皮膚鱗癌中HPV16 E7與Smad7蛋白的表達及其臨床意義1

李 穎，張 斌，楊 玲

（1.武警重慶總隊醫院皮膚科，重慶 400061；2.重慶市中醫院皮膚科，重慶 400000；3.聯勤保障部隊第九二〇醫院皮膚科，云南 昆明 650032）

TGFβ是一類對上皮細胞生長有潛在抑制作用的細胞因子。Smad7是TGFβ信號轉導通路中最為重要的負性調節因子，Smad7表達升高可對TGFβ信號轉導通路起到限制作用[1]。就皮膚鱗癌而言，除了皮膚老化、紫外線及多種因素參與鱗癌的發生，皮膚鱗癌與HPV的關系也日益引起關注。研究表明，HPV可與紫外線對皮膚的損傷形成疊加效應，提示HPV在鱗癌發生和發展中也發揮著積極作用。鑒于TGFβ作為上皮細胞中最重要的抑制細胞生長的細胞因子，在HPV16感染的腫瘤細胞中高表達卻不能發揮抑制腫瘤增殖的作用，以及Smad7在腫瘤形成和轉移過程中的重要作用，引起了筆者的深思。為此，筆者以HPV16與Smad7的關系作為研究切入點，檢測皮膚鱗癌組織中HPV16 E7和Smad7的表達，并分析其表達與皮膚鱗癌臨床病理特征的關系。

1 材料及方法

1.1 臨床資料收集 門診確診皮膚鱗狀細胞癌手術切除標本蠟塊37例及正常皮膚標本（整形手術或創傷手術邊緣皮膚）蠟塊30例，皮膚鱗癌患者術前均未接受治療。皮膚鱗癌中，男性21例，女性16例，年齡（41～82）歲，平均年齡57歲，皮損發生于頭面部者19例，軀干部4例，生殖器部位2例，四肢12例，按分化程度劃分為低分化癌11例，中分化14例，高分化12例。

1.2 方法 ① 免疫組化染色檢測標本中Smad7和PCNA的表達：4μm厚石蠟切片按常規脫蠟至水，3%過氧化氫甲醇溶液37℃孵育15min，枸櫞酸鹽抗原修復，分別滴加抗體工作液（兔抗人Smad7多克隆抗體或鼠抗人PCNA即用型單克隆抗體），4℃孵育過夜后，滴加50μl聚合物增強劑；37℃孵育20min，辣根過氧化物酶標記的第二抗體；37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木素復染。中性樹膠封片，鏡下觀察并照像，每步驟間均用PBS漂洗充分。在良好的組織結構及清晰的背景上細胞內出現棕黃色顆粒為陽性。判斷標準：觀察胞漿Smad7的染色強度，分為（0～3）級。0級（0分），未著色即陰性；1級（1分），淺黃色即弱陽性；2級（2分），黃色即中等程度陽性；3級（3分），棕黃色即強陽性。對PCNA染色強度進行兩級評分，既進行染色強度的分級，又進行細胞計數。每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，計數陽性細胞百 分 數。分 別 計 為0分（0）、1分（1%～25%）、2分（26%～50%）、3分（51%～75%）、4分（76%～100%）。兩種評分相乘作為最后的染色積分，其積分大于1被認為該組織切片免疫組化PCNA染色陽性。其中，（1～4）分為弱陽性（+）；（5～8）分 為 陽 性（++）；（9～12）分 為 強 陽 性（+++）。② PCR檢 測HPV16 E7DNA：4 μm厚石 蠟包埋切片，3枚切片放入1.5ml Ep管中，加入0.5ml DEXPAT?試劑，水浴箱內100℃加熱處理10min，12 000rpm，4℃離心10min，水層含有組織DNA；直接作為PCR反應的模板，進行PCR反應。PCR擴增條件：94℃ 90s、94℃ 30s、54℃ 60s、72℃ 60s，共35循環，72℃ 5min。分別擴增HPV16 E7和人GAPDH的DNA片 段（HPV16 E7引 物：5′-ATGCATGGAGAT ACACCTACATTGC-3′，5′-TTATGGTTTCTG AGAACAGA TGGGG-3′，產物大小297bp；GAPDH引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，5′-ATGGT GGTGAAGACGCCAGT-3′，產物大小142bp）。取PCR擴增產物5μl，在2.5%的瓊脂糖凝膠和0.5×TBE電泳液中電泳，電壓為80V，約（80～100）min后，通過凝膠成像分析儀觀察電泳圖像，在GAPDH擴增出來的條件下，于Marker 300bp處有電泳條帶出現者，說明擴增得到HPV16 E7基因，對陽性結果重復一次。③ 統計學分析：應用SPSS 23.0軟件對數據進行統計分析，對HPV16 E7表達與Smad7表達的相關性及其與臨床病理特征間的關系采用X2檢驗和確切概率法，P＜0.05表示有統計學差異。育30min，DAB顯色，蘇木素復染。中性樹膠封片，鏡下觀察并照像，每步驟間均用PBS漂洗充分。在良好的組織結構及清晰的背景上細胞內出現棕黃色顆粒為陽性。判斷標準：觀察胞漿Smad7的染色強度，分為（0～3）級。0級（0分），未著色即陰性；1級（1分），淺黃色即弱陽性；2級（2分），黃色即中等程度陽性；3級（3分），棕黃色即強陽性。對PCNA染色強度進行兩級評分，既進行染色強度的分級，又進行細胞計數。每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，計數陽性細胞百 分 數。分 別 計 為0分（0）、1分（1%～25%）、2分（26%～50%）、3分（51%～75%）、4分（76%～100%）。兩種評分相乘作為最后的染色積分，其積分大于1被認為該組織切片免疫組化PCNA染色陽性。其中，（1～4）分為弱陽性（+）；（5～8）分 為 陽 性（++）；（9～12）分 為 強 陽 性（+++）。② PCR檢 測HPV16 E7DNA：4 μm厚石 蠟包埋切片，3枚切片放入1.5ml Ep管中，加入0.5ml DEXPAT?試劑，水浴箱內100℃加熱處理10min，12 000rpm，4℃離心10min，水層含有組織DNA；直接作為PCR反應的模板，進行PCR反應。PCR擴增條件：94℃ 90s、94℃ 30s、54℃ 60s、72℃ 60s，共35循環，72℃ 5min。分別擴增HPV16 E7和人GAPDH的DNA片 段（HPV16 E7引 物：5′-ATGCATGGAGAT ACACCTACATTGC-3′，5′-TTATGGTTTCTG AGAACAGA TGGGG-3′，產物大小297bp；GAPDH引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，5′-ATGGT GGTGAAGACGCCAGT-3′，產物大小142bp）。取PCR擴增產物5μl，在2.5%的瓊脂糖凝膠和0.5×TBE電泳液中電泳，電壓為80V，約（80～100）min后，通過凝膠成像分析儀觀察電泳圖像，在GAPDH擴增出來的條件下，于Marker 300bp處有電泳條帶出現者，說明擴增得到HPV16 E7基因，對陽性結果重復一次。③ 統計學分析：應用SPSS 23.0軟件對數據進行統計分析，對HPV16 E7表達與Smad7表達的相關性及其與臨床病理特征間的關系采用X2檢驗和確切概率法，P＜0.05表示有統計學差異。

2 結果

2.1 HPV16 E7檢出情況 37例皮膚鱗癌組織中共檢出6例HPV16 E7陽性，在30例對照正常皮膚組織中，未檢出HPV16 E7（見圖1、圖2）。

圖1 PCR檢測皮膚鱗癌組織中HPV16 E7基因表達的凝膠電泳圖

圖2 PCR檢測正常皮膚組織中HPV16 E7基因表達的凝膠電泳圖

2.2 免疫組化法檢測Smad7在皮膚鱗癌中的表達大多數鱗癌細胞胞漿高表達Smad7（P＜0.01），染色呈棕黃至棕褐色（見圖3），其中陽性和強陽性表達的共26例。此外，少數鱗癌組織脈管內皮細胞及間質細胞也有Smad7的散在表達，部分（5例）腫瘤組織不表達Smad7（見表1）。

圖3 免疫組化法檢測Smad7在正常皮膚和皮膚鱗癌中的表達（×200）

表1 免疫組化法檢測Smad7的表達

2.3 PCNA在皮膚鱗癌組織中的表達 37例皮膚鱗癌組織中均有PCNA的陽性表達（見圖4），其中強陽性例數為22例，胞核PCNA表達強度與鱗癌增殖程度具有顯著相關性（見表2）。

圖4 免疫組化檢測PCNA在正常皮膚和皮膚鱗癌中的表達（×200）

表2 免疫組化法檢測PCNA的表達

2.4 比較統計學分析HPV16 E7和Smad7的表達及與皮膚鱗癌臨床病理特征的關系 HPV16 E7表達與皮膚鱗癌發生部位和性別無明顯相關性（P＞0.05），HPV16 E7表達與淋巴結轉移和組織分化程度相關（P＜0.05），Smad7表達與患者的性別和皮膚鱗癌發生的部位無明顯相關性（P＞0.05），Smad7表達強度與組織分化（P＜0.05）、淋巴結轉移（P＜0.01）均相關，HPV16 E7表達分別和Smad7和PCNA的陽性表達相關（P＜0.05），Smad7和PCNA的陽性表達也顯著相關（P＜0.01）（見表3）。

3 討論

腫瘤的發生和惡性變是一個受多基因調控、機體內外環境均有參與的復雜過程，在腫瘤發生淋巴結轉移這一過程中，多種細胞因子或生長因子參與調控。正常情況下，TGFβ可對表皮發揮抑制增殖的作用。Smad蛋白是TGFβ信號從膜受體到胞核的細胞內轉導分子和調節分子。Smad7是TGFβ信號轉導通路中最為重要的負性調節因子，Smad7表達升高可對TGFβ信號途徑起到限制作用[2]。在繁衍成功并惟一穩定傳代成一系的敲除角蛋白5并高表達Smad7（BK5.Smad7）的小鼠后代中也發現，與同胎的非轉基因正常小鼠相比，BK5.Smad7成年小鼠在無UV照射的正常飼養狀態下呈現出明顯的皮膚老化表現，個別小鼠面部甚至出現自發性皮膚腫瘤。這提示Smad7表達升高可能是動物自發性皮膚腫瘤的重要始因[3]。前期細胞試驗也顯示穩定高表達 HPV16 E7后的A431細胞中Smad7表達水平升高，并可以影響Smad7的細胞定位[4]。本研究實驗結果顯示，人皮膚鱗狀細胞癌組織中存在著Smad7表達增加。

表3 HPV16 E7和Smad7的表達與皮膚鱗癌臨床病理特征的關系

HPV根據致病能力分為高危型和低危型，HPV16是最為常見的一種高危致病型，HPV16 E7已被確認為是一種重要的原癌蛋白，能夠繞過細胞周期檢測位點，破壞細胞周期的負調控最終誘導惡性腫瘤的發生。臨床病理研究證實，除了在宮頸癌中被廣泛（90%以上）檢出，HPV16也可以在頭頸部鱗狀細胞癌以及消化道癌、膀胱癌、肺鱗狀細胞癌和陰莖癌等人類多種上皮組織惡性腫瘤中被檢出[5-8]，這提示HPV16與上述鱗癌發生有密切關系。

TGFβ在宮頸癌等HPV16感染的腫瘤組織中表達升高，卻并沒有抑制腫瘤的生長。現有研究提示：HPV16 E7可通過多種方式阻遏TGFβ發揮抑制細胞增殖的作用。在HPV16感染的惡性腫瘤細胞中發現，攜帶有TGFβ受體和相關Smads基因的染色體發生缺失。HPV16 E7能夠競爭性抑制TGFβ上調p16、p21、p27及p15等CKIs的表達 和 活 化 的能力，使TGFβ抑制細胞周期過快的作用無法正常發揮。使用RNAi干擾技術特異性抑制HPV16 E7的表達，能夠誘導p53、p21向核內聚集，并且可使R-Smad恢復對TGFβ的反應性，從而抑制腫瘤細胞的生長并且促進腫瘤細胞的凋亡。我們推測，外源性HPV16 E7也極可能通過與重要的抑制性Smad蛋白——Smad7發生作用，導致TGFβ對P21等CKIs誘導表達的作用喪失，加劇細胞周期的紊亂，進而促使角質形成細胞失控性增殖，加劇皮膚鱗癌的惡性程度和侵襲性[9-11]。

為此，我們以HPV16與TGFβ信號轉導通路中重要的抑制性因子Smad7的關系為研究切入點，檢測皮膚鱗癌組織中HPV16 E7和Smad7的表達，并分析其表達與皮膚鱗癌臨床病理特征的關系。我們發現Smad7在皮膚鱗癌組織中表達上調，尤其是HPV感染的皮膚鱗癌組織，其Smad7的表達強度更高。通過比對臨床資料進行分析顯示：HPV16 E7的表達與皮膚鱗癌的低分化、淋巴結轉移呈正相關；此外，HPV16 E7的表達分別與Smad7和PCNA的表達強度顯著相關；Smad7蛋白的表達強度和皮膚鱗癌的分化和淋巴結轉移也有相關性。因此我們推測，HPV16 E7可能通過聯合或直接上調Smad7的表達來加速腫瘤細胞增殖和侵襲，有必要更深入研究HPV16 E7與Smad7在腫瘤發生發展中的密切關系。