基于正交試驗法優選制何首烏提取工藝

關鍵詞：正交試驗;二苯乙烯苷;游離蒽醌;提取工藝

何首烏為蓼科植物何首烏（PolygonummultiflorumThunb）的干燥塊根，制何首烏為何首烏的炮制加工品，具有補肝腎、益精血、烏須發、強筋骨、化濁脂的作用[1]。制何首烏作為傳統的補益類中藥，在臨床應用廣泛?！吨袊幍洹?020版一部更是收錄了包括人參首烏膠囊、乙肝養陰活血顆粒等多種包含制何首烏的中成藥?，F代研究表明，何首烏中二苯乙烯苷、蒽醌類具有保護神經、改善記憶、保肝、消炎、抗菌等作用[2]。目前對何首烏的研究多集中在藥材采收期、產地及飲片的炮制、質量變準、藥理活性等方面，鮮有對其提取工藝的研究[3]。本研究以二苯乙烯苷、游離蒽醌為指標，通過考察提取溶劑、提取方法，確定制何首烏的最佳提取工藝，以期為制何首烏的開發提供依據。現報道如下：

1儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（waters 2996檢測器），Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），AY220型電子天平（精確度為萬分之一），sartotius.BP211D型電子天平（精確度為十萬分之一），Anke TGL-16B離心機，南京金正教學儀器有限公司RE-201D旋轉蒸發器，DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱，江蘇國勝實驗儀器廠HH-S恒溫水浴鍋。

1.2 試藥

大黃素甲醚、大黃素、二苯乙烯苷，購自瑞芬思生物技術有限公司（批號：D-004-130315、D-029-130401、F-022-130512）。制何首烏飲片由貴州昌昊有限公司提供，產地貴州省從江縣，經吳啟南鑒定鑒定為蓼科植物何首烏Polygonummultiflorum Thunb的炮制品。甲醇與乙腈均為色譜純，水為超純水（實驗室自制），乙醇（分析純）。

2方法與結果

2.1 色譜條件與對照品的制備

色譜條件：固定相為Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），二苯乙烯苷：以乙腈-水（25∶75）為流動相;檢測波長為320 nm。游離蒽醌：以甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）為流動相;檢測波長為254 nm[1]。柱溫均為25℃，流速：1 ml/min。

對照品溶液的制備：取2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1ml含0.199 mg的溶液，即得。取大黃素對照品、大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成大黃素3.98 mg/100 ml、大黃素甲醚2.18 mg/100ml的溶液。

依照上述色譜條件，按照要求對對照品進行稀釋，各進樣10 μl，以峰面積為縱坐標，相應濃度為橫坐標，繪制標準曲線。二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的回歸方程分別為Y=2.9×107X-97302，r=0.9998;Y=3.2×107X-13422，r=0.9999;Y=2.9×107X-4541.3，r=0.9999。

2.2 制首烏提取溶劑優選

2.2.1 樣品的制備

取制何首烏飲片粗粉約8 g，分別加10倍量95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、水浸泡0.5 h，加熱回流3次，每次回流1.5 h，濾過，合并濾液，95%乙醇定容到500 ml，分別取200 ml減壓回收乙醇并濃縮。濃縮液置蒸發皿中，揮干溶劑，得到2份樣品。

2.2.2 樣品的測定

分別取不同提取方式得到的樣品，一份置100 ml容量瓶中，取5 ml置25 ml容量瓶中，52.9%乙醇定容，用于測定二苯乙烯苷含量。取另一份置100 ml容量瓶中，取25 ml置50 ml容量瓶中，用甲醇定容，取5 ml作為供試品溶液，測定游離蒽醌[3]。依照色譜條件，分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄各指標成分的含量。結果見表1。

2.3 制何首烏提取工藝優選

根據提取溶劑優選結果及前期實驗結果，通過正交試驗法，考察溶劑量、提取次數、乙醇濃度3個因素對制何首烏提取的影響，從而確定最佳的提取工藝。

2.3.1 樣品的制備

取制首烏4 g，用所選溶劑浸泡0.5 h，按正交試驗設計方案進行試驗，依照制首烏提取溶劑優選中制備方法進行制備，最后得到2份樣品。

2.3.2 樣品溶液制備

取樣品，一份置50 ml容量瓶中，52.9%乙醇定容。取5 ml置25 ml容量瓶中，52.9%乙醇定容，用于測定二苯乙烯苷含量。取另一份置50 ml容量瓶中，取25 ml置50 ml容量瓶中，用甲醇定容，取5 ml作為供試品溶液。

2.3.3 測定法

分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，運用回歸方程計算含量。

2.3.4 正交試驗及結果

分別取4 g制何首烏粉末，根據2.3.1的步驟，對樣品進行處理，進行9組試驗，實驗結果及方差分析見表2～3。

由表2直觀分析可知：KA3>KA2>KA1，KB3>KB2>KB1，KC2>KC3>KC1，極差結果顯示因素影響性為B>C>A，故A3B3C2組合提取效果較好，即用10倍量60%乙醇回流3次。

由表3方差分析可知3個因素均無顯著性差異。綜合以上結果，在實驗結果的基礎上，結合實際的生產情況，確定A2B3C2為最終工藝，即用10倍量60%乙醇回流3次。在保證療效的同時，降低生產成本。

2.4 工藝驗證

稱取4 g制首烏按照A2B3C2組合工藝條件進行加熱回流，每組試驗樣品平行3份，依法測定。結果見表4。

工藝驗證結果表明：A2B3C2組合中二苯乙烯苷、游離蒽醌的含量與正交工藝中的含量相當，差異較小。且A2B3C2組合工藝的RSD較小，工藝較為穩定。同時縮短生產周期，大大提高了經濟效益，因此加熱回流最佳工藝為10倍量60%乙醇回流3次。

3討論

本實驗首先通過HPLC法，以二苯乙烯苷、游離蒽醌為指標考察了不同提取溶劑對制何首烏的提取效果。通過查閱文獻研究發現，提取溶劑、提取次數、溶劑量對飲片提取效果影響較為明顯，故本研究選取上述3個因素，優選制何首烏的提取工藝。通過預實驗，分別確定了3個因素的水平。

本實驗采用加權綜合評分法，對實驗結果進行綜合評分。文獻研究表明，何首烏中主要的活性成分為二苯乙烯苷、蒽醌類化合物，其中二苯乙烯苷更是表現出多種生物活性，與制何首烏的補益作用更為相符[8]。

實驗結果顯示，二苯乙烯苷在60%乙醇條件下提取率較高，蒽醌在70%乙醇中提取率較高，提取結果與化學成分性質相符合A因素K3>K2>K1，其余兩個因素K2最大，結果表明因素水平設計的合理性;極差結果顯示提取次數對提取效果的影響最大，乙醇濃度次之，其與方差分析結果一致。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2020：184.

[2]李帥鋒，鄭傳柱，張麗，等.不同產地何首烏藥材的質量分析[J].江蘇中醫藥，2015，47（8）：69-71.

[3]楊建波，高慧宇，王雪婷，等.何首烏中1個新的木脂素酰胺類化合物[J].中草藥，2021，52（18）：5475-5482.