游離鈣離子在‘碭山酥’梨“鐵頭病”發病過程中的作用研究*

劉肖烽，李舒然，李六林

（山西農業大學園藝學院，太谷 030801）

‘碭山酥’梨種植面積廣，是我國優良的梨品種[1]。但是近幾年來在‘碭山酥’梨果實上發現果頂部位異常堅硬且明顯突出，失去商品價值，俗稱“鐵頭病”。田間調查發現，該病害發病率為30%～40%，成為威脅‘碭山酥’梨生產的一大病害。因此，闡明“鐵頭病”的發生原因、尋求有效的解決方案對‘碭山酥’梨產業發展具有重要意義。

筆者研究發現“鐵頭病”果實硬化的關鍵時期為盛花期后34 d，主要表現在木質素的大量合成導致石細胞急劇增加。木質素是植物防御脅迫的重要物質[2]，當遇到各種生物和非生物脅迫時，會有更多的木質素沉積在細胞次生壁上，使得細胞變厚，最終導致果實硬度增加[3]。此外，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、肉桂醇脫氫酶（CAD）是木質素合成過程中重要的酶[4]，其活性升高會使得木質素合成速率加快。‘碭山酥’梨果實木質素的過度沉積會導致石細胞的形成[5]，嚴重影響果實品質[6]。

鈣（游離鈣離子）對植物抗性提高[7]、細胞壁形成[8]、果實發育和品質形成[9]具有重要作用。有研究認為，在果實采收前噴施CaCl2可以降低果實木質素含量，提高果實品質[10]。鈣（游離鈣離子）是細胞壁的構成成分[9]，是否對木質素合成和沉積發揮作用還未見相關報道。本試驗通過花期在“鐵頭病”果園中噴施2%CaCl2，以及在正常果園中噴施游離鈣離子螯合劑EGTA，以盛花期后34 d和151 d的果實為試驗材料，對不同處理后果實游離鈣離子含量、木質素含量、石細胞密度和木質素合成相關酶活性進行測定，同時對游離鈣離子和石細胞的分布情況進行觀察，以探索游離鈣離子對‘碭山酥’梨“鐵頭病”的緩解作用，為該病害的防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采樣地點位于山西省晉中市祁縣修善村，果園常規管理，供試梨品種為‘碭山酥’，樹齡10年，行株距為3 m×2 m。

1.2 試驗處理與方法

提前在“鐵頭病”發生嚴重的果園中標記發病樹，并且標記發病枝條，選擇病果分布均勻的梨樹5株，噴施濃度為2%的CaCl2溶液，另選擇5株樹噴施等量清水作為對照（發病果園）；在正常果園中隨機選擇正常發育的梨樹5株，噴施濃度為3 mmol/L的EGTA，同時選擇5株樹噴施等量清水作為對照（正常果園）。每株樹噴施1.5 L，均勻噴灑至樹體表面（噴施前后4 h內如遇降雨需補噴），共噴施3次，具體時間為4月10、15、20日。

（1）發病率的測定。2019年5月24日，每處理選擇5株樹，采用大枝統計法，每株樹隨機選擇3個大枝（果實總數大于100個），分別統計各處理的病果數（果實果頂部位明顯凸出的即為病果），計算發病率。

發病率（%）=（病果總數/調查總果數）×100

（2）果實品質及次生代謝物含量測定。2019年9月18日，每處理選擇5株樹，每株樹從樹冠外圍采集果實30個，采集的果實分別從果肩與果頂部位取樣。用GY-3型硬度計測定果實硬度，用WYT-4手持糖度計[11]測定可溶性固形物含量，用蒽酮比色法[12]測定可溶性糖含量，用酸堿滴定法[13]測定可滴定酸含量，采用烘干法測定[14]果實含水量。木質素含量采用Klason法[15]進行測定，石細胞含量采用于娟娟等[16]的方法測定；PAL、C4H、CAD活性參照王丹陽[4]的方法測定，4CL活性的測定參照王斌等[17]的方法；果實游離鈣離子含量的測定參照趙靜等[18]的方法。

（3）組織結構觀察。Ca2+定位參照Wang等[19]的方法進行。用石蠟切片、番紅-固綠雙重染色對石細胞進行觀察[20]。

1.3 數據處理

試驗數據用Excel 2010和SAS v9.0軟件進行統計和方差分析。

2 結果與分析

2.1 外施CaCl2及其抑制劑對發病率的影響

如圖1所示，發病果園“鐵頭病”發病率高達37.53%，而正常果園未發現病果。發病果園噴施CaCl2后，“鐵頭病”發病率顯著降低，為24.67%。對正常果園噴施EGTA后，出現極少量病果。

圖1 不同處理果園“鐵頭病”發病率

2.2 外施CaCl2及其抑制劑對果實品質的影響

2.2.1 對果實硬度的影響

發病果園病果果肩和果頂部位硬度分別為11.27、21.00 kg/cm2，顯著高于其他處理；CaCl2處理的果肩、果頂硬度均顯著低于病果相應部位，分別為9.50、16.70 kg/cm2；正常果實的果肩和果頂部位硬度分別為7.73、7.40 kg/cm2，與EGTA處理相應部位無顯著差異（圖2）。

圖2 不同處理‘碭山酥’梨果實硬度

2.2.2 對果實可溶性固形物含量的影響

正常果實果肩和果頂的可溶性固形物含量分別為12.33%和11.93%，顯著高于病果和CaCl2處理的相應部位；CaCl2處理的可溶性固形物含量高于病果，果頂的差異達顯著水平；EGTA處理的可溶性固形物含量與正常果實差異不顯著（圖3）。

圖3 不同處理‘碭山酥’梨果實可溶性固形物含量

2.2.3 對果實可溶性糖含量的影響

如圖4所示，正常果實果肩、果頂的可溶性糖含量分別為90.12、85.47 mg/g，與EGTA處理相應部位均無顯著差異，但均顯著高于病果和CaCl2處理的相應部位；CaCl2處理果肩、果頂的可溶性糖含量均高于病果相應部位，果頂的差異達顯著水平。

圖4 不同處理‘碭山酥’梨果實可溶性糖含量

2.2.4 對果實可滴定酸含量的影響

如圖5所示，CaCl2處理果肩和果頂的可滴定酸含量分別為0.23%、0.24%，顯著低于病果相應部位；EGTA處理的果實果頂可滴定酸含量為0.17%，顯著高于正常果實果頂（0.14%）。

圖5 不同處理‘碭山酥’梨果實可滴定酸含量

2.2.5 對果實含水量的影響

正常果實的果肩、果頂含水量分別為87.49%、86.06%，顯著高于CaCl2處理（85.16%和81.50%）和病果（84.57%和80.51%）相應部位；CaCl2處理后果實含水量較病果顯著提高（圖6）。

圖6 不同處理‘碭山酥’梨果實含水量

2.3 外施CaCl2及其抑制劑對果實游離鈣離子含量及分布的影響

2.3.1 對果實游離鈣離子含量的影響

正常果實果肩游離鈣離子含量達到0.39 mg/g，顯著高于病果及CaCl2、EGTA處理的果實，其中CaCl2處理和EGTA處理間差異不顯著，但均顯著高于病果。正常果實和EGTA處理果頂的游離鈣離子含量無顯著差異，均顯著高于CaCl2處理，CaCl2處理顯著高于病果（圖7）。

圖7 不同處理‘碭山酥’梨果實游離鈣離子含量

2.3.2 對果實游離鈣離子分布的影響

從圖8可以看出，正常果實果肩與果頂部位的游離鈣離子分布密集，而病果果肩與果頂部位的游離鈣離子分布極其稀少，經CaCl2處理的果實果肩與果頂游離鈣離子分布稍有增加，而EGTA處理的果實果肩和果頂游離鈣離子分布密集程度明顯低于正常果實，但是明顯高于病果與CaCl2處理的相應部位。

圖8 不同處理‘碭山酥’梨果實游離鈣離子定位狀況

2.4 外施CaCl2及其抑制劑對果實次生代謝的影響

2.4.1 對果實石細胞含量和木質素含量的影響

對各處理果實不同部位石細胞的觀察及其含量測定發現，正常果實與EGTA處理果實果肩、果頂的石細胞密度差異均不明顯，其石細胞含量均顯著低于病果和CaCl2處理相應部位；CaCl2處理果實果肩、果頂的石細胞密度均明顯低于病果，其石細胞含量均顯著低于病果相應部位（圖版2、圖9）。

如圖9所示，果肩、果頂的木質素含量從低到高均依次為正常果實、EGTA處理、CaCl2處理、病果，且差異均達顯著水平，說明CaCl2處理能顯著降低病果的木質素含量，而EGTA處理能顯著促進正常果實產生木質素。

圖9 不同處理‘碭山酥’梨果實石細胞含量及木質素含量

2.4.2 對果實木質素相關酶活性的影響

由圖10可以看出，CaCl2處理的果實果肩、果頂PAL活性均較病果相應部位顯著降低，但均顯著高于EGTA處理和正常果實相應部位，EGTA處理的果肩、果頂PAL活性均顯著高于正常果實相應部位。CaCl2處理的果實果肩和果頂的4CL、C4H活性均較病果相應部位顯著降低，但均顯著高于EGTA處理和正常果實相應部位；EGTA處理的果肩4CL、C4H活性均顯著高于正常果實，果頂4CL、C4H活性均與正常果實差異不顯著。CaCl2處理的果實果肩CAD活性與病果果肩差異不顯著，果頂CAD活性較病果果頂顯著降低，但均顯著高于EGTA處理和正常果實相應部位；EGTA處理的果肩與果頂CAD活性與正常果實相應部位均無顯著差異。

3 討論與結論

圖10 不同處理‘碭山酥’梨果實PAL、4CL、C4H和CAD的活性

鈣對植物體各種生命活動的正常進行有著不可估量的作用，包括增加植物的抗性、在外部刺激下作為信號分子調動內部相應的信號轉導，同時還參加植物體細胞壁的構建[21-22]。Ca元素對于果實的生長發育同樣有著重要的作用，果實中的游離鈣離子對果實品質的形成以及采后果實品質的維持具有重要意義[23]。通過對正常果實與“鐵頭病”果實各部位游離鈣離子含量分析發現，正常果實果肩與果頂游離鈣離子含量均顯著高于病果相應部位。在花期對患病果樹連續噴施2%CaCl2溶液后，“鐵頭病”發病率顯著降低，且經過處理的病果果肩與果頂游離鈣離子含量均顯著高于未處理的病果相應部位，但是都顯著低于正常果實相應部位。對正常果實、“鐵頭病”果實、CaCl2處理果實各部位進行游離鈣離子定位觀察也得到了一致的結果，說明在花期連續噴施2%CaCl2可以對“鐵頭病”果實起到補充游離鈣離子的作用。

木質素是由4-羥基苯基丙烷氧化組合偶聯形成的芳香族聚合物[24-25]。這些聚合物主要沉積在細胞次生壁中，使細胞變得僵硬，進而顯著增加了果實硬度[26]。同時石細胞的增加與果實硬度的提升也有著非常大的關系，而石細胞的形成與木質素在細胞壁上的積累導致次生壁增厚有決定性的關系，因此木質素在很大程度上影響著果實硬度[5]。經過2%CaCl2處理的果實石細胞含量和木質素含量均顯著低于未處理病果，組織結構觀察也顯示CaCl2處理的果實石細胞密度小于病果，說明外源CaCl2處理降低了病果中木質素和石細胞的堆積，這與Lu等[10]的研究結果一致。經過2%CaCl2處理的病果PAL、4CH、C4L、CAD活性基本顯著降低，這有利于減少果實中木質素的積累，緩解病情。石細胞含量與果實可溶性糖含量和水分含量呈顯著負相關，與果實可滴定酸含量呈顯著正相關[27-31]。本研究結果表明，病果的可溶性固形物含量、可溶性糖含量、含水量均顯著低于正常果實，果實硬度、可滴定酸含量均顯著高于正常果實。經過CaCl2處理后，病果果實品質得到改善，其果實可溶性固形物含量、可溶性糖含量、含水量均明顯提高，果實硬度、可滴定酸含量均顯著降低。其原因可能是花期噴施CaCl2，病果缺鈣癥狀得到緩解，木質素含量顯著降低，進而減少了石細胞的合成，改善了果實品質。

EGTA是游離鈣離子螯合劑，可以與游離鈣離子結合，與植物體競爭游離鈣離子，使果實游離鈣離子含量降低[32-33]。花期在正常‘碭山酥’梨園中連續噴施EGTA溶液，阻礙植株對游離鈣離子的吸收，結果發現果實游離鈣離子含量明顯降低，木質素含量顯著升高，果頂部位石細胞含量顯著升高，果實品質變劣。

綜上所述，‘碭山酥’梨果實游離鈣離子含量的缺乏會使木質素過度沉積，導致石細胞大量合成，這可能是誘發“鐵頭病”的重要原因。可通過噴施2%CaCl2降低“鐵頭病”發病率以及緩解其發病程度。但是果實缺乏游離鈣離子的原因以及噴施CaCl2對“鐵頭病”作用的機理還需進一步研究。