復方獨活益腎合劑質量標準提升研究

李德林，任路路，韓 雙

（安徽省太和縣中醫院中藥制劑室，安徽 阜陽 236600）

中醫學認為，腰肌勞損多屬“痹癥”范疇，多因久痹而致肝腎兩虛，氣血不足而發。臨床研究表明，中醫藥治療慢性腰肌勞損不僅療效顯著，作用持久，且不易復發［1］。復方獨活益腎合劑系我院名老中醫根據中醫學理論，結合臨床實踐研制而成的院內制劑，由獨活、白芍、秦艽、桂枝、防風等15 味中藥組方，具有補肝腎、益氣養血、祛風止痛功效，主要用于治療腰肌勞損、腰膝冷痛及肢節屈伸不利，臨床療效較好。現行復方獨活益腎合劑執行標準較簡單，僅采用高效液相色譜（HPLC）法測定蛇床子素的含量，而蛇床子素水提取工藝條件下轉移率較低，在實際控制該制劑質量時存在一定缺陷。此外，單一成分含量測定已很難保證復雜成方制劑的質量，多組分含量測定更能體現成方制劑的內在質量［2］。為進一步控制復方獨活益腎合劑的質量，保證臨床療效，本研究中建立了獨活、白芍、秦艽的薄層色譜（TLC）法，芍藥苷含量測定的HPLC 法。現報道如下。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

XSE105DU 型電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度為十萬分之一）；Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（配備紫外檢測器，美國賽默飛世爾公司）；ZF－2 型三用紫外儀（上海市安亭電子儀器廠）；DHG－9055A 型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HH－S4型數顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）；KQ－300DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；硅膠G 板（青島海洋化工廠分廠）；硅膠G254板（煙臺市化學工業研究所）。

1.2 試藥

秦艽對照藥材（批號為121199－201003），獨活對照藥材（批號為120940－201612），芍藥苷對照品（批號為110736－201943，純度為95.10%），均購于中國食品藥品檢定研究院；復方獨活益腎合劑（規格為每瓶250 mL，本院中藥制劑室自制，批號分別為20052301，20052501，20052701）；獨活、白芍、秦艽、桂枝、防風等15 味中藥飲片均購于安徽金正元中藥飲片有限公司；乙腈為色譜純，水為純化水，甲醇、乙醚、正丁醇等其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

獨活：分別取3 批（批號分別為20052301，20052501，20052701）樣品，各20 mL，加無水乙醚振搖提取2 次，每次20 mL，合并乙醚液，保留水液層備用，揮干乙醚液，殘渣加乙醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液；另取獨活對照藥材2 g，加乙醇10 mL，水浴加熱，回流提取2 h，放冷，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為對照藥材溶液；再按復方獨活益腎合劑制備工藝制備不含獨活的陰性樣品，同法制得缺獨活的陰性對照品溶液。照2015 年版《中國藥典（四部）》通則0502 試驗，吸取上述3 種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（30 ～60 ℃）－乙醚－醋酸（10 ∶10 ∶0.5，V／ V／ V）為展開劑［3－4］，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與獨活對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，斑點清晰，分離效果較好，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

白芍：取獨活項下乙醚提取后的水溶液，置已處理好的聚酰胺層析柱（規格為5 g，內徑為1.5 cm）上，水液沖至無色，收集洗脫液，水浴濃縮至30 mL，用水飽和的正丁醇提取2 次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液；另取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液，作為對照品溶液；再按復方獨活益腎合劑制備工藝制備不含白芍的陰性樣品，同法制得缺白芍的陰性對照品溶液。照2015 年版《中國藥典（四部）》通則0502 試驗，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（40 ∶5 ∶10 ∶0.2，V／ V／ V／ V）為展開劑［5－6］，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，熱風吹至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與芍藥苷對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，斑點清晰，分離效果較好，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

秦艽：分別取3 批（批號分別為20052301，20052501，20052701）樣品，各30 mL，加無水乙醇70 mL，靜置，過夜，離心，取上清液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液；另取秦艽對照藥材0.5 g，加甲醇50 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇10 mL 使溶解，作為對照藥材溶液；再按復方獨活益腎合劑制備工藝制備不含秦艽的陰性樣品，同法制得缺秦艽的陰性對照品溶液。照2015 年版《中國藥典（四部）》通則0502 試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G254薄層板上，以乙酸乙酯－甲醇－水（20 ∶2 ∶1，V／ V／ V）為展開劑［7－9］，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與秦艽對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，斑點清晰，且陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件［10－12］與系統適用性試驗

圖1 薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatograms

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

色譜柱：Welch ZapchromTMC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）－0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～16 min 時15%A，16 ～25 min 時15%A ～70%A，25 ～35 min 時70%A ～15%A）；流速：1.0 mL／min；柱溫：30 ℃；檢測波長：230 nm；進樣量：5 μL。理論板數按蛇床子素峰計應不低于2 000。

2.2.2 溶液制備

量取芍藥苷對照品18.98 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入適量甲醇溶解，并定容，搖勻，即得質量濃度為0.361 0 mg／mL 的對照品貯備液。再精密量取上述對照品貯備液1 mL，置10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得質量濃度為0.036 1 mg／mL 的對照品溶液。精密量取樣品2 mL，置20 mL 容量瓶中，加稀乙醇15 mL，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）20 min，放冷，再加入稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取缺白芍藥材的陰性樣品，依法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：按2.2.1 項下色譜條件，分別吸取2.2.2 項下供試品溶液、芍藥苷對照品溶液和陰性對照品溶液各5 μL，進樣測定。色譜圖見圖2。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間內出現芍藥苷色譜峰，且芍藥苷分離度及拖尾因子均符合要求，陰性對照無干擾，表明專屬性良好。

線性關系考察：分別吸取2.2.2 項下芍藥苷對照品溶液1，2，5，8，10，15 μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以芍藥苷對照品進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y ＝0.021 6 X ＋0.092，r ＝0.999 9（n ＝6）。結果表明，芍藥苷進樣量在36.10 ～541.50 μg 范圍與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2.2 項下芍藥苷對照品溶液（質量濃度為0.036 1 mg／mL）適量，按2.2.1 項下色譜條件連續測定6 次，記錄峰面積。結果芍藥苷平均峰面積為4.072 7，RSD 為0.25%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為20052501）樣品，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 時進樣測定，記錄峰面積。結果芍藥苷平均峰面積為4.075 8，RSD 為0.22%（n ＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內較穩定。

重復性試驗：精密量取同一批（批號為20052501）樣品，共6 份，按2.2.2 項下方法平行制備6 份供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果芍藥苷平均峰面積為4.115 3，RSD 為0.77%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品（批號為20052501）6 份，每份1 mL，置20 mL 容量瓶中，分別加入芍藥苷對照品貯備液（質量濃度為0.361 0 mg／mL）各1 mL，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n ＝6）

2.2.4 樣品含量測定及含量限度確定

通過測定投料前處方中白芍飲片及3 批（批號分別為20052301，20052501，20052701）樣品中芍藥苷的含量，計算芍藥苷的轉移率。結果樣品中芍藥苷的含量分別為0.369 2，0.3725，0.3758mg／mL，平均含量為0.3725mg／mL。生產原料白芍中芍藥苷的含量為3.0 %。因處方中每1 mL含白芍生藥0.04 g，相當于每1 mL 含芍藥苷1.2 mg，平均轉移率為31.04 %。根據2015 年版《中國藥典（一部）》規定，白芍飲片中芍藥苷的含量不得少于1.20%。制成制劑后相當于每1 mL 不得少于0.47 mg，結合芍藥苷的平均轉移率，應不少于0.145 9 mg，再結合多批制劑含量測定結果及工業化大生產，故暫定該制劑每1 mL 含芍藥苷不得低于0.20 mg。

3 討論

原標準獨活TLC 項下，供試品的處理采用樣品蒸干加適量乙醇超聲提取，顯色時噴以8%磷鉬酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，主斑點分離雖好，但背景顏色較深，且操作較復雜，尤其蒸干較耗時。參考相關文獻，本研究中根據獨活所含化學成分的理化性質，采用乙醚提取，置紫外光燈下檢視，結果顯色效果較好，且操作簡單，而乙醚提取后的水液層又可繼續為白芍TLC 鑒別所用。

原標準白芍TLC 項下，供試品的處理以水飽和的正丁醇萃取，但在實際顯色中，供試品中芍藥苷分離效果不太理想，在芍藥苷斑點處有其他成分覆蓋，故首先對展開劑進行了優化，但改變甚微，考慮到供試品所含成分復雜的可能性，在原處理過程中增加了聚酰胺層析純化步驟。結果顯示，供試品中芍藥苷在原展開劑條件下，分離效果較好。

對秦艽進行TLC 鑒別時，比較了2 種顯色系統，一種是硅膠G 板，以乙酸丁酯－甲醇－水（20 ∶2 ∶1，V／ V／ V）為展開劑，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰；另一種為硅膠G254板，以乙酸乙酯－甲醇－水（20 ∶2 ∶1，V／ V／ V）為展開劑，置紫外光燈下檢視。結果顯示，在使用G254板置紫外光下檢視時，主斑點清晰，且操作更簡便。

此外，本研究中還對方中防風、桂枝、熟地黃、桑寄生、茯苓等藥味進行了TLC 鑒別。結果發現，防風、桂枝、熟地黃及茯苓陰性對照有干擾，桑寄生、杜仲及其他藥物主斑點不清晰，有待后續進一步研究，故暫未納入復方獨活益腎合劑的質量標準。

考察了不同提取溶劑甲醇、50%甲醇和稀乙醇超聲提取對芍藥苷含量測定的影響［12－14］。結果發現，樣品加入甲醇后呈混懸狀態，吸附嚴重，提取效果較差；50%甲醇和稀乙醇比較發現，稀乙醇提取率較高。考察了不同超聲時間（10，20，30 min）對芍藥苷含量測定的影響。結果顯示，稀乙醇超聲20 min 的芍藥苷含量較超聲10 min 高，而與超聲30 min 相差不大，表明超聲20 min 可提取完全。故選擇稀乙醇超聲20 min 為最佳提取方法。考察了不同流動相（乙腈－水和甲醇－水）對芍藥苷含量測定的影響［11－12］。結果發現，有機相為乙腈時，芍藥苷理論板數較甲醇系統高，且出峰時間較短；無機相為磷酸水溶液時，芍藥苷色譜峰形對稱性及分離度更好。考察了不同品牌色譜柱（Hypersil ODS2 柱，Wonda Cract ODS2 柱及Welch ZapchromTMC18柱）對芍藥苷含量測定的影響。結果發現，Hypersil ODS2 柱上芍藥苷分離度較差，Welch ZapchromTMC18柱較Wonda Cract ODS2 柱出峰時間短，且分離效果更佳。故選擇以乙腈－0.1%磷酸溶液和Welch ZapchromTMC18柱作為最佳流動相和色譜柱。

綜上所述，本研究中建立的獨活、白芍及秦艽的TLC 法陰性對照無干擾，斑點清晰，且專屬性較強；芍藥苷的HPLC 含量測定方法簡便易行，重復性較好，可用于提升復方獨活益腎合劑的質量標準。