微波消解－原子吸收火焰法測定肝精補血素口服液中總鐵含量*

申二永，金建聞，李 楊

（1. 河南省食品藥品檢驗所·國家藥品監督管理局中藥材及飲片質量控制重點實驗室，河南 鄭州 450018；2. 河南省食品藥品審評查驗中心，河南 鄭州 450018）

肝精補血素口服液是由肝精膏（由鮮豬肝提取）、黨參、枸杞子、枸櫞酸鐵銨、維生素B15 種原料制成的非處方藥，具有養血益氣、滋補肝腎功效，對于緩解貧血癥狀和提升血紅蛋白水平療效較好，可用于成人及兒童缺鐵性貧血的治療。肝精補血素口服液對改善缺鐵性貧血的癥狀，顯著強于西藥鐵制劑［1－3］。枸櫞酸鐵銨為有機鐵劑，是該方中核心的造血原料，故需控制好總鐵含量。肝精補血素口服液現行質量標準為《衛生部藥品標準中藥成方制劑（第十三冊）》（WS3－B－2530－97）［4］。經實際檢驗及調研生產企業，現行標準的方法存在含量偏低和重復性差的問題，各相關生產企業均建議修訂或提高該檢驗方法。本研究中建立了微波消解－原子吸收火焰法測定肝精補血素口服液中總鐵含量的方法［5－7］。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AAS－ZEEnit700 P 型原子吸收分光光度計（德國耶拿分析儀器股份公司）；GBC SavantAA 型原子吸收分光光度計（澳大利亞GBC 公司，配有AS－1 型鐵空心陰極燈）；MARS6 型微波消解儀（美國CEM 公司）；Milli－Q型超純水處理系統（美國Millipore 公司）。

1.2 試藥

鐵元素標準溶液（標示質量濃度為1 000 mg／L，批號為19C006－8，國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；65%純硝酸（優級純，德國Merck 公司）。肝精補血口服液（廠家A，河南靈佑藥業股份有限公司，批號分別為20140805，20150510，20150805；廠家B，河南省奧林特藥業有限公司，批號分別為170101，170102，180901，180902，190801，191213，200301，200302；廠家C，開封康諾藥業有限公司，批號分別為H18010，H18012，H18013，H18014，H18015，H18016，H18017，H18018，H18019，H18020）。

2 方法與結果

2.1 元素測定條件

測定波長：248.3nm；燈電流：4mA；狹縫寬度：0.2 nm。采用對應的空心陰極燈，火焰原子吸收法測定鐵（Fe），氘燈背景校正［8－11］。

2.2 微波消解程序升溫條件［12－13］

詳見表1。

2.3 溶液制備

精密量取本品1 mL，置適宜的聚四氟乙烯消解罐內，加入硝酸10 mL，混勻，蓋好蓋子，置微波消解爐內按程序升溫條件進行消解。消解完全后，趕酸，剩余液體用2% 硝酸溶液轉移至50 mL 容量瓶中，精密量取2 mL，用2%硝酸溶液稀釋至20 mL 容量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。同法制備試劑空白溶液。

表1 微波消解程序升溫條件Tab.1 Temperature－programmed conditions of microwave digestion

2.4 方法學考察

標準曲線建立：取鐵元素標準溶液（質量濃度為1 000 mg／L），用2%硝酸溶液分別稀釋制成質量濃度為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg／L 的系列標準溶液，以質量濃度（X，mg／L）為橫坐標、吸光度（Y）為縱坐標繪制標準曲線。按2.1 項下條件進行測定，得線性回歸方程Y ＝0.006 9 X ＋0.062 7，r ＝0.999 2（ n ＝6）。結果表明，總鐵質量濃度在0.5 ～5.0 mg／L 范圍內與吸光度線性關系良好。

精密度試驗：取適量鐵元素標準溶液，加2%硝酸溶液，配制得質量濃度為3 mg／L 的對照品溶液，按2.1項下測定條件，連續測定6 次。結果的RSD 為1.42%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為H18016）6 份，按2.3項下方法制備供試品溶液并測定。結果鐵吸收度的RSD 為1.13%（n ＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取樣品（開封康諾藥業有限公司，批號為H18016），按供試品溶液制備方法制備，分別于0，2，4，8，12，24 h 時進行測定。結果鐵吸收度的RSD 為1.01%（n ＝6），表明供試品溶液在24 h 內穩定。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為H18016，鐵質量濃度為1.498 mg／mL）0.5 mL，量取9 份，分別精密加入鐵元素標準溶液（質量濃度為1 000 mg／L）0.4，0.5，0.6 mL，按2.3 項下方法制備供試品溶液。精密吸取對照品溶液與供試品溶液，分別注入液相色譜儀，測定鐵的含量，計算回收率。結果見表2。

2.5 不同人員操作及新舊方法結果比較

原容量法標準：精密量取樣品10 mL，置250 mL 碘量瓶中，加水10 mL，加硫酸溶液（1 ∶1，V／ V）2 mL，搖勻，放冷至15℃，加入1%高錳酸鉀溶液6mL，鹽酸15mL，40%碘化鉀溶液5 mL，搖勻，在暗處放置15 min，加水50 mL，用硫代硫酸鈉液（0.05 mol／L）滴定，近終點時加入淀粉指示液2 mL，繼續滴定至紫色消失，并將滴定結果用空白試驗校正（試劑中不加1%高錳酸鉀液），即得每1 mL 硫代硫酸鈉液質量濃度（0.05 mol／L）相當于2.792 5 mg 的鐵溶液。取樣品13 批，分別按原容量法標準及原子吸收火焰法操作，對不同人員操作及新舊方法測定結果進行比較。結果見表3。

表2 加樣回收試驗結果（n ＝9）Tab.2 Results of the recovery test（n ＝9）

表3 不同人員操作及新舊方法測定結果比較（mg／mL）Tab.3 Comparison of the results between two operators with new and old methods（mg／mL）

2.6 不同品牌儀器測定結果比較

取樣品3 批（批號分別為H18016，H18017，H18018），按2.3 項下方法制備供試品溶液，采用火焰法測定，分別采用德國耶拿AAS－ZEEnit700P 型、澳大利亞GBC SavantAA型原子吸收分光光度計，按2.1 項下條件測定。結果見表4。表明使用不同品牌儀器的含量測定結果穩定。

2.7 樣品含量測定

取21 批樣品，依法制備供試品溶液，按2.1 項下元素測定條件和2.2 項下微波消解程序升溫條件測定樣品中總鐵的含量。結果見表5。

3 討論

3.1 容量法問題和限度規定不嚴謹

1）試驗方法。查閱現行部頒標準的起草說明，該標準采用的容量法主要參照了枸櫞酸鐵銨的含量測定方法，原理為枸櫞酸鐵銨加酸變成三價鐵離子（Fe3＋），利用Fe3＋在酸性條件下氧化碘化鉀析出碘，用硫代硫酸鈉溶液滴定，以測定含量。由于肝精補血素口服液為復方制劑，該方法并不完全適用于該劑型的測定。由表3可見，同一批樣品不同人員測定結果差距大，結論也不同，易造成市場監督抽驗出現爭議。分析原因，滴定終點判斷是顏色由黃紫色變成淡黃色（標準規定滴定至紫色消失），由于輔料和其他藥味的干擾（該藥品性狀為暗紅色的澄清液體），造成該滴定終點不易判斷，導致測定結果因人而異。同時，3 家生產企業均反映樣品在保質期內，枸櫞酸鐵銨可能會逐漸與其他輔料發生反應，形成其他價態，導致部分消耗，而原容量法的前處理并不能完全將所有價態的鐵轉化為Fe3＋，易造成近效期的樣品含量測定結果進一步降低。

表4 不同品牌原子吸收分光光度計測定結果比較（mg／mL）Tab.4 Comparison of results between two brands of atomic absorption spectrophotometers（mg／mL）

表5 樣品總鐵含量測定結果（mg／mL）Tab.5 Results of content determination of total iron in the samples（mg／mL）

2）限度規定。標準規定限值為每1 mL 不得少于1 mg，按照檢驗結果修約，其范圍為0.6 ～1.4 mg，范圍過寬，同樣會導致市場監督抽驗出現爭議。

3.2 投料問題

經調研生產企業發現，企業在實際生產中購進的枸櫞酸鐵銨中總鐵的含量為20.5% ～22.5%，根據處方投料5 g 枸櫞酸鐵銨制成成品，成品中總鐵的含量應為每1 mL 含1.025 ～1.125 mg。由于原標準存在3.1 項下的2 個問題，3 家生產企業在實際生產中，為避免產品總鐵含量低于限度規定或避免爭議，實際投料均為6 ～8 g，投料量超出處方規定的20% ～60%。

3.3 樣品前處理方式考察和方法選擇

根據投料量折算，樣品需稀釋500 倍，考察了直接稀釋法、直接稀釋加離子釋放劑（氯化鍶）法、濕法消解及微波消解法。結果表明，直接稀釋法和直接稀釋加離子釋放劑（氯化鍶）法，上機樣品溶液盡管有機物含量低于1%，但由于樣品是直接稀釋，口服液中的糖分和其他輔料會干擾測定，造成測定數據不穩定，同時回收率過高，超出相關技術要求的規定，故不采用上述兩法。濕法消解和微波消解法回收率均較理想，可采用該兩法，考慮到濕法消解時間較長及所需試劑量較多，故優先選擇微波消解法?？傝F的測定現行方法主要有容量法、原子吸收火焰法、電感耦合等離子體－質譜法，考慮到鉻超標藥用膠囊事件后，各藥品生產企業均配備了原子吸收分光光度計及微波消解儀，而電感耦合等離子體－質譜儀價格昂貴，使用成本偏高，故優先選用微波消解－原子吸收火焰法測定總鐵含量。

3.4 限度擬訂

處方中枸櫞酸鐵銨投料量為5 g，成品理論每1 mL應含總鐵1.025 ～1.125 mg，參考原標準“本品含枸櫞酸鐵銨，以鐵計算，每1 mL 不得少于1 mg”，建議限度按照理論值的90%計算，擬定為“本品含枸櫞酸鐵銨，以鐵計算，每1 mL 不得少于0.90 mg”。

3.5 方法評價

采用新建立的微波消解－原子吸收火焰法測定總鐵的含量，避免了原容量法存在的終點不易判斷的問題及枸櫞酸鐵銨的損失問題，解決了企業困擾的投料問題，方法簡便，重復性好，精密度高，可用于肝精補血素口服液的質量控制。