肺泡巨噬細(xì)胞來源的微囊泡對(duì)肺損傷的作用

張藍(lán)予，秦春妮，梁 影，陳書弘，黑飛龍

急性肺損傷發(fā)生率較高，感染、創(chuàng)傷、機(jī)械通氣及體外循環(huán)等均可導(dǎo)致急性肺損傷［1－3］，中重度肺損傷的死亡率超過40%［4］，新冠肺炎所致重度肺損傷為致死的重要因素之一。 然而肺損傷的發(fā)病機(jī)制仍不十分明確。

細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞間的溝通橋梁，包括凋亡小體，微囊泡（microvesicles， MVs）及外泌體，其在機(jī)體中的作用得到越來越廣泛的關(guān)注。 新近研究表明肺損傷期間肺泡灌洗液中含有大量胞外囊泡［5］。 在肺損傷早期，巨噬細(xì)胞來源的胞外囊泡占據(jù)60%［5］。 而其中，MVs 為巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的主要胞外囊泡類型［5－6］。 但MVs 對(duì)肺損傷的作用及機(jī)制仍待研究。 因而本項(xiàng)研究擬通過獲取肺泡巨噬細(xì)胞來源的MVs 探究其對(duì)肺損傷的作用及潛在機(jī)制，擬為肺損傷提供基于胞外囊泡治療新方向的參考。

1 材料與方法

1.1 肺泡巨噬細(xì)胞的培養(yǎng) 小鼠肺泡巨噬細(xì)胞系（mouse alveolar macrophage cell， MHS）（ATCC 公司），經(jīng)RPMI－1640 培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（Gibico，美國）及1%雙抗于T225 培養(yǎng)瓶（Corning，美國）中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件：37℃，5% CO2。 待細(xì)胞量長至108，更換為去除囊泡的完全培養(yǎng)基并給予脂多糖（Lipopolysaccha?rides，LPS，Sigma Aldrich，美國）100 μg／L 或等量磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）刺激1 h。

1.2 提取肺泡巨噬細(xì)胞來源的MVs［6］收集刺激后的細(xì)胞上清，放入離心機(jī)（賽默飛，美國），300 g 4℃離心10 min 后，棄沉淀，上清液再次2 000 g 4℃離心20 min，棄沉淀，上清移入高速離心管中，放入高速離心機(jī)（貝克曼，美國）繼續(xù)20 000 g 4℃離心30 min，離心后棄上清，PBS 重懸沉淀于20 000 g 4℃再次離心30 min，重復(fù)一次PBS 清洗，最終沉淀于PBS 重懸保存。

1.3 肺泡巨噬細(xì)胞來源的MVs 的鑒定 采用透射電鏡（transmission electron microscope，TEM） 觀察MVs 形態(tài)，納米粒徑追蹤技術(shù)（nanoparticle tracking analysis，NTA）觀測MVs 數(shù)量及粒徑分布。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將C57／BL6 小鼠隨機(jī)分為三組：①PBS 組（PBS 氣管內(nèi)刺激，劑量為50 μl，n ＝4）；②Control－MV 組（PBS 刺激的肺泡巨噬細(xì)胞來源的MVs 經(jīng)氣管內(nèi)刺激小鼠，劑量為50 μg／50 μl，n ＝4）；③LPS－MV 組（LPS 刺激的肺泡巨噬細(xì)胞來源的MVs 經(jīng)氣管內(nèi)刺激小鼠，劑量為50 μg／50 μl，n ＝4）。 分別作用4 h 后獲取小鼠肺組織。

1.5 肺損傷評(píng)估 評(píng)分內(nèi)容為肺間質(zhì)水腫、肺泡水腫、肺泡充血、中性粒細(xì)胞浸潤，病變程度為：0 分－無病變或極輕度病變；1 分－輕度病變；2 分－中度病變；3 分－重度病變；4 分－極重度病變。

1.6 蛋白免疫印跡 提取MVs 蛋白和肺組織蛋白后，行聚丙酰胺凝膠電泳，后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶（TBST 配制），封閉1 h，TBST 清洗3 次后孵育一抗4℃過夜：CD68（1 ∶800），CD63（1 ∶800） 及ALIX（1 ∶1 000），閉合小環(huán)蛋白（ZO－1，1 ∶800），咬合蛋白（Occludin，1 ∶1 000），閉合蛋白（Claudin－5，1 ∶800），內(nèi)參（GAPDH，1 ∶1 000）；TBST 清洗PVDF 膜三次后，孵育二抗90 min；TBST清洗后進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光法顯影，采用image J 對(duì)各蛋白進(jìn)行含量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bon?ferroni 事后檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺泡巨噬細(xì)胞來源的MVs 提取與鑒定 經(jīng)梯度離心獲取MVs，TEM 鑒定MVs 形態(tài)（圖1），NTA 發(fā)現(xiàn)MVs 粒徑峰值集中于100～200 nm（圖1），蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)MVs 表達(dá)CD63、CD68 及ALIX（圖2）。

2.2 肺泡巨噬細(xì)胞來源的MVs 致小鼠肺損傷 HE染色顯示，與PBS 組及Control－MV 組相比，LPSMVs 刺激的肺組織呈現(xiàn)明顯間質(zhì)水腫及炎性細(xì)胞浸潤，且肺損傷評(píng)分更高（P＜0.05，n ＝4，圖3）。

圖1 巨噬細(xì)胞來源的MVs 的鑒定

圖2 巨噬細(xì)胞來源的MVs 表面標(biāo)志物表達(dá)

圖3 巨噬細(xì)胞來源MVs 對(duì)肺損傷的作用

2.3 肺部連接蛋白（tight junction， TJ）的表達(dá) 蛋白免疫印跡結(jié)果表明，相比PBS 組及Control－MV組，LPS－MV 組的肺組織TJ 的ZO－1，Occludin 及Claudin－5 的表達(dá)均降低（P＜0.05，n ＝4，圖4）。

3 討 論

炎性細(xì)胞在急性肺損傷的發(fā)展過程中占據(jù)重要地位，而肺泡巨噬細(xì)胞是肺部對(duì)抗刺激的第一道防線，也是肺組織中占主導(dǎo)地位的免疫細(xì)胞［7］。 肺損傷發(fā)生后，肺部細(xì)胞均可分泌胞外囊泡，例如肺泡巨噬細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等［8］，研究發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗液中存在大量上述細(xì)胞分泌的胞外囊泡［5］，但不同時(shí)期胞外囊泡的主要來源有所不同。 在感染所致急性肺損傷早期，肺泡巨噬細(xì)胞激活，分泌大量MVs，其作為生物介質(zhì)載體，在肺部細(xì)胞間起著傳遞作用。

圖4 巨噬細(xì)胞來源的MVs 對(duì)緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

小鼠原代肺泡巨噬細(xì)胞難以大量獲取，本項(xiàng)研究采用大量培養(yǎng)MHS 以獲取足量MVs。 本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)MHS 培養(yǎng)過程中可產(chǎn)生大量的MVs，LPS 刺激肺泡巨噬細(xì)胞后產(chǎn)生的MVs 可導(dǎo)致正常小鼠發(fā)生肺損傷。 MVs 根據(jù)巨噬細(xì)胞的不同活性在胞內(nèi)主動(dòng)包裹較多生物活性物質(zhì)，并將其攜帶進(jìn)入其它細(xì)胞或組織。 研究表明巨噬細(xì)胞來源的MVs 早期攜帶較多 腫瘤 壞死 因子 蛋白 及microRNA 等［6，9－10］。MVs 可被鄰近的肺上皮細(xì)胞及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞等吸收，通過攜帶的活性介質(zhì)影響其它細(xì)胞活性。 So?ni 等［6］發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細(xì)胞來源的MVs 可增加小鼠肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞間黏附分子－1 及角化細(xì)胞來源細(xì)胞因子的表達(dá)，影響上皮細(xì)胞活性。 而Zhang等［10］通過對(duì)炎性肺泡巨噬細(xì)胞來源的MVs 中mi?coRNA 的探究發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細(xì)胞來源的miR－223／142 可抑制肺部炎性小體活性。 表明炎性肺泡巨噬細(xì)胞來源的胞外囊泡包裹的生物活性物質(zhì)既包括損傷性因子，也存在保護(hù)性物質(zhì)。 此外，巨噬細(xì)胞來源的胞外囊泡在各類疾病，如心肌損傷、腎損傷、關(guān)節(jié)炎等均扮演著重要角色［6，9，11］。 新近研究亦考慮將肺泡巨噬細(xì)胞來源的MVs 作為肺損傷的標(biāo)志物［10］，因其作為細(xì)胞特異性載體，可促進(jìn)蛋白及miRNAs 的傳遞，為肺損傷的標(biāo)志物探究提供可能性。 此外，新近研究也發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞來源的胞外囊泡對(duì)肺損傷存在治療作用［12］。

緊密TJ 由Occludin、Claudins－5 及ZO－1 等組成，其在肺泡內(nèi)皮屏障間起著重要作用［13］。 肺泡上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞Occludin、ZO－1 等蛋白表達(dá)的減少通常導(dǎo)致肺血管通透性增加，導(dǎo)致肺損傷或水腫。本項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)LPS 刺激后的巨噬細(xì)胞來源的MVs 減少了肺組織Occludin，Claudin－5 及ZO－1 的蛋白表達(dá)，但對(duì)照組MVs 未對(duì)TJ 蛋白的表達(dá)造成影響，這可能是炎性巨噬細(xì)胞來源的MVs 引發(fā)肺損傷的原因之一。 據(jù)報(bào)道肺組織的TJ 的表達(dá)受到炎癥反應(yīng)的影響［14］。 巨噬細(xì)胞來源的MVs 可攜帶炎性因子進(jìn)入肺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞間隙［15］，可能以此途徑降低TJ 的表達(dá)。

綜上所述，炎性巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生大量MVs，影響肺部TJ 的表達(dá)，并可對(duì)肺組織造成損傷。 MVs 作為細(xì)胞間的溝通橋梁，其在肺損傷中的作用機(jī)制并未完全明確，仍待更深入地機(jī)制探討。