高效液相色譜法測定產后康膏中鹽酸益母草堿含量*

徐寧寧，朱辰奇，顧 依，景榮先，周 琴，沈惠明，陳志鵬，劉 馨△

（1. 南京海辰藥業股份有限公司，江蘇 南京 215000； 2. 南京醫科大學附屬蘇州醫院藥學部，江蘇 蘇州215002； 3. 南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023）

產后惡露不絕表現為子宮收縮無力，陰道不規則出血，伴血塊或壞死蛻膜組織成分經陰道排出，持續10 d以上者，會導致感染甚至敗血癥［1］。產后康膏處方來源于衛生部部頒藥品標準（中藥成方制劑第十五冊），用于治療產后或流產后貧血和惡露不凈，療效顯著。產后康膏由益母草、黃芪、黨參、當歸、丹參、神曲、陳皮、香附、烏藥、木香、生地黃、熟地黃、砂仁、杜仲、澤瀉、甘草、白芍、山楂、谷芽、麥芽20 味中藥組方。君藥益母草味苦、辛，性微寒，用于月經不調，痛經、經閉、惡露不盡，水腫尿少等，對子宮收縮和凝血系統具有雙向調節作用［2－5］。《本草衍義》中記載益母草“治產前產后諸疾，行血養血”，《本草蒙筌》中記載益母草“去死胎，安生胎，行瘀血，生新血”［6－8］。產后康膏在部頒藥品標準中僅以薄層色譜鑒別和膏劑密度作為檢查項，不利于藥品質量的控制，有必要尋求新的檢查項，在符合院內制劑快速檢查要求的同時，提高產后康膏質量標準。本研究中以鹽酸益母草堿作為產后康膏的指標成分，采用高效液相色譜法測定不同批次產后康膏中鹽酸益母草堿的含量，以作為其質量控制方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BS－124S 型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；LC－2010A HT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；MicroCL 型離心機（美國賽默飛世爾公司）；SynergyUV 型純水儀（美國密理博公司）；超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為50 kHz）。

1.2 試藥

甲醇、乙腈（色譜純，加拿大Calepure 公司）；磷酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；鹽酸益母草堿對照品（含量大于98%，中國食品藥品檢定研究院，批號為110823－201807）；產后康膏（蘇州市立醫院院內制劑，批號分別為20200414，20200420，20200426）；水為實驗室自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100－S－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈－0.2%磷酸溶液（22 ∶78，V／ V）；流速：1.2 mL／min；檢測波長：280 nm；進樣量：10 μL；柱溫：20 ℃。

2.2 溶液制備

取樣品2.64 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇20 mL，超聲處理（功率為250 W，頻率為33 kHz）30 min，稱定質量，用甲醇補足減失的質量，即得供試品溶液。以處方工藝制備不含益母草的樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取鹽酸益母草堿對照品適量，精密稱定，置10 mL 棕色容量瓶中，加75%甲醇制成質量濃度為1.125 mg／mL 的對照品溶液，置4 ℃避光保存。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2 項下3 種溶液，加75%甲醇稀釋，0.45 μm 微孔濾膜濾過，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果見圖1。可見，相鄰色譜峰之間分離度均大于1.5，與對照品溶液色譜對應位置上有相同保留時間的色譜峰，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。

線性關系考察：取2.2 項下對照品溶液，用75%甲醇稀釋成質量濃度為1.125 0，0.562 5，0.225 0，0.112 5，0.022 5，0.004 5 mg／mL 的系列對照品溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以質量濃度（X，mg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y ＝15 161 107.99 X ＋15 832.73，R2＝0.999 9（n ＝6）。結果表明，鹽酸益母草堿質量濃度在0.004 5 ～1.125 0 mg／mL 范圍與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取樣品（批號為20200414），依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，重復進樣6 次，記錄峰面積。結果的RSD 為0.29%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為20200414），依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算鹽酸益母草堿含量。結果的RSD 為1.37%（n ＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為20200414），依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h 時進樣測定，計算鹽酸益母草堿峰面積。結果的RSD 為0.96%（n ＝8），表明供試品溶液在24 h 內基本穩定。

加樣回收試驗：取樣品（批號為20200414）適量，平行6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，進樣測定，并計算回收率。結果見表1。

2.4 樣品含量測定

取 3 批（ 批 號 分 別 為 20200414，20200420，20200426）樣品，依法制備供試品溶液，平行3 份，進樣，測定峰面積，用外標法計算含量。結果見表2。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

表1 鹽酸益母草堿加樣回收試驗結果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test of leonurine hydrochloride（n ＝6）

表2 樣品中鹽酸益母草堿含量測定結果（n ＝3）Tab.2 Content determination of leonurine hydrochloride in different batches of Chanhoukang Paste（n ＝3）

3 討論

3.1 指標成分選擇

益母草堿是產后康膏方中君藥益母草的主要有效成分，通過抗血小板凝聚達到活血化瘀的作用，直接清除自由基和抑制活性氧（ROS）的產生。通過核因子激活的B 細胞的κ－輕鏈增強（NF－κB）信號通路，抑制腫瘤壞死因子－α（TNF－α）介導的炎癥，可減輕大腸桿菌誘導的乳腺炎［9－15］。因此，選擇鹽酸益母草堿作為產后康膏的指標成分。研究結果表明，鹽酸益母草堿含量較高，穩定性較好，可作為指標成分。

3.2 樣品處理方式選擇

前期研究中，選擇甲醇超聲提取、乙醇超聲提取和乙酸乙酯萃取3 種方式處理樣品。經甲醇超聲和乙酸乙酯萃取，鹽酸益母草堿的提取率較高，定量準確。甲醇超聲提取更便捷，適用于院內制劑的快速檢測，故選擇甲醇超聲處理。

3.3 色譜條件選擇

前期研究中發現，產后康膏按照2015 年版《中國藥典（一部）》中益母草的鹽酸益母草堿高效液相色譜法測定含量，出現明顯的干擾峰，色譜峰形存在明顯拖尾，且分離度差。優化色譜條件，流動相為乙腈－0.2%磷酸溶液（22 ∶78，V／ V），檢測波長為280 nm，流速為1.2 mL／min，柱溫為20 ℃。結果表明，鹽酸益母草堿的色譜峰分離度高，拖尾現象顯著改善，且定量準確。

3.4 方法評價

產后康膏現有理化鑒別和檢查項不足以對制劑進行質量控制。使用高效液相色譜法測定產后康膏中鹽酸益母草堿的含量，具有較好的準確性和先進性，保證產后康膏質量的同時，提升其臨床應用的安全性。該方法專屬性強，準確度高，排除了干擾成分，且檢測用時短，適用于院內制劑產后康膏的快速檢測。