IL-27在RA中的作用機制分析①

滑雅娜 朱凌妍 白 力 王永福

（包頭醫學院第一附屬醫院風濕免疫科（包頭醫學院風濕免疫研究所），包頭014010）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節慢性炎癥為特征的全身系統性疾病，可導致軟骨和骨損傷，甚至殘疾［1］。盡管目前多數RA患者的治療效果比較樂觀，但仍有患者病情未得到有效控制。因此，急需進一步闡明RA的發病機制，以開發新的治療方案。研究發現，IL-27在自身免疫性疾病中具有免疫抑制作用，但對RA的作用尚未明確［2］。課題組前期臨床研究發現，RA患者血清IL-27水平明顯高于骨關節炎（osteoarthritis，OA）患者，且血清IL-27水平與RA疾病活動性呈顯著負相關。因此，本研究通過構建小鼠膠原誘導型關節炎（col?lagen-induced arthritis，CIA）模型，探究IL-27在RA疾病進展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性DBA/1小鼠（8周齡，SPF級，中國南京生物醫學研究所）；小鼠rIL-27蛋白購自eBiosci?ence；Power UpTMSYBRTMGreen Master Mix購自美國Thermo Fisher Science；5X All-in-OneRTMaster Mix購自ABM；牛Ⅱ型膠原（CⅡ）和完全弗氏佐劑（CFA）購自Chondrex；核內因子染色試劑盒購自eBio-science；滲透緩沖液購自EBioscience；抗體均購自eBio-sci?ence；CantoⅡ流式細胞儀購自BD；Linegene9600系統購自杭州博日。

1.2 方法

1.2.1 造模及關節炎評估 牛Ⅱ型膠原充分混合于完全弗氏佐劑并乳化，分別間隔21 d，2次對DBA/1小鼠進行尾部皮下注射牛CⅡ型膠原（100μl/只），構建CIA小鼠模型。第2次免疫后約7 d可見小鼠足爪紅腫，觀察并評分直至實驗結束。采用五級評分法對小鼠關節進行量化評分（AI）并觀察，2次/周。評分標準：踝關節至整個腳掌腫脹記為4分；腳趾至踝關節腫脹記為3分；腳趾及腳趾關節腫脹記為2分；腳趾關節紅斑或腫脹記為1分；正常記為0分，關節炎評分為四肢評分總和［3］。

1.2.2 IL-27干預及分組 小鼠隨機分為3組：空白對照組（control）、CIA小鼠+同源IgG干預組（IgG）、CIA小鼠+IL-27干預組（IL-27干預組），空白對照組不做任何干預，IgG組與IL-27干預組每天腹腔注射等劑量（100μl/只）同源IgG或rIL-27蛋白（2μg），連續5 d，觀察小鼠關節情況并評分。

1.2.3 流式細胞術檢測Th17、Tr1和Treg比例 收集小鼠脾細胞，按核內因子染色試劑盒說明書進行操作，采用PMA/離子霉素混合物+BFA/莫能菌素混合物刺激5 h，脾細胞采用抗CD4和抗CD25染色，固定，細胞內固定和滲透緩沖液滲透，抗IL-17、抗IL-10和抗Foxp3染色，流式細胞儀收集數據并分析。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.2.4 ELISA檢測小鼠血清炎癥因子含量 實驗結束時，心臟采血收集小鼠血液樣本，靜置30 min，離心（3 000 g，15 min），收集血清，-80℃保存備用，根據ELISA試劑盒說明書檢測血清細胞因子水平。

1.2.5 RT-PCR檢測小鼠關節內炎癥因子IL-6、IL-17、IL-10或TGF-β基因表達 引物由Invitrogen公司合成，以Cyclophilin A為內參，序列見表1，Line?gene9600系統檢測，相對量分析基因表達，所有實驗至少重復3次。

1.2.6 組織病理學分析 實驗結束時處死小鼠，解剖并留取小鼠后肢關節，石蠟包埋，切片（5μm），關節HE和番紅O染色用于關節滑膜炎癥和軟骨損傷病理學觀察。

1.3 統計學分析 采用GraphPad Prism Version 8.0軟件進行統計學分析，采用單因素方差分析和Kruskal-wallis檢驗，數據以±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-27對小鼠CIA的改善作用 第2次免疫后開始至實驗結束時，連續對CIA小鼠關節進行觀察評分，結果顯示，與IgG組相比，IL-27干預組小鼠關節炎評分顯著降低，IL-27干預后CIA小鼠足爪腫脹程度明顯減輕，且小鼠日常活動度較IgG陽性對照組明顯增強（圖1）。

圖1 小鼠關節外形及關節炎評分（×100）Fig.1 Joint morphology and arthritisscoreof mice（×100）

2.2 IL-27對小鼠體內Th17細胞、Treg和Tr1細胞的影響 為更好地了解IL-27對RA的影響，采用流式細胞術檢測各組小鼠脾臟中CD4+IL-17+Th17細胞及CD4+IL-10+Tr1細胞百分比，結果顯示，IgG組小鼠脾臟細胞中CD4+IL-17+Th17細胞比例明顯高于空白對照組（P＜0.01），IL-27干預后小鼠脾細胞中CD4+IL-17+Th17細胞比例明顯降低（P＜0.01）。IL-27干預組小鼠脾細胞中CD4+IL-10+Tr1細胞較IgG陽性對照組表達明顯上調，3組小鼠脾細胞內CD4+FOXP3+Treg比例差異無統計學意義，表明IL-27干預緩解CIA小鼠病情與抑制Th17細胞表達而上調Tr1細胞表達有關，但并不依賴Treg的負免疫調控能力（圖2）。

2.3 IL-27對血清細胞因子的調節作用 采用ELI?SA法及RT-PCR法檢測小鼠體內炎癥相關細胞因子表達結果顯示，與空白對照組相比，IgG組的CIA小鼠血清IL-10、TGF-β、IL-6和IL-17A表達顯著升高（P＜0.05，圖3A），IL-27干預后IL-6、IL-17A表達明顯降低，而IL-10表達明顯上調（P＜0.05），與小鼠關節內相關炎癥因子mRNA表達趨勢一致（圖3B）。此外，IL-27干預并未對Treg特征性細胞因子TGF-β表達產生影響。表明IL-27可能通過上調負調控細胞因子IL-10表達抑制CIA小鼠促炎因子表達，如IL-17、IL-6。

圖2 各組小鼠體內Th17、Tr1和Treg比例Fig.2 Ratio of Th17，Tr1 and Treg in each group of mice

圖3 小鼠血清及關節內IL-6、IL-17A、TGF-β和IL-10表達Fig.3 Expressions of IL-6，IL-17A，TGF-βand IL-10 in mouse serum and intra-articular

圖4 各組小鼠關節組織病理形態改變（×100）Fig.4 Pathological changes of joint tissue of mice in each group（×100）

2.4 IL-27對CIA小鼠關節病理學狀態的影響 關節受累是RA中最主要的臨床癥狀，對此，本研究進一步觀察IL-27干預對CIA小鼠關節骨與軟骨的病理學狀態的影響，HE染色（圖4A）及番紅O染色（圖4B）結果顯示，IgG陽性對照組較空白對照組小鼠關節滑膜細胞增生和軟骨侵蝕更為嚴重，IL-27干預后CIA小鼠關節內炎癥細胞浸潤明顯減輕，關節及軟骨表面破壞較IgG陽性對照組明顯減輕。

3 討論

RA是最常見的自身免疫性疾病，其典型病理特征包括滑膜炎癥和關節損傷，后期病情若得不到有效控制將嚴重影響患者生活質量［4］。因此，深入研究RA的發病機制，針對性預防和治療RA，是當前風濕領域研究的熱點及重點。

RA發病機制復雜，其治療方案也多樣化，目前藥物雖可在一定程度上緩解大部分患者病情，但毒副作用較多，停藥后易復發，急需開發新的治療方案。機體免疫細胞和細胞因子相互作用，共同參與RA發生發展［5-8］。其中，部分具有負調節作用的免疫細胞及因子的作用效果不容忽視。IL-27作為IL-12家族新的細胞因子，隨疾病種類、病情嚴重程度及機體所處應激狀態差異，可通過促進Th1細胞增殖或抑制Th2、Th17細胞及Treg分化形式發揮促炎與抑炎雙向效應［2，9-10］。近年研究發現，IL-27可通過負調控體內TNF-α或Th17細胞生成延緩AIDS疾病進展［11-12］。RA患者病變關節滑膜組織與滑膜液中也發現IL-27表達，但其潛在作用機制仍需進一步探究。此外，Tr1細胞作為體內具有免疫抑制作用的誘導Treg主要通過活化時所分泌的IL-10和TNFβ抑制T細胞反應，或分泌穿孔素B和顆粒酶及通過直接接觸殺傷靶細胞，從而發揮負免疫調節功能［13-14］。研究報道，Tr1細胞參與誘導的多條應激信號通路激活可能與RA關節損傷和炎癥發病機制相關。IL-27某些免疫調節功能發揮同樣依賴Tr1細胞［12，15］。因此，為更好研究IL-27在RA中的作用機制，本研究進一步檢測CIA小鼠體內Tr1細胞表達，結果發現，IL-27干預后CIA小鼠體內Tr1細胞比例明顯提高，且小鼠體內IL-10含量也相應升高，表明IL-27可通過促進Tr1細胞及其相關抑炎因子IL-10生成進一步延緩CIA小鼠關節炎癥進展。

本研究發現，注射給予小鼠牛CⅡ膠原免疫誘導后，其體內炎癥因子，如Th17細胞、IL-17、IL-6等含量升高，且小鼠足爪關節紅腫甚至變形，表明小鼠CIA模型構建成功。經IL-27干預后，CIA小鼠關節炎癥狀明顯緩解，表現為小鼠關節紅腫程度明顯減輕，關節炎評分明顯降低，且小鼠日常活動能力明顯增強。進一步檢測發現小鼠體內Th17細胞和IL-17表達明顯下調，表明IL-27可通過抑制小鼠體內Th17細胞表達及其分泌的IL-17生成，進而緩解小鼠關節炎癥進展。研究表明，活化的Th17細胞及其分泌的IL-17在關節滑膜中浸潤是導致關節和軟骨損傷的重要原因［16-17］。體內Th17細胞與Treg形成的Th17/Treg軸在生理狀態下保持動態平衡，當機體發生病理性改變，Th17細胞增多或Tregs表達受抑制，導致Th17/Treg比例失衡，進而導致RA患者病情加重［18］。但本研究并未發現小鼠體內Treg及其特征性細胞因子TGF-β表達變化，因此推測IL-27的抗關節炎作用可能主要通過Th17相關途徑發揮作用，而非依賴Tregs相關途徑。與PICKENS等［19］在關于炎癥性腸病研究中發現的，IL-27可上調IBD小鼠脾臟Treg表達結論不同，可能與該研究與本實驗所選用疾病模型不同有關，因此，IL-27在緩解RA疾病進展中對Treg的具體作用有待進一步研究。

綜上所述，本研究表明，IL-27可通過促進Tr1細胞及其相關抑炎因子IL-10表達，同時通過抑制Th17相關途徑緩解CIA小鼠病情進展，為IL-27在RA及其他炎癥性疾病治療提供依據。