反相高效液相色譜法測定參芪降糖膠囊中梓醇含量*

馮光軍，羅 丹，冉鳳英，楊 洋，楊光義，梅全喜，陳琴華△

（1. 廣東省深圳市寶安純中醫治療醫院藥學部，廣東 深圳 518101； 2. 湖北醫藥學院附屬東風醫院醫學實驗中心，湖北 十堰 442008）

參芪降糖膠囊是由人參莖葉皂苷、五味子、黃芪、山藥、地黃、覆盆子、麥冬、茯苓、天花粉、澤瀉、枸杞子11 味中藥材組方的復方制劑［1］，具有益氣養陰、滋脾補腎功效，主要用于治療消渴癥及2 型糖尿病。現代研究表明，參芪降糖膠囊能降低糖尿病周圍神經病變患者血清內皮素1（ET－1）、白細胞介素6（IL－6）及腫瘤壞死因子－α（TNF－α）水平，療效顯著［2－4］，能顯著降低血糖，調節血脂水平，預防糖耐量異常向糖尿病轉化［5－8］。目前對參芪降糖膠囊的質量控制主要針對人參和黃芪的活性成分，采用薄層色譜法和高效液相色譜（HPLC）法進行含量測定［9］。地黃為常用補益中藥，具有調節心血管、免疫、中樞等系統功能，以及降糖、降壓等生物活性［10－11］。以梓醇為代表的環烯醚萜苷類是地黃最主要的活性成分，具有降血糖、利尿、緩和瀉下等作用［12－13］，同為參芪降糖膠囊的主要有效成分。本研究中建立了梓醇的含量測定方法，為參芪降糖膠囊的質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC－9A 型高效液相色譜儀（日本島津有限公司），配有紫外檢測器和浙江大學開發的N2000 型色譜工作站；KQ－100DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為100 W，頻率為40 kHz）；AEU－210 型電子天平（日本島津有限公司，精度為百萬分之一）。

1.2 試藥

梓醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110808－201711，規格為每瓶20 mg，純度≥98%，供含量測定用）；參芪降糖膠囊（五O 五藥業有限公司，批號分別為1712025，1805102，1808065，規格為每粒0.35 g）；乙腈（色譜純，十堰市化學試劑廠）；水為微孔濾膜過濾純化水，其余試劑均為分析純。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Linksil HPLC Column ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈－0.1%磷酸溶液（2 ∶98，V／ V）；流速：0.8 mL／min；柱溫：30 ℃；檢測波長：205 nm；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取梓醇對照品10 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇，超聲溶解，并用甲醇定容，制成含梓醇100 μg／mL的對照品溶液。取樣品10 粒，傾出內容物，研細，取2.5 g，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇20 mL，稱定質量，超聲提取30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按處方工藝制備缺地黃的陰性對照樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定。色譜圖見圖1。結果理論板數按梓醇峰計均大于9 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。

線性關系考察：分別精密吸取2.2 項下對照品溶液（100 μg／mL）適量，置10 mL 容量瓶中，以甲醇定容，分別制成含梓醇質量濃度為1，5，10，20，50，100 μg／mL的系列對照品溶液。吸取上述溶液各10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以對照品溶液質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y ＝7 170 X－7 671，R2＝0.998 1（n ＝6）。結果表明，梓醇質量濃度在1 ～100 μg／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：吸取梓醇對照品溶液（20 μg／mL），按2.1 項下色譜條件進樣10 μL，連續進樣6 次，記錄峰面積。結果的RSD 為0.98%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為1805102）適量，研細，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h 時進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD 為1.02%（n ＝6），表明供試品溶液在12 h 內穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為1805102）適量，研細，依法制備供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定6次，記錄峰面積，并計算含量。結果平均含量為110 μg／g，RSD 為1.96%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為1805102，梓醇含量為110 μg／g）1.0 g，研細，精密稱定，依法制備供試品溶液6 份，各加入梓醇對照品溶液（100 μg／mL）1 mL，按2.1 項下色譜條件進樣10 μL，測定峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n ＝6）Tab.1 Reuslts of the recovery test（n ＝6）

2.4 樣品含量測定

取3 批（批號分別為1712025，1805102，1808065）樣品，取出內容物，研細，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣10 μL。結果3 批樣品中梓醇含量分別為110，105，108 μg／g。

3 討論

本試驗中采用反相高效液相色譜法測定參芪降糖膠囊中梓醇的含量，前期處理簡便，結果準確。對梓醇對照品溶液進行了全波長掃描，最大波長為205 nm。考察了甲醇－0.1%磷酸溶液、乙腈－0.1%磷酸溶液，結果發現，以乙腈－0.1%磷酸溶液（2 ∶98，V／ V）為流動相時，梓醇與其他成分分離良好，保留時間適中。考察了水－甲醇、甲醇、乙醇超聲提取對梓醇含量測定的影響，結果發現，用甲醇超聲提取，樣品雜質量少，提取效率較高，故選擇甲醇為提取溶劑。考察了超聲提取時間，結果超聲提取30 min 后，提取效率并未提高，故選擇甲醇超聲提取30 min。

本研究結果表明，本方法分離效果和重復性均良好，測定結果準確，回收率高，可用于參芪降糖膠囊中梓醇的含量測定。