透明細胞腎細胞癌組織中miR-4313、TBX15的表達及臨床意義

蘇 計 王 剛 馮世偉

遼寧省本溪市中心醫(yī)院泌尿外科，遼寧本溪 117000

透明細胞腎細胞癌（ccRCC）是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，我國每年新發(fā)病例約6.8萬例，發(fā)病率為4.99/10萬[1-2]。ccRCC患者早期無明顯臨床表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)時已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，喪失手術(shù)價值，生存預(yù)后不佳[3-5]。因此，深入研究ccRCC發(fā)生發(fā)展機制，具有較大臨床價值。微小RNA（miR）-4313編碼基因位于9q31.3，與細胞增殖、發(fā)育、分化及代謝等過程密切相關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-4313可調(diào)控細胞內(nèi)多條信號傳導通路，在腎癌[7]、粒細胞白血病[8]等腫瘤中異常表達下調(diào)，其能通過抑制腫瘤細胞的增殖、遷移及浸潤等，發(fā)揮抑癌基因的功能。T-box轉(zhuǎn)錄因子15（TBX15）基因位于1p12，此基因?qū)儆赥-box基因家族，其編碼調(diào)控各種發(fā)育過程中的保守的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，甲狀腺癌[9]、前列腺癌[10]等腫瘤中TBX15異常表達升高，并能通過抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究通過檢測ccRCC癌組織中miR-4313及TBX15基因表達，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月—2019年12月遼寧省本溪市中心醫(yī)院（以下簡稱“我院”）診治并行手術(shù)治療的ccRCC患者93例。納入標準：①均為首次發(fā)現(xiàn)；②病理學檢查明確診斷為ccRCC；③能夠配合相關(guān)檢查和治療。排除標準：①泌尿系統(tǒng)感染、結(jié)核等疾病；②合并慢性腎病、腎功能不全；③合并腫瘤性疾病或免疫系統(tǒng)疾病；④以往有抗腫瘤治療史。93例ccRCC患者中男51例，女42例；年齡35～75歲，平均（46.7±7.2）歲；病理分級：高分化35例，中低分化58例；腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期64例，Ⅲ～Ⅳ期29例；伴遠處轉(zhuǎn)移21例，無遠處轉(zhuǎn)移72例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移76例。患者對本研究均知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2 熒光定量PCR法（qRT-PCR）檢測癌組織及癌旁組織中miR-4313及TBX15 mRNA表達

將癌組織及癌旁正常組織（距癌組織3 cm以上）剪碎后冰上研磨，加2 mL Trizol重懸。Trizol法提取組織中的RNA。以RNA作為模板，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，Narodrop檢測cDNA濃度及純度，OD260/OD280比值介于1.8～2.1之間，-20℃保存。miR-4313正向引物序列：5’-GAAAGCCCCCTGGCCC-3’，反向引物序列：5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’；以U6為內(nèi)參，正向引物序列：5’-CGACAAGACGATCCGGGT-AAA-3’，反向引物序列：5’-GGTTGAGGAGTGGGT-CGAAG-3’；TBX15正向引物序列：5’-TGACCTCTG GAAGCGGTTC-3’，反向引物序列5’-GATGTG GATCTAGGCCAGTGA-3’；以GAPDH為內(nèi)參，正向引物序列：5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’，反向引物序列：5’-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3’。qRT-PCR總體系20 μL，包括Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。TBX15反應(yīng)條件為：95℃4 min，95℃30 s，65℃30 s，72℃30 s，共35個循環(huán)。miR-4313反應(yīng)條件為：95℃30 s，95℃5 s，62℃30 s，70℃20 s，共45個循環(huán)。miR-4313及TBX15 mRNA的相對表達量以2-ΔΔCt值法表示，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.3 免疫組織化學法檢測組織中TBX15蛋白表達

將石蠟包埋的組織樣本切片，切片厚度4 μm，70℃烤2 h；二甲苯脫蠟2次；梯度乙醇水化；高壓鍋法抗原熱修復；3%雙氧水去除內(nèi)源性過氧化物酶；5%羊血清封閉；一抗4℃孵育過夜（購自Abcam公司，貨號：ab134916）；二抗（山羊抗兔IgG-HRP購自北京博奧易杰公司，貨號：BE0101）孵育2 h；DAB顯色；梯度脫水，封片鏡檢。結(jié)果判定：根據(jù)陽性表達部位的染色強度及染色面積對蛋白表達進行評估。不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分。面積＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。以染色強度評分與陽性細胞數(shù)評分的乘積計算結(jié)果。0～2分判定為陰性，3～9分為陽性。每個切片在200倍鏡下隨機選取5個視野，結(jié)果取平均值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。miR-4313與TBX15表達的相關(guān)性采用Pearson線性相關(guān)分析。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ccRCC癌組織及癌旁組織中miR-4313、TBX15 mRNA表達比較

癌組織miR-4313相對表達量明顯低于癌旁組織，而TBX15 mRNA的相對表達量明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 ccRCC癌組織及癌旁組織中miR-4313、TBX15 mRNA表達比較（）

表1 ccRCC癌組織及癌旁組織中miR-4313、TBX15 mRNA表達比較（）

注：ccRCC：透明細胞腎細胞癌；miR：微小RNA；TBX15：T-box轉(zhuǎn)錄因子15

2.2 ccRCC癌組織及癌旁組織中TBX15蛋白表達

癌組織中TBX15蛋白主要表達于細胞漿及細胞核。ccRCC癌組織及癌旁組織中TBX15蛋白表達陽性率分別為86.02%（80/93）、23.7%（22/93）。癌組織中TBX15蛋白表達陽性率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=73.028，P ＜0.001）。ccRCC癌組織及癌旁組織中TBX15蛋白表達見圖1（封三）。

圖1 ccRCC癌組織及癌旁組織中TBX15蛋白表達（免疫組化，200×）

2.3 ccRCC癌組織中miR-4313、TBX15蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

癌組織中miR-4313、TBX15蛋白在患者不同年齡、性別、病理分級、遠處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期ccRCC癌組織中miR-4313表達明顯低于Ⅰ～Ⅱ期癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期ccRCC癌組織中TBX15蛋白表達陽性率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期癌組織（P ＜0.05）。見表2。

表2 ccRCC癌組織中miR-4313、TBX15蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 ccRCC癌組織中miR-4313、TBX15 mRNA表達的相關(guān)性

應(yīng)用Pearson線性相關(guān)分析ccRCC癌組織中miR-4313與TBX15 mRNA表達的相關(guān)性，結(jié)果顯示，癌組織中miR-4313與TBX15 mRNA表達呈顯著負相關(guān)（r=-0.671，P=0.001）。

3 討論

miR-4313是近年來新發(fā)現(xiàn)的miRNA分子，編碼基因位于人類15號染色體。miR-4313的生物學功能尚不清楚，但有學者研究表明，miR-4313在惡性腫瘤、主動脈夾層等疾病中發(fā)揮重要的生物學調(diào)控功能，其能夠配對結(jié)合下游靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)，降低mRNA的穩(wěn)定性，抑制下游靶基因的表達，進而導致疾病進展[11-12]。本研究中，ccRCC癌組織中miR-4313表達較低，可能與基因啟動子的異常甲基化有關(guān)。有研究表明，腫瘤中miRNA，如miR-17、miR-4313等的啟動子區(qū)域存在異常高甲基化的現(xiàn)象，導致miRNA轉(zhuǎn)錄水平降低[13-15]。此外，ccRCC癌組織中miR-4313的表達與腫瘤分期有關(guān)，提示miR-4313的低表達參與促進ccRCC的惡性進展。有學者證實，miR-4313參與調(diào)控多種癌基因表達，腫瘤發(fā)生時miR-4313表達水平降低，導致下游靶基因同源框蛋白1表達水平升高，激活A(yù)KT信號通路，促進腫瘤的惡性進展[6,16]。

TBX15是保守的T-box基因家族的成員，該家族成員對于骨骼發(fā)育、分化等多種生物學過程都是必不可少的，如TBX15基因突變可導致顱面和骨骼缺損及骨盆性髖臼癥[17-20]。有研究表明，肝癌等腫瘤中TBX15基因的異常高表達能夠促進腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，誘導腫瘤細胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，還可促進腫瘤細胞的增殖，抑制其凋亡，是腫瘤診斷及治療的重要分子標志物[21-22]。本研究中，ccRCC癌組織中TBX15表達升高。其機制可能是腫瘤微環(huán)境中腫瘤壞死因子α 表達水平升高，激活腫瘤中NF-κB信號通路，NF-κB能夠直接結(jié)合到TBX15基因的啟動子區(qū)，促進TBX15基因的表達[9]。此外，TBX15還受到miRNA的表達調(diào)控。有研究報道，miR-212、miR-451等能夠直接結(jié)合并抑制TBX15 mRNA的表達，而腫瘤發(fā)生時miR-212的表達水平顯著降低，導致TBX15的表達上調(diào)[23-24]。本研究亦顯示，TBX15蛋白表達與腫瘤分期有關(guān)，可能是腫瘤發(fā)生時TBX15的表達增加促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡逃逸。有學者報道，TBX15作為一種T-box轉(zhuǎn)錄因子，腫瘤中TBX15表達水平升高能夠誘導抗凋亡蛋白Bcl-2表達上調(diào)，而促凋亡蛋白Bax表達下調(diào)，引起腫瘤細胞凋亡減少，腫瘤細胞增殖過度，導致腫瘤分期升高[9,24-25]。本研究中，ccRCC癌組織中miR-4313與TBX15 mRNA表達呈顯著負相關(guān)。其原因可能是腫瘤中miR-4313表達降低后，結(jié)合到TBX15 mRNA 3’ 非編碼區(qū)的能力降低，TBX15 mRNA穩(wěn)定性增加，導致TBX15表達水平上調(diào)[22]。因此，miR-4313/TBX15可能是影響ccRCC發(fā)生發(fā)展過程重要機制。

ccRCC癌組織中miR-4313表達降低，而TBX15 mRNA及蛋白表達升高，miR-4313與TBX15 mRNA表達之間呈顯著負相關(guān)。miR-4313及TBX15蛋白表達與腫瘤分期有關(guān)，兩者均參與ccRCC的發(fā)生發(fā)展，可能成為新的ccRCC早期診斷及治療的分子標志物。但兩者之間的具體作用機制及臨床意義有待大樣本深入研究。