新型國產(chǎn)體外膜氧合系統(tǒng)用于大動物短期心肺輔助的模型建立

蔡黎明，劉 剛，張巧妮，高思哲，齊嘉琛，閆姝潔，吉冰洋

心肺輔助是重要的體外生命支持技術(shù)，體外膜氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）及心室輔助在臨床中的應用日益廣泛，這與相關(guān)技術(shù)和機械設(shè)備的發(fā)展密切相關(guān)［1］。 相關(guān)研究在近年來受到廣泛關(guān)注，但基于倫理學等問題的考慮，臨床研究仍十分受限，因此需要建立穩(wěn)定的大動物模型來開展深入研究。 本課題組前期已成功建立外周型靜脈－動脈體外膜氧合（veno－artery extracorporeal membrane oxygenation， V－A ECMO）大鼠模型［2］，在此基礎(chǔ)上本研究希望建立易于管理且接近臨床的外周型V－A ECMO 及清醒左心室輔助大動物模型。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗經(jīng)阜外醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準（0098－1／2－9／2－HX（X））。 所有實驗動物均為本院動物實驗中心提供的5 ～6 月齡的健康動物，其中家豬3 只（體重分別為：74 kg、82 kg、110 kg；均為雌性），實驗用小型豬1 只（體重43 kg，雄性）；山羊1 只（體重78 kg，雌性）。

1.2 麻醉及術(shù)前準備 豬：所有實驗豬均禁食過夜（12 h 以上），術(shù)前4 h 禁水。 術(shù)前稱重后肌肉注射舒泰0.5 mg／kg、速眠新1 mg／kg；隨后經(jīng)耳靜脈注射2～4 mg／kg 丙泊酚，進行麻醉誘導，誘導完成后將實驗動物平臥位固定于手術(shù)臺上。 隨后置入導尿管連接尿袋（雌性動物進行無創(chuàng)導尿管導尿，雄性動物采用膀胱造口術(shù)進行有創(chuàng)導尿）。 所有動物經(jīng)口氣管插管，根據(jù)動物體重及氣道狀態(tài)選取合適型號氣管插管，根據(jù)術(shù)中動物實際情況及血氣結(jié)果調(diào)整呼吸機參數(shù)。 術(shù)中吸入2%～3%異氟烷維持麻醉。 山羊：實驗羊的麻醉誘導過程同上，誘導完成后右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺上，在完成手術(shù)操作后逐漸實現(xiàn)麻醉蘇醒，實驗過程中動物處于清醒且自主活動狀態(tài)。

1.3 外科準備 豬：手術(shù)部位備皮、消毒。 完成外周監(jiān)測通路的置管后，充分游離暴露右側(cè)頸動、靜脈后經(jīng)外周靜脈通路給予10 000 U 肝素進行全身肝素化，活化凝血時間（activated clotting time， ACT）＞300 s 后開始直視下穿刺置管。 根據(jù)動物體重及血管條件選擇合適型號插管，動脈選擇16～20 Fr 插管（Edwards），靜脈選擇18～25 Fr 插管（Edwards）。 導絲引導下逐級擴張后置入動靜脈插管（動脈插管置管深度8 ～10 cm，靜脈置管尖端位于右心房中部），ECMO 設(shè)備于外科操作前完成預充排氣，以上所有操作順利完成并確保無誤后將頸動、靜脈插管與ECMO 系統(tǒng)動靜脈端分別連接，連接過程中注意無菌操作，并避免系統(tǒng)進氣。 連接完成后分別核對動靜脈管路，確認無誤后開始ECMO 轉(zhuǎn)流并調(diào)整至合適的流量，同時根據(jù)血流量設(shè)置相應的通氣流量和氧濃度。 注意牢固固定管路及插管，避免造成插管移位或脫出。 術(shù)中注意觀察豬置管部位皮膚有無紅腫、滲血等情況。 羊：手術(shù)基本操作如上所述，麻醉狀態(tài)下左側(cè)開胸暴露心尖和降主動脈，分別置入22 Fr 金屬直角腔靜脈插管（Medtronic），插管前經(jīng)外周靜脈通路給予10 000 U 肝素進行全身肝素化，置管成功后充分止血并牢固固定插管避免插管脫出或移位。左心室輔助裝置完成預充排氣后與插管連接并開始轉(zhuǎn)流，隨后逐漸減停麻醉藥物，動物蘇醒并自由活動。

1.4 管路及設(shè)備 豬：ECMO 系統(tǒng)組成（如圖1）包括：離心泵主機及控制器（江蘇賽騰醫(yī)療科技有限公司）、離心泵（江蘇賽騰醫(yī)療科技有限公司）、管路（MEDOS）、氧合器（MEDOS）。 ECMO 系統(tǒng)預充排氣采用850 ml 生理鹽水完成無血預充。 ECMO 循環(huán)示意圖見圖2。

圖1 ECMO 系統(tǒng)組成

圖2 ECMO 循環(huán)示意圖

羊：左心室輔助系統(tǒng)組成包括：常規(guī)體外循環(huán)管路，離心泵主機及控制器（江蘇賽騰醫(yī)療科技有限公司）。 系統(tǒng)預充采用400 ml 生理鹽水實現(xiàn)無血預充。 左心室輔助循環(huán)示意圖如圖3。

圖3 左心室輔助循環(huán)示意圖

1.5 轉(zhuǎn)流過程 豬：置管前抽取動脈血氣，監(jiān)測ACT＞300 s 開始頸動、靜脈置管，置管成功后與ECMO 系統(tǒng)連接，保證管路通暢且無氣體進入，開始ECMO 轉(zhuǎn)流。 術(shù)中肝素泵以12～50 U／（kg·h）的速度經(jīng)外周靜脈持續(xù)泵入，維持ACT 在100 ～300 s。離心泵起始轉(zhuǎn)速為2 500 r／min、流速為1.2 L／min，術(shù)中根據(jù)動物情況逐漸加大轉(zhuǎn)速以維持充足的器官灌注。 ECMO 系統(tǒng)氣源來自實驗室中心氣源，通氣量為1.5 L／min，氧濃度為60%，術(shù)中根據(jù)血氣結(jié)果進行調(diào)整。 恒溫水箱溫度設(shè)置為36 ～38℃，術(shù)中注意維持實驗動物體溫于36～37℃。 術(shù)中注意關(guān)注動物尿的顏色及尿量，關(guān)注動物容量狀態(tài)，保證出量與入量的基本平衡以維持充足的靜脈引流；術(shù)中補充液體原則為晶體∶膠體為1 ∶2。 ECMO 轉(zhuǎn)流時間分別如下：實驗動物1 轉(zhuǎn)流24 h，實驗動物2 ～3 轉(zhuǎn)流48 h，實驗動物4 轉(zhuǎn)流72 h。 實驗動物5（山羊）：心尖及降主動脈置管成功后與左心室輔助系統(tǒng)連接，保證系統(tǒng)密閉無氣體進入。 抽取動脈血監(jiān)測ACT＞500 s 開始轉(zhuǎn)流，術(shù)中按需經(jīng)外周靜脈補充肝素（由于清醒動物實驗，未給予肝素持續(xù)泵入）。 離心泵轉(zhuǎn)速為2 495 r／min、流速1.8 L／min，術(shù)中關(guān)注動物麻醉蘇醒及進食水情況，牢固固定插管和機器，避免動物活動造成脫出，轉(zhuǎn)流時間為24 h。

1.6 數(shù)據(jù)處理 豬：每只實驗動物分別于術(shù)前、術(shù)中和結(jié)束前監(jiān)測血氣、凝血及游離血紅蛋白濃度（根據(jù)實驗動物具體情況作出調(diào)整），并記錄相關(guān)指標的值。 羊：每8 h 監(jiān)測游離血紅蛋白濃度并記錄。

2 結(jié) 果

所有實驗動物均順利完成實驗，術(shù)中生命體征平穩(wěn)，過程中無動物死亡，實驗結(jié)束后均于麻醉狀態(tài)下給予高鉀溶液處死。 各實驗動物具體結(jié)果分別如下：

2.1 實驗動物1 該實驗動物為小型實驗用豬，體重43 kg，雄性，ECMO 轉(zhuǎn)流時間為24 h。 ECMO 轉(zhuǎn)流參數(shù)見表1，該結(jié)果提示實驗過程中機器運轉(zhuǎn)正常，轉(zhuǎn)速與流速基本匹配；游離血紅蛋白濃度見圖4，該結(jié)果提示未見游離血紅蛋白明顯升高；血氣結(jié)果見表2，實驗過程中該動物血紅蛋白濃度出現(xiàn)下降，可能存在明顯血液稀釋，其余指標基本平穩(wěn)；凝血相關(guān)指標檢測結(jié)果見表3，該結(jié)果提示術(shù)中抗凝穩(wěn)定。

2.2 實驗動物2 該實驗動物為家豬，體重74 kg，雌性，ECMO 轉(zhuǎn)流時間為48 h。 ECMO 轉(zhuǎn)流參數(shù)見表1，游離血紅蛋白濃度見圖4，血氣結(jié)果見表2，凝血相關(guān)指標檢測結(jié)果見表3，以上結(jié)果均未見異常，提示術(shù)中平穩(wěn)。

2.3 實驗動物3 該實驗動物為家豬，體重82 kg，雌性，ECMO 轉(zhuǎn)流時間為48 h。 ECMO 轉(zhuǎn)流參數(shù)見表1，游離血紅蛋白濃度見圖4，血氣結(jié)果見表2，凝血相關(guān)指標檢測結(jié)果見表3，以上結(jié)果均未見異常，提示術(shù)中平穩(wěn)。

表1 實驗動物輔助循環(huán)轉(zhuǎn)流參數(shù)

2.4 實驗動物4 該實驗動物為家豬，體重110 kg，雌性，ECMO 轉(zhuǎn)流時間為72 h。 ECMO 轉(zhuǎn)流參數(shù)見表1，該結(jié)果提示跨膜壓差較大，可能存在氧合器血栓形成；游離血紅蛋白濃度見圖4，該結(jié)果提示游離血紅蛋白濃度升高，可能存在血栓形成造成血液破壞增加；血氣結(jié)果見表2，該結(jié)果未見異常；凝血相關(guān)指標檢測結(jié)果見表3，該動物術(shù)中抗凝效果欠佳。

表2 實驗動物血氣結(jié)果

表3 實驗動物凝血結(jié)果

2.5 實驗動物5 （山羊） 該實驗動物為山羊，體重78 kg，雌性。 左心室輔助轉(zhuǎn)流時間為24 h，轉(zhuǎn)流參數(shù)見表1，該結(jié)果未見異常。 游離血紅蛋白濃度見圖4，該結(jié)果未見異常。 動物術(shù)中狀態(tài)平穩(wěn)，麻醉蘇醒狀態(tài)穩(wěn)定，可自主活動（見圖5～6）。

圖4 實驗動物游離血紅蛋白濃度

圖5 山羊術(shù)后蘇醒支具輔助階段

圖6 山羊清醒及輔助后完全自主活動

3 討 論

當患者的心肺功能嚴重受損時，ECMO 作為心肺輔助的技術(shù)之一，可以代替肺的氣體交換功能和心臟的泵血功能，維持全身氧供和血流動力學的穩(wěn)定，保障全身臟器充分有效的氧合血灌注［3－6］，使氧供與氧耗逐漸恢復平衡，從而糾正組織器官缺氧，使內(nèi)環(huán)境恢復穩(wěn)定。 V－A ECMO 在循環(huán)輔助方面的應用給患者帶來顯著生存獲益，受到廣泛關(guān)注；左心室輔助也是有效的心臟輔助手段之一，可以有效減少左心室的做功，有利于心臟功能的恢復。 本研究著眼于探索上述兩種心肺輔助大動物模型的建立，并就建立過程中的關(guān)鍵問題進行討論。

3.1 外周型V－A ECMO 模型初步探索 國內(nèi)外報道的大動物V－A ECMO 模型多是選用體重較小的實驗動物［7－11］，因此本研究第一只實驗動物選取體重43 kg 的小型豬進行探索。 通過對該動物實驗過程總結(jié)發(fā)現(xiàn)，體重較小的動物血容量較少且血管偏細，實驗過程中難以保證充足的靜脈引流，大量補充液體會造成明顯血液稀釋；術(shù)中管理難度大，不適宜應用于中短期V－A ECMO 模型的建立。 基于上述考慮，本研究將后續(xù)實驗動物調(diào)整為體重較大的家豬，并逐漸延長ECMO 轉(zhuǎn)流時間，以探索中短期V－A ECMO 模型的最佳動物選擇。 最終結(jié)果提示體重在60～90 kg 的雌性家豬為中短期外周型V－A ECMO大動物模型的最佳動物選擇，該種動物體重適中，插管型號和ECMO 實際運行參數(shù)等均接近臨床中的實際應用情況，術(shù)中引流量充足，管理難度小，模型穩(wěn)定性高。

采取股動、靜脈的插管方式［3－7］不適用于體重較大且轉(zhuǎn)流時間較長的實驗動物，主要是由于該種插管方式下的靜脈插管長度相對偏短，難以到達實驗豬的右心房水平，很難保證充足的靜脈引流量，進而影響ECMO 的輔助效果。 因此本研究采用頸動、靜脈插管方式，靜脈插管能順利置于右心房中部，在保證充足靜脈引流的同時減小了護理難度，同時采用國產(chǎn)新型便攜式設(shè)備（賽騰醫(yī)療OASSISTTMECMO系統(tǒng)，未上市）輔助完成實驗，便于長時間心肺輔助研究的開展。

3.2 山羊清醒左心室輔助模型初步探索 基于對上述豬V－A ECMO 模型的總結(jié)，本研究嘗試進一步探索清醒心肺輔助大動物模型的建立。 清醒的動物模型有利于動物攝取食物和水，避免營養(yǎng)不足及長時間麻醉帶來的風險。 清醒的動物模型需要選用性情溫和的動物，避免動物躁動導致插管脫出等不良事件的發(fā)生，因此清醒的動物模型選用山羊來完成實驗。 動物實驗中過大過多的設(shè)備對動物的活動限制極大，增加了清醒ECMO 的管理難度，不適宜長時間轉(zhuǎn)流，本實驗采用便攜式設(shè)備來建立左心室輔助的清醒模型，該模型管路簡單、動物負重小、操作難度小、易于護理、成功率及穩(wěn)定性高，適合長時間的轉(zhuǎn)流。

3.3 實驗結(jié)果分析 外周型V－A ECMO 模型所涉及的4 只實驗豬均順利完成實驗，未出現(xiàn)動物死亡，插管過程順利，術(shù)中生命體征平穩(wěn)，血氣結(jié)果滿意。本實驗選取4 只不同品系和體重的豬完成實驗，并逐漸延長ECMO 轉(zhuǎn)流時間，用以探索適合該模型的最佳實驗動物選擇。 最終實驗結(jié)果表明：所有實驗動物術(shù)中血氣結(jié)果平穩(wěn)，說明ECMO 過程中的通氣管理策略滿意。 實驗動物1～3 術(shù)中凝血指標控制滿意，未見血栓形成和出血等并發(fā)癥。 實驗動物4 轉(zhuǎn)流時間最長，為72 h；隨著ECMO 時間的延長，逐漸出現(xiàn)ACT 數(shù)值的下降，加大肝素劑量后無明顯改善，并且出現(xiàn)膜肺前后壓力差的明顯增加以及游離血紅蛋白濃度的升高；提示膜肺內(nèi)部阻力較大、可能有血栓形成，當血液通過阻力較大的膜肺時，剪切應力增加而產(chǎn)生了血液破壞，進而造成游離血紅蛋白濃度的升高。 該實驗結(jié)果可能是由于抗凝不足導致；也可能是長時間的抗凝造成機體凝血系統(tǒng)紊亂，且無法輸注紅細胞和血小板等血制品，最終導致凝血功能紊亂無法糾正；也有可能是實驗動物的個體差異導致。 結(jié)合4 只動物術(shù)中情況考慮：體重較小的實驗動物1（43 kg）難以保證充足的靜脈引流；體重過大的實驗動物4（110 kg）與臨床實際偏差較大，術(shù)中管理難度大；實驗動物2 ～3（60 ～90 kg）術(shù)中各項指標平穩(wěn)、靜脈引流充足、貼合臨床實際、未出現(xiàn)不良事件。

清醒左心室輔助動物模型選取羊完成實驗，插管過程順利，無大量出血，術(shù)中動物生命體征平穩(wěn)，麻醉蘇醒順利，24 h 機器運轉(zhuǎn)正常。 清醒后動物可自由活動，并且能順利進食水，未出現(xiàn)不良事件。

3.4 實驗存在的不足 本實驗存在的主要不足是動物數(shù)量較少，主要原因是由于本實驗處于對全新模型建立的探索階段，并未對具體臨床問題進行研究，并且考慮到大動物實驗的穩(wěn)定性更高，所以選取的實驗動物數(shù)量較少。 本實驗的另一個不足是在抗凝管理方面，監(jiān)測抗凝效果的指標較少，并且對于肝素抗凝不敏感的實驗動物未能預先備選其他抗凝方案完成實驗；由于選取的是正常動物且受限于實驗條件，未能細化凝血監(jiān)測指標，并且藥物準備欠缺；由于受限于實驗條件，無法進行紅細胞、血小板等血液制品的輸注，導致凝血功能紊亂難以糾正。 本實驗相關(guān)抗凝結(jié)果提示，后續(xù)實驗應提前準備預案，注意加強凝血監(jiān)測和抗凝管理，結(jié)合凝血全項及ACT等各項指標綜合評判［12］。 關(guān)于清醒左心室輔助模型，建立過程中應放置胸腔閉式引流，方便對實驗過程中的出血情況進行監(jiān)測。

4 結(jié) 論

本實驗采用頸動、靜脈置管的方式成功建立中短期外周型V－A ECMO 大動物模型，該模型可行性及穩(wěn)定性高，并篩選出最佳的實驗動物為60 ～90 kg的雌性家豬。 并且在便攜式可穿戴設(shè)備的輔助下成功完成清醒左心室輔助大動物模型的建立。