60Co－γ 射線輻照滅菌對蜈蚣藥粉品質的影響研究*

韓振明，關永霞，張 微，馬 云，張貴民

（1. 魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006； 2. 中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；3. 魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276006）

蜈蚣為蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch 的干燥體，可息風鎮痙、通絡止痛、攻毒散結［1］，含有蛋白質、多肽、氨基酸、脂肪酸、多糖、微量元素等成分，具有抗腫瘤、鎮痛、調節免疫、抑菌［2－6］等多種藥理活性。蜈蚣生粉入藥的中藥處方制劑有多種，如脈絡舒通丸、蝎蜈顆粒、蜈蚣敗毒飲等，可用于多種疾病的治療［7－10］。動物藥材中的多肽、多糖等成分為微生物的繁殖提供了良好的生長環境，在加工、貯存過程中極易霉變，導致微生物含量超標，對臨床的用藥安全產生極大威脅，故中藥處方制劑生產過程中藥材滅菌的前處理尤為重要。現階段，已有較多射線相關研究及應用，60Co－γ 射線多見于醫學診斷及工業探測領域［11－12］，在食品藥品的消毒滅菌中也有應用。60Co－γ 射線輻照滅菌法已應用于多種藥材飲片的滅菌，高效，操作簡單，穿透力強，速度快，可用于含熱敏性成分藥材的滅菌，具有滅菌徹底、無污染、無殘留等優勢。有人對多種藥材進行60Co－γ 射線輻照滅菌法的可行性研究，如黃精、地黃、龍膽、黃芩、天南星、蟬蛻等［13－14］。劉濱思等［15］曾考察3 種滅菌方法對蜈蚣有效成分及沙門菌滅菌效果的影響，與干熱滅菌、濕熱滅菌相比，60Co－γ 射線輻照滅菌效果最好，但未對蜈蚣藥粉輻照滅菌劑量進行優化研究。本研究中探討了不同劑量60Co－γ 射線輻照滅菌對蜈蚣藥粉8 種核苷成分及微生物指標的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與菌種

儀器：Agilent 1100 型高效液相色譜（HPLC）儀［包括二極管陣列檢測器（DAD）、四元低壓梯度泵、Agilent Open Lab 型色譜工作站，安捷倫科技有限公司］；Toledo LE204E 型電子分析天平（精度為十萬分之一），01193－YP601N 型電子分析天平（精度為萬分之一），均購于梅特勒－托利多集團；KQ5200E 型數控超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；JD－CJ－1A 型超凈工作臺（蘇州金大凈化工程設備有限公司）；BJPX－200 型生化培養箱（濟南翔天生物科技有限公司）；粉碎機；80 目藥篩。

試藥：蜈蚣購于亳州藥材市場，經魯南厚普制藥有限公司質檢中心高級工程師范建偉鑒定為正品，符合2015 年版《中國藥典（一部）》來源規定；乙腈（批號為20185187），甲醇（批號為20193307），均為色譜純，購于賽默飛世爾科技有限公司；異丙醇（色譜純，批號為181217871G），磷酸（色譜純，批號為191115647F），甲醇（分析純），均購于南京化學試劑股份有限公司；有機濾頭（愛西默科技有限公司，孔徑為0.22 μm）。

菌種：胰酪大豆胨瓊脂（批號為HB4114－04），沙氏葡萄糖瓊脂（批號為HB025381），均購于青島海博生物技術有限公司；大腸埃希菌（菌號為43094，成都生物制品研究所）；乙型副傷寒沙門菌（菌號為50699，中國醫學細菌保藏管理中心）。

1.2 方法

輻照滅菌方法：將蜈蚣藥材粉碎，過80 目藥篩，保存，備用。稱取藥粉15 份，每份200 g，以無菌自封袋密封，分別編號1 ～15 號，分為5 組進行試驗，每組3 份。參考原國家食品藥品監督管理總局《中藥輻照滅菌技術指導原則》（2015 年第86 號）及文獻［16］，得知中藥最大總體平均輻照劑量不超過10 kGy，故輻照試驗設計如下。蜈蚣藥粉1 ～3 號無操作，為陰性對照組（0 kGy60Co－γ 射線）；其余12 份（4 ～15 號）分別以4，6，8，10 kGy60Co－γ 射線進行動態輻照滅菌操作，為試驗組；菌種活化培養為對照組。觀察并記錄試驗組與對照組的藥粉外觀性狀。

藥典檢查指標測定：照2015 年版《中國藥典（一部）》藥材蜈蚣項下［1］要求，對經不同劑量60Co－γ 射線輻照滅菌的蜈蚣藥粉進行檢查項測定，包括水分、總灰分、酸不溶性灰分、酸溶性浸出物、重金屬及有害元素、黃曲霉毒素等。

微生物限度檢查：照2015 年版《中國藥典（四部）》通則1105 及通則1106［17］，對經不同劑量60Co－γ 射線輻照滅菌的蜈蚣藥粉進行微生物限度檢查，包含需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數等，同時按上述檢查方法對大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌進行活化及接種培養計數。

化學成分含量測定：張琪等［18］的研究中，采用HPLC－DAD 法對經不同劑量60Co－γ 射線輻照滅菌的蜈蚣藥粉的化學成分進行定量分析，包括胞嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、2′－脫氧肌苷、胸苷8 種。以上8 種核苷類成分分離良好，在一定質量濃度內的線性關系良好（r ＞0.999），精密度試驗、重復性試驗、穩定性試驗結果的RSD 均小于3.0%，準確度試驗在95% ～102%范圍內。

1.3 統計學處理

采用Excel 軟件和SPSS 19.0 統計學軟件分析，包括方差分析（ANOVA）和直觀分析。

表1 不同60Co－γ 射線輻照劑量的蜈蚣藥粉藥典檢查指標測定結果Tab.1 Determination of inspection indexes of Scolopendra subspinipes mutilans medicinal powder（according to the Chinese Pharmacopoeia）sterilized by different doses of 60Co－γ－ray irradiation

2 結果

2.1 滅菌后性狀

經觀察，各批次蜈蚣藥粉滅菌前后外觀性狀均無明顯差異，藥粉顯灰綠色，有刺鼻腥臭味；5 個試驗組蜈蚣藥粉的形態、顏色、氣味均一穩定。

2.2 藥典檢查指標測定結果

結果見表1 和表2。可見，各試驗組蜈蚣藥粉中水分、總灰分、酸不溶性灰分、總黃曲霉毒素、酸溶性浸出物含量、重金屬及有害元素各指標均符合2015 年版《中國藥典（一部）》項下限度要求，各試驗組間無顯著差異（P ＞0.05）。

2.3 微生物限度檢查結果

結果見表3。可見，未經60Co－γ 射線輻照的陰性對照組需氧菌總數為10 000 cfu／g，霉菌和酵母菌總數為120 cfu／g，耐膽鹽革蘭陰性菌個數小于10 cfu／g，未檢出大腸埃希菌與沙門菌，其中需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數遠超過2015 年版《中國藥典（四部）》標準（需氧菌總數不得超出3 500 cfu／g，霉菌和酵母菌總數不得超出50 cfu／g）；經4 kGy 以上輻照劑量滅菌的試驗組需氧菌總數急劇降低，較陰性對照組減少了87%，需氧菌總數與輻照劑量呈負相關，隨著輻照劑量的增加，需氧菌總數迅速減少，輻照劑量增加至10 kGy 時，需氧菌總數降至小于10 cfu／g；霉菌和酵母菌總數經4 kGy60Co－γ 射線輻照滅菌后總數比陰性對照組降低了25%，繼續增加輻照劑量，霉菌和酵母菌總數持續降低，最后降至輻照劑量為8 kGy 時的10 cfu／g 以下；2015 年版《中國藥典（四部）》要求蜈蚣藥材中耐膽鹽革蘭陰性菌不得大于100 cfu／g，5 個試驗組中，耐膽鹽革蘭陰性菌含量均小于10 cfu／g，符合要求。此外，試驗過程中無論是否接受60Co－γ 射線輻照滅菌，均未檢出大腸埃希菌與沙門菌，由菌種活化后在相同培養條件下接種培養的樣品可檢出大腸埃希氏菌與沙門菌（見表3 中對照試驗數據）。

表3 不同60Co－γ 射線輻照劑量的蜈蚣藥粉衛生學指標測定結果（cfu／g）Tab.3 Determination of hygienic indexes of Scolopendra subspinipes mutilans medicinal powder sterilized by different doses of 60Co－γ－ray irradiation（cfu／g）

依照非無菌含藥材原粉的中藥制劑的微生物標準，經6 kGy 以上輻照劑量滅菌的試驗組的微生物限度均符合含生藥粉口服固體制劑衛生學標準。綜上分析，并考慮工業生產中的滅菌成本問題，8 kGy 及8 kGy 以上劑量輻照滅菌效果最佳。

表4 不同60Co－γ 射線輻照劑量的蜈蚣藥粉8 種核苷類成分含量測定結果（n ＝3）Tab.4 Determination of eight nucleosides in Scolopendra subspinipes mutilans medicinal powder sterilized by different doses of 60Co－γ－ray irradiation（n ＝3）

2.4 化學成分測定結果

結果見表4。可見，不同試驗組蜈蚣藥粉中次黃嘌呤和黃嘌呤含量明顯高于其他6 種核苷類成分，15 個批次樣品中均含有上述8 種成分，各試驗組間含量無顯著差異（P ＞0.05）；且不同輻照劑量5 個試驗組中，8 種核苷類成分總含量均處于同一水平，且無顯著差異（P ＞0.05）。

3 討論

本試驗中探討了不同劑量60Co－γ 射線輻照滅菌對蜈蚣藥粉質量的影響，結果5 個試驗組中蜈蚣藥粉形態、顏色、氣味均一穩定；水分、總灰分、酸不溶性灰分、黃曲霉毒素、酸溶性浸出物含量、重金屬及有害元素各指標各試驗組間均無顯著差異；5 個試驗組樣品中均含有胞嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、2′－脫氧肌苷、胸苷8 種核苷類成分，不同輻照劑量5 個試驗組中8 種核苷類成分總含量均處于同一水平，差異不顯著，表明輻照滅菌對蜈蚣藥粉中活性成分的含量無影響。

不同劑量60Co－γ 射線輻照滅菌對蜈蚣藥粉中微生物數量影響極為明顯，各試驗組間需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數差異顯著；輻照劑量越高，微生物限度指標檢查結果越低，6 kGy 以上輻照劑量滅菌的試驗組微生物限度符合含生藥粉口服固體制劑衛生學標準。

綜上所述，60Co－γ 射線輻照滅菌對蜈蚣藥粉綜合品質評價中衛生學指標有優化提升作用，其他方面品質如理化性質、成分含量等方面無顯著影響。因此，60Co－γ射線輻照滅菌可作為蜈蚣藥材的滅菌方法進行推廣；在保證滅菌效果符合要求的前提下，綜合工業生產中滅菌成本及輻照安全性問題，在輻照劑量0 ～10 kGy 范圍內，8 kGy 及8 kGy 以上劑量輻照滅菌效果最佳。因此，蜈蚣藥材飲片輻照滅菌最佳劑量為8 ～10 kGy。