-β1組在轉染miR-155 inhibitor 48、72 h后miR-155表達水平下降（P＜0.05），inhibitor NC+TGF-β1組miR-155的表達水平上調（P＜0.05），inhibitor+TGF-β1組與inhibitor NC+TGF-β1組比，miR-155表達水平降低（P＜0.05），miR-155 inhibitor可能抑制了TGF-β1誘導的足細胞miR-155水平的表達（圖3）。以上說明miR-155可能參與了TGF-β1對足細胞的作用。

圖3 miR-155在足細胞中的轉染效果Fig.3 Transfection effects of miR-155 in podocytes

2.4 轉染miR-155 mimics和miR-155 inhibitor后TGF-β1誘導的足細胞miR-155表達水平的變化 各組與正常組比，miR-155的表達量差異均有統計學意義（P＜0.05），與TGF-β1組相比，miR-155 mimics的轉染顯著上調miR-155的表達量（P＜0.05），而轉染miR-155 inhibitor后miR-155表達下調，差異均有統計學意義（P＜0.05），TGF-β1+mimics NC、TGF-β 1+inhibitor NC組與TGF-β1處理組相比miR-155的表達水平無明顯變化（表2）。結果進一步表明，miR-155 mimics可上調TGF-β1誘導的足細胞miR-155表達，miR-155 inhibitor則抑制TGF-β1誘導的足細胞miR-155表達。

表2 miR-155 mimics/miR-155 inhibitor轉染后miR-155表達水平的變化（xˉ±s，n=3）Tab.2 Changes in miR-155 expression level after miR-155 mimics/miR-155 inhibitor transfection（xˉ±s，n=3）

表3 miR-155表達水平對TGF-β1誘導足細胞損傷中podocin/CD2AP/synaptopodin mRNA表達的影響（±s）Tab.3 Effects of miR-155 expression level on expression of podocin/CD2AP/synaptopodin mRNA in TGF-β1 induced podocyte injury（±s）

表3 miR-155表達水平對TGF-β1誘導足細胞損傷中podocin/CD2AP/synaptopodin mRNA表達的影響（±s）Tab.3 Effects of miR-155 expression level on expression of podocin/CD2AP/synaptopodin mRNA in TGF-β1 induced podocyte injury（±s）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.05；compared with TGF-β1 group，2）P＜0.05.

Groups Normal TGF-β1 TGF-β1+miR-155 mimics TGF-β1+mimics NC TGF-β1+miR-155 inhibitor TGF-β1+inhibitor NC Podocin mRNA 1.000±0.000 0.817±0.0311）0.127±0.0041）2）0.847±0.040 1）1.133±0.049 2）0.838±0.017 1）CD2APmRNA 1.000±0.000 0.786±0.0531）0.597±0.0371）2）0.790±0.0591）1.003±0.0682）0.771±0.060 1）Synaptopodin mRNA 1.000±0.000 0.679±0.0391）0.443±0.0491）2）0.686±0.0321）0.943±0.0282）0.647±0.0391）

2.5 miR-155轉染后對TGF-β1損傷足細胞podo?cin、synaptopodin、CD2APmRNA表達的影響 與正常對照組相比，TGF-β1組足細胞中podocin、CD2AP、synaptopodin mRNA的表達下調，差異有統計學意義（P＜0.05），與TGF-β1組相比，TGF-β1+miR-155mimics組中podocin、CD2AP、synaptopodin mRNA的表達明顯下調，差異有統計學意義（P＜0.01），而TGF-β1+miR-155 inhibitor組中podocin、CD2AP、syn?aptopodin mRNA的表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05），TGF-β1+miR-mimics NC、TGF-β1+miR-155inhibitor NC組與TGF-β1處理組相比無統計學意義（表3）。結果表明，miR-155 mimics可促進TGF-β1誘導的足細胞podocin、CD2AP、synaptopodin表達下降，miR-155 inhibitor可逆轉TGF-β1對足細胞蛋白的損傷作用。

圖4 miR-155高表達對podocin、CD2AP、synaptopodin蛋白表達的影響Fig.4 Effects of miR-155 overexpression on expressions of podocin，CD2APand synaptopodin protein

圖5 miR-155低表達對podocin、CD2AP、synaptopodin蛋白表達的影響Fig.5 Effects of miR-155 low expression on expressions of podocin，CD2APand synaptopodin proteins

2.6 miR-155轉染后對TGF-β1損傷足細胞podo?cin、CD2AP、synaptopodin蛋白表達的影響 West?ern blot結果顯示，miR-155 mimics或miR-155 inhibi?tor轉染足細胞后，各組細胞之間podocin、CD2AP、synaptopodin蛋白水平的差異具有統計學意義（P＜0.05），miR-155 mimics高表達可促進podocin、syn?aptopodin、CD2AP蛋白表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05，圖4），而miR-155 inhibitor則下調足細胞miR-155水平，進而抑制3種蛋白的水平降低（P＜0.05，圖5），TGF-β1+miR-155 mimics NC、TGF-β1+miR-155inhibitor NC組與TGF-β1組相比無統計學差異。結果進一步表明，miR-155的表達變化可影響TGF-β1誘導 的 足 細 胞podocin、synaptopodin、CD2AP蛋白損傷。

2.7 miR-155轉染后免疫熒光染色觀察蛋白CD2AP表達與分布 CD2AP蛋白的表達與Western blot、RT-PCR結果一致。分化成熟的正常足細胞，CD2AP蛋白主要分布胞漿、周邊、次級突起（例如白色實心箭頭）；TGF-β1處理的細胞，CD2AP蛋白熒光減弱，部分向核周分布（例如空心粗箭頭）；miR-155 mimics轉染足細胞后CD2AP蛋白熒光比TGF-β1組較弱，且主要向核周分布（例如空心粗箭頭）；miR-155 inhibitor抑制TGF-β1引起的CD2AP蛋白改變。見圖6。

圖6 各組細胞CD2AP蛋白的分布與表達（×400）Fig.6 Expression of CD2AP protein in each group（×400）

3 討論

隨著蛋白質組學、生物信息學、分子生物學技術的發展，越來越多的足細胞超微結構、基因和功能被鑒定，足細胞與足細胞之間相互交叉作用，又通過足突附著于腎小球基底膜（glomerular base?ment membrane,GBM）［6］。由足細胞頂膜、裂孔隔膜（slit diaphragm,SD）、FPs、GBM組成了具有濾過功能的沙漏結構，其中的基因蛋白發生變化可引起足細胞結構功能改變，最終導致腎小球濾過功能下降和腎臟疾病，因此被認為是足細胞損傷的標志蛋白［7-8］。SD蛋白CD2AP缺乏的小鼠中活性氧增多，進而促使足細胞凋亡，抑制SHIP2使活性氧下降也不能阻止CD2AP缺乏引起的足細胞凋亡，而CD2AP過表達可減少足細胞凋亡［2］。其他的SD蛋白nephrin、podocin，突觸蛋白synaptopodin的突變和缺少都會引起足細胞的損傷，這與課題組實驗結果相一致，在TGF-β1干預的足細胞中，CD2AP與podocin、synaptopodin表達均降低［9］。研究還發現，與免疫炎癥密切相關的miR-155對足細胞蛋白CD2AP、podocin、synaptopodin具有靶向作用，miR-155高表達可負性調節podocin、synapto?podin、CD2AP的表達，miR-155低表達可使podo?cin、synaptopodin、CD2AP表達上調。

越來越多證據表明，miRNA在腎臟發育和腎臟生理穩態中起著重要的作用，很多腎臟疾病存在miRNA的失調［4］。近年來，miR-155在腎臟疾病中的作用不斷被發現，糖尿病腎病患者血液、尿液中miR-155的表達發生改變，miR-155還可能參與調節肥胖相關腎病腎臟組織和內皮細胞、狼瘡腎炎系膜細胞的損傷［10-13］。但是，目前miR-155對足細胞損傷的調控尚不清楚。有文獻表明腎上皮細胞、內皮細胞、基底膜、外基質和系膜細胞之間存在串擾，miRNA旁分泌和自分泌介導腎小球細胞，例如miR-143可能是足細胞和腎小球內皮細胞損傷串擾的介質，miR-378a-3p可抑制基底膜中細胞外基質蛋白nephronectin（NPNT）的表達水平，引起足細胞podocin表達下降［14-16］。因此，miR-155是否參與調節足細胞的損傷，且串擾其他腎細胞的損傷，對腎臟疾病而言具有一定研究價值。

miRNA是基因表達的中心協調器，可同時調節多個功能相關的靶基因，有的研究認為miRNA主要是在翻譯水平調節靶蛋白，對mRNA的影響可能不大。成功轉染miR-155 mimics或miR-155 inhibitor后，在不同時間點觀察了TGF-β1損傷足細胞模型中miR-155表達水平的變化及相應足細胞蛋白的表達，miR-155的表達在48、72 h后明顯上調或下調，隨后，在轉染48 h～72 h提取細胞，分別用RT-PCR和Western blot檢測CD2AP、podocin、synaptopodin的mRNA和蛋白表達變化，結果發現，miR-155 mimics可使TGF-β1誘導的足細胞miR-155表達增加，同時促進足細胞CD2AP、podo?cin、synaptopodin mRNA的下調，3種蛋白的蛋白表達量也一致下降，而miR-155 inhibitor可以與TGFβ1誘導足細胞增加的miR-155競爭結合，下調TGF-β1引起的miR-155表達，從而抑制miR-155對足細胞的作用，CD2AP、podocin、synaptopodin的mRNA和蛋白表達均上調，這說明miR-155可能同時靶向了足細胞的3種蛋白，從而參與調節TGF-β1誘導的足細胞損傷。有研究表明，CD2AP、podocin和nephrin可通過磷酸肌醇3-OH激酶連接，被認為是SD復合物［17］。CD2AP作為銜接蛋白通過其羧基端與骨架蛋白結合，將nephrin、podocin、syn?aptopodin與細胞骨架肌動蛋白連接起來，從而在功能上相互作用，影響CD2AP在足細胞中的定位和表達則破壞SD的穩定性和細胞骨架［18-19］。用免疫熒光觀察CD2AP蛋白的表達與Western blot和PCR結果一致，其分布也發生了相應改變，再次證明了miR-155對足細胞蛋白的作用。

綜上所述，miR-155的表達變化影響TGF-β1誘導的足細胞損傷，在蛋白和mRNA層面都是有作用的，轉染inhibitor可抑制miR-155對CD2AP、podocin和synaptopodin的靶向作用，改善足細胞的損傷。因此，miR-155有很大的潛力成為足細胞損傷新的藥物靶標，本課題組也提出假設，miR-155可以靶向足細胞、系膜細胞、內皮細胞、基底膜等腎細胞之間的串擾，緩解腎臟疾病，但具體的信號通路機制需要進一步深入研究。