CRISPR-Cas系統編輯絲狀真菌的進展與挑戰

肖晗，劉宜欣

（上海交通大學生命科學技術學院，微生物代謝國家重點實驗室，教育部代謝與發育科學國際合作聯合實驗室，上海200240）

絲狀真菌大多隸屬于子囊菌和擔子菌，是一類對生物、環境和材料等學科有著重要意義的微生物。絲狀真菌是蛋白分泌的理想宿主，其中曲霉屬和木霉屬的菌株被廣泛用于生產木聚糖酶和纖維素酶［1］。不少擔子菌因具有較強的重金屬吸附能力，在環境污染治理方面展示出較大潛力［2］。更為重要的是，絲狀真菌能天然合成多種具有重要生物學活性的次級代謝物，例如青霉菌生產的青霉素［3］、曲霉生產的洛伐他汀［4］和靈芝生產的靈芝酸［5］等等，是生產高附加值化合物的細胞工廠。

基于絲狀真菌的各項基礎和應用研究高度依賴基因編輯平臺，比如鑒定基因功能［6］、激活沉默基因簇［7］等。然而，絲狀真菌獨具的生理性能給這類微生物基因編輯平臺的構建帶來挑戰。這主要表現在以下四方面：

（1）頂端生長 絲狀真菌通過頂端菌絲體的分裂實現生長，外源質粒難以均勻分布到分裂的多個菌絲體中［8］。菌絲體的胞質成分甚至細胞器可通過隔膜孔進入到相鄰細胞中，造成抗性篩選的假陽性。

（2）異核性 擔子菌中的菌絲體細胞通常包含2個不同的細胞核，如果包含有抗性篩選標記的轉化子沒有同時整合到兩個核中，后續的轉化子由于分裂稀釋會不再包含抗性標記［8］。

（3）同源重組效率低 同源重組是精準基因編輯的基礎，大部分絲狀真菌中非同源性末端接合（non-homologous end joining， NHEJ）的修復機制占主導地位，很難實現基于同源重組的精準基因編輯［9］。

（4）遺傳篩選標記匱乏 由于遺傳操作工具不成熟，營養缺陷型標記在不少絲狀真菌中尚不可用，可用的篩選標記僅有少數幾種抗生素（如萎銹靈［10］、潮霉素［8］等）的抗性基因。

近年來，基于RNA介導的核酸內切酶CRISPRCas 系統能在基因組特定位點引入DNA 或RNA 的鏈缺口，誘發宿主啟動自身的防御機制修補缺口，大幅提高了同源重組效率，減少對篩選標記的依賴，實現多個物種的多基因編輯［11-13］。隨著研究的深入，CRISPR-Cas 系統也被應用于絲狀真菌中，為構建成熟的絲狀真菌基因編輯平臺奠定基礎。本綜述重點介紹了近三年絲狀真菌基因編輯的最新進展，討論了該系統協助絲狀真菌基因編輯存在的挑戰及可能的解決方法。

1 CRISPR-Cas 系統編輯絲狀真菌的進展

自2015 年Liu 等首次將CRISPR-Cas 系統引入模式絲狀真菌里氏木霉中以來［14］，5 年多時間里，該系統在越來越多的絲狀真菌中成功構建，它不但能更加高效、快速地編輯模式菌株，更為重要的是，它協助很多傳統方法無法實現基因編輯的菌株進行基因編輯［9，15］，大幅提高了人們對這類重要微生物的認識和改造。本部分圍繞CRISPRCas 系統的遞送、體內表達、同源臂設計和宿主改造幾方面介紹了其編輯絲狀真菌的進展。

1.1 CRISPR-Cas系統的遞送

聚乙二醇（polyethylene glycerol，PEG）和根瘤農桿菌介導的原生質體轉化（agrobacteriummediated transformation，AMT）是把CRISPR-Cas系統遞送到絲狀真菌中最主要的兩種方式［16］。外源DNA 片段經PEG 介導的轉化后，通常以多拷貝的形式隨機整合到絲狀真菌基因組上［17］，而AMT則傾向于將外源片段以單拷貝的形式隨機整合到基因組上［18］。經PEG 或AMT 遞送的CRISPR-Cas系統，可以是DNA、RNA［9，19］，也可以是體外表達的Cas 蛋白和體外轉錄的引導RNA（guide RNA，gRNA）組裝好的CRISPR-Cas 核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）［20-22］。由于提供了一種瞬時的、不依賴于體內表達元件和遺傳篩選標記的基因編輯方式，RNP在絲狀真菌中的應用得到越來越多的關注。在2019年的一項研究中，Li等［23］開發了一種仿生礦化的RNP 遞送系統，將利用磷酸鈣礦化的納米顆粒承載RNP 遞送至植物病原真菌稻瘟病菌的原生質體中。仿生礦化處理的RNP 可保護gRNA 免受酶水解，提高RNA 的穩定性，保留Cas9蛋白的酶活性。同時，他們還使用聚丙烯酸改善仿生礦化的RNP 納米顆粒（biomimetic mineralized RNP nanoparticle，BM-RNP NP）的分散性。通過觀察與BM-RNP NP 有相似形態和尺寸分布的EGFP 納米顆粒（BM-EGFP NP）的遞送過程，發現BM-EGFP NP 附著在細胞膜表面可能會增加經胞吞途徑被細胞攝取的概率。研究者將中斷編碼Sytalone dehydratase 的sdh 基因的BM-RNP NP 加入原生質體中，檢測發現該基因的編輯效率達20%，而僅通過RNP 處理的細胞中該基因的表達并未發生明顯變化。進一步序列分析顯示，用BM-RNP NP 處理的米曲霉在7 個潛在的脫靶位點均未發生變化。他們認為使用仿生礦化的RNP 進行基因編輯有望提供一種通用且不依賴DNA 的方法來提高編輯效率。

此外，CRISPR-Cas 系統還能介導外源片段在絲狀真菌中的定向整合，徹底改變外源片段隨機整合的遞送模式。Lu 等［24］在根瘤農桿菌介導的TDNA 中間插入了靶向mfa2 基因的CRISPR-Cas 表達盒，在潮霉素篩選條件下，原本隨機插入的TDNA片段能定向插入到經CRISPR-Cas切割的mfa2的靶位點，實現該基因的中斷。更進一步地，將CRISPR-Cas 系統靶向到上述插入至mfa2 的CRISPR-Cas 表達盒的潮霉素抗性基因，可在潮霉素抗性基因的靶位點插入同義突變的mfa2 基因用以規避CRISPR-Cas 的識別，實現該基因的回補。類似地，通過巧妙設計CRISPR-Cas 系統，可將外源片段定向整合到基因組的特定位點。Sarkari等［25］首先利用CRISPR-Cas 系統破壞了黑曲霉（Aspergillus niger）整合靶位點pyrG 基因，使得突變株成為尿嘧啶營養缺陷菌株。然后，在含有遞送外源片段的表達盒兩端引入回復pyrG 功能的同源臂，在同源臂的兩端再引入另一段靶向pyrG 的識別序列。基于此，在體內產生功能的CRISPR 系統將切割三處識別序列，切割含有外源片段質粒的兩處后產生線性化的、與pyrG 具有同源臂的外源片段，該片段可定向插入到第三處切割pyrG 位點產生的雙鏈缺口處，此時pyrG功能得到回復。

1.2 CRISPR-Cas系統的體內表達

在絲狀真菌中構建基于CRISPR-Cas 的基因編輯系統的關鍵在于讓該系統在絲狀真菌中工作，即執行對目標DNA/RNA 的切割或靶向的功能。和體外表達CRISPR-Cas 系統相比，在絲狀真菌體內表達CRISPR-Cas 系統具有不可替代的優勢，也是CRISPR-Cas 系統在絲狀真菌中研究最多、發展最快的方向之一。其原因可能有兩方面：一方面是因為持續表達的CRISPR-Cas 能提高對目標DNA/RNA 的切割或靶向的概率，進而提高基因編輯效率；另一方面，在表達Cas 蛋白的菌株中遞送gRNA 可降低Cas 蛋白和gRNA 無法進入同一細胞核的風險。本小節將系統介紹Cas 蛋白和gRNA 在絲狀真菌體內表達的進展。

1.2.1 Cas蛋白的表達

Cas 蛋白的密碼子優化被認為是促使它在絲狀真菌中發揮功能的關鍵策略。Liu 等［14］嘗試用人源密碼子優化的Cas9 在絲狀真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）中構建CRISPR-Cas 系統時并未獲得成功，采用經里氏木霉的密碼子優化的Cas9 成功構建了CRISPR-Cas9 系統。除了里氏木霉外，采用特定宿主密碼子優化Cas9 的策略在多種絲狀真菌如稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）［26］、靈芝（Ganoderma lucidum）［9］等中，也成功構建了基于CRISPR-Cas 的基因編輯系統。為了保證Cas 蛋白在絲狀真菌的高效表達，除了選用內源強啟動子外［27］，最新一項研究發現在Cas 蛋白中引入內含子也能提高靈芝的基因編輯效率［28］。在Cas9 基因的上游引入靈芝內源3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因gpd 5'端的內含子可使得CRISPR-Cas9中斷5'-單磷酸脫羧酶編碼基因ura3 的效率提高10.6 倍，每轉化107個原生質體可獲得14～18 個基因編輯的突變株，研究者推測這可能是因為內含子的加入有利于異源基因的mRNA 在擔子菌中的積累，進一步增強蛋白的表達［28］。來源于構巢曲霉（Aspergillus nidulans）的AMA1 序列是迄今為止發現的唯一能在曲霉屬中自主復制的元件，Katayama等［29］利用截短至一半的AMA1 序列驅動CRISPR 質粒的復制，將多株米曲霉（Aspergillus oryzae）的基因編輯效率提高到50%～100%，這可能由于AMA1 在細胞以多拷貝的形式存在，提高了Cas9 和gRNA 的表達所致。在該質粒上加入了能抑制菌絲體生長的aoace2 基因表達盒，誘導表達該基因使得CRISPR 質粒快速丟失，便于多輪的基因編輯［29］。

另外，誘導表達的Cas9 由于可調控CRISPRCas系統基因編輯時的活力，減少脫靶效應等，在絲狀真菌中也有不少應用。Weber等［30］利用一個合成的四環素依賴的系統誘導Cas9 在煙曲霉（Aspergillus fumigatus）中表達，在轉化前加入四環素篩選表達Cas9 的菌株，將gRNA 表達盒和分裂失活的篩選標記整合到基因組上，該分裂的篩選標記中間有CRISPR-Cas 系統的靶向目標基因的識別序列，兩側是自我同源序列，經切割后同源重組回復篩選標記的基因功能。通過該設計，可以經篩選獲得靶基因發生編輯的突變體。

基于CRISPR-Cas系統的靶向功能，Huang等［31］在黑曲霉（A. niger）中開發了單堿基編輯器。具體而言，他們將不具有切割DNA 活力的nCas9 或dCas9 與大鼠的胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1 融合，把CRISPR-Cas 識別的靶序列的胞嘧啶轉化為胸腺嘧啶（圖1）。該編輯器編輯報告基因pyrG 和fwnA 的效率為47.36%～100%，編輯非報告基因prtT 的效率為60%，當胞嘧啶位于CRISPR-Cas 識別序列的第2到第9個位置之間時，均可被編輯。

雖然Cas9至今仍是絲狀真菌中應用最多的Cas蛋白，但近兩年，開發Cas12a（Cpf1）在絲狀真菌中進行基因編輯的研究逐漸增多［32-35］。Cas12a和Cas9 同屬于Class ⅡCRISPR-Cas 系統，識別序列、切割方式并不相同。Cas12a 識別的原間隔序列（protospacer）為5'端富含胸腺嘧啶的TTTN，而Cas9 識別的protospacer 為3'端富含鳥嘌呤的NGG；Cas12a 切割DNA 雙鏈產生黏性末端，而Cas9 切割雙鏈DNA 產生平末端。和Cas9 相比，Cas12a 可以識別一個簡單的轉錄本中多個串聯的crRNA，為多基因編輯提供便利。Liu 等利用密碼子優化的AsCpf1 在嗜熱毀絲菌（Myceliophthora thermophila）中構建了基于CRISPR-Cas12a的多基因編輯系統。他們用一個單獨的crRNA 陣列或三個單獨的crRNA 同時靶向碳代謝抑制的轉錄因子cre-1 和兩個與纖維素酶生產相關的基因res-1 和gh1-1，在一步轉化中除了包括Cas12a 和crRNA 的庫（或單一陣列）以外，還有供體DNA 用于修復缺口。和只轉化供體DNA 的對照相比，用crRNA庫和crRNA 陣列分別達到40%和32%的三基因編輯效率。基于CRISPR-Cas12a 介導的高效多基因編輯，Liu 等［35］進一步開發了CRISPR-Cas 輔助的標記回收技術。在編輯的多基因的其中一個基因內部插入neo 標記，在第二次編輯其他基因時同時靶向neo將其敲除，同時引入bar標記。以此類推，在連續轉化中迭代替換標記基因，減少對多個篩選標記的依賴。此外，研究者們還在構巢曲霉（A.nidulans）［34］、棉阿舒囊霉菌（Ashbya gossypii）［33］等絲狀真菌中建立了基于CRISPR-Cas12a 的基因編輯工具。在最新的一項研究中，將不具有切割DNA活力的dCas12a 和一個含有三個轉錄激活結構域的轉錄激活因子VP64-p65-Rta（VPR）融合（圖1），靶向調節構巢曲霉（A.nidulans）中生物合成基因簇的調控區域，可激活基因表達并提高天然產物的產量［32］。

1.2.2 gRNA的表達

作為CRISPR-Cas 系統中另一核心組成成分，gRNA 的高效表達對于該系統在絲狀真菌中功能實現也同樣重要。gRNA 在真核細胞中的表達是由RNA 聚合酶Ⅲ型啟動子驅動的，在對體內RNA 聚合酶Ⅲ型啟動子元件不甚清楚的時候，不少研究者采用了轉化經體外轉錄的成熟的gRNA 的方式，成功實現了黑曲霉（A.niger）［36］、里氏木霉（T.reesei）［14］、靈芝（G. lucidum）［9］、多節孢屬菌（Sporormiella minima）［37］等多種絲狀真菌的基因編輯。但是，和體內轉錄gRNA 相比，體外轉錄gRNA 雖然不依賴體內的啟動子元件轉錄，也存在以下局限：①成本高，過程復雜；②很難保證細胞對其完全吸收；③進入胞內后，在等待Cas蛋白表達的過程中，可能被胞內RNA 酶降解而進一步降低RNP 的濃度。此外，還有研究認為體外轉錄的gRNA 由于穩定性較差不適合轉化絲狀真菌［38］。

圖1 CRISPR-Cas系統介導的絲狀真菌基因編輯［RNP—核糖核蛋白；BM-RNP—仿生礦化的RNP；PEG—聚乙二醇；AMT—根瘤農桿菌介導的原生質體轉化；DSB—DNA 雙鏈缺口；NHEJ—非同源末端連接；HR—同源重組；APOBEC1—載脂蛋白B mRNA 編輯酶（胞嘧啶脫氨酶）；VPR—含有三個轉錄激活結構域的轉錄激活因子；CRISPRa—CRISPR介導的基因轉錄激活系統］Fig.1 CRISPR-Cas system assisted gene editing for filamentous fungi(RNP—ribonucleoprotein; BM-RNP—biomimetic mineralized RNP; PEG—polyethylene glycerol; AMT—agrobacterium-mediated transformation;DSB—double stranded break;NHEJ—non-homologous end joining;HR—homologous recombination;APOBEC1—apolipoprotein B mRNA editing enzyme;VPR—VP64-p65-Rta,a tripartite transcriptional activator domain;CRISPRa—CRISPR activation)

不難看出，體內轉錄gRNA的方法往往更受歡迎。在絲狀真菌中體內表達gRNA主要分為兩類元件：一類是用RNA 聚合酶Ⅱ型啟動子和具有自我剪切功能的核酶；另一類是用宿主內源的RNA 聚合酶Ⅲ型啟動子（圖2）。真核生物中RNA 聚合酶Ⅱ型啟動子比Ⅲ型更為常見。但RNA 聚合酶Ⅱ型啟動子負責mRNA 的轉錄，轉錄后會在轉錄本5'端加帽，3'端加PolyA 尾，引導轉錄本進入細胞質進行蛋白翻譯。在gRNA 的5'端引入錘頭型核酶HH和3'端引入丁型肝炎病毒（HDV）核酶將介導轉錄本自我剪切去掉兩端的修飾，避免后續出核而無法行使引導和靶向的功能。利用該方法驅動gRNA 的表達在棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）［39］、互生交鏈孢菌（Alternaria alternata）［40］、皮炎芽生菌（Blastomyces dermatitidis）［41］、黑曲霉（A.niger）［42］等絲狀真菌中實現了基因編輯。關于利用宿主內源的RNA 聚合酶Ⅲ型啟動子驅動gRNA的表達，u6 基因的啟動子在絲狀真菌中使用最廣泛［15，43-46］。我們在最新一項研究中發現，利用靈芝u6 基因的啟動子驅動gRNA 轉錄時，在3'端引入HDV 能進一步提升基因編輯的效率，推測可能是因為由PolyT 終止的轉錄本會產生不同長短的含有T 的gRNA，而引入HDV 后產生了大小均一的gRNA，有利于RNP 更好地發揮功能［15］。除了U6啟動子外，5S rRNA基因的啟動子能更加高效驅動gRNA 在黑曲霉中的表達。Zheng等［47］用5S rRNA基因啟動子表達gRNA，中斷黑曲霉（A. niger）的一個假定的多肽合成酶編碼基因albA 的效率高達96%，而用不同的U6 啟動子中斷albA 的效率只有15%～23%。他們還發現利用截短5'端區域的5S rRNA 基因啟動子并沒有明顯降低CRISPR-Cas的編輯效率。此外，Song 等［48］測試了37 個tRNA啟動子驅動CRISPR-Cas 系統在黑曲霉中基因編輯的效率，發現其中36 個都能成功介導目標基因的編輯［48］。在2019 年的一項研究中，Shi 等［38］系統比較了三種體內表達gRNA的方式對水稻惡苗病菌基因編輯效率的影響［38］。當用RNA 聚合酶Ⅱ型啟動子加上自我剪切核酶的方式中斷Fusarium cyclin C1 編碼基因fcc1 時，并不能獲得基因編輯的突變體。而用RNA 聚合酶Ⅲ型U6和5S rRNA 啟動子中斷fcc1 時，效率分別是37.5%和79.2%，表明用5S rRNA啟動子表達的策略更為有效［38］。

圖2 CRISPR-Cas系統在絲狀真菌中體內表達策略（針對Cas 蛋白的體內表達，有密碼子優化，采用組成型啟動子驅動蛋白表達和在Cas 基因5'端引入內含子等策略。針對gRNA 的體內表達，有用RNA 聚合酶II型啟動子聯合具有自我剪切功能的核酶表達gRNA、RNA 聚合酶III型啟動子表達gRNA、RNA 聚合酶III型啟動子聯合具有自我剪切功能的核酶表達gRNA等策略）Fig.2 Strategies for in vivo expression of the CRISPR-Cas system in filamentous fungi（For in vivo expression of Cas protein,strategies include codon-optimization,adopting constitutive promoter for driving the expression of Cas protein,and incorporating intron sequence at the 5' end of cas gene. For in vivo expression of gRNA, strategies include adopting polymerase II promoter together with the self-cleaving ribozymes for gRNA expression,adopting polymerase III promoter for gRNA expression,and adopting polymerase III promoter together with the self-cleaving ribozyme for gRNA expression)

1.3 同源臂的設計

當CRISPR-Cas 系統產生DNA 雙鏈缺口（double-strand break，DSB）時，宿主會通過非同源末端連接（none homologous end joining，NHEJ）或同源介導的修復（homology-directed repair， HDR）修補缺口（圖3）。盡管經NHEJ 能在切割位點處缺失或插入片段可導致靶基因失活，但這樣的編輯方式具有隨機性，且不能引入研究者想要的變化。相比之下，HDR 則更為重要，因為在CRISPR-Cas 產生DSB 的同時引入HDR 供體修補缺口，宿主則有可能按照研究者的設計精準編輯靶位點，為研究基因功能、定點突變等奠定基礎。關于同源重組供體的設計，在絲狀真菌中以線性雙鏈DNA 為主，通常在中心位置引入突變，兩側的同源臂緊鄰基因組DSBs，長度為1～2kb 左右［15，49-52］。也有不少研究發現不超過40 bp 的短同源臂就能協助CRISPR-Cas 實現多種曲霉屬絲狀真菌的精準基因編輯［53-54］。Dong等［54］還發現在黑曲霉中，同源臂距離雙鏈缺口越近，基因編輯效率越高。具體而言，他們設計了三段線性的雙鏈DNA供體，供體中間是抗性篩選標記基因hygB，兩側同源臂長度均為39 bp，距離切口分別為0 bp、1 kb和5 kb，經CRISPR-Cas 介導的hygB 的整合效率分別是80%、50%和10%。除了線性同源重組供體外，Katayama 等［29］利用環狀DNA 供體在米曲霉（A. oryzae）中成功實現基因編輯（圖3）。此外，在里氏木霉（Trichoderma reesei）中，環狀DNA供體也可介導高效的基因編輯［14］。有研究者發現，和線性DNA供體相比，環狀DNA供體介導的靶基因編輯效率更高。他們推測原因是完整的環狀DNA 由于缺少DSB，不大會通過在絲狀真菌中占有主導地位的NHEJ修復途徑整合到染色體上，因此，降低了篩選的假陽性率［39］。

圖3 同源重組供體的設計（線性雙鏈DNA 供體，其兩側同源臂長39 bp， 距離CRISPR-Cas 系統產生的DNA 雙鏈缺口5 kb 以內；環狀DNA 供體，兩側同源臂長約0.5～2 kb，中間往往包含篩選標記；單鏈寡核苷酸，供體中突變位點和PAM之間距離不超過7 bp）Fig.3 Design of homologous recombination donor(For linearized DNA,it is flanked by 39 bp HR arms,which are within 5 kb from DSB as generated by CRIPSR-Cas.For circular DNA,it is flanked by HR arms with the size from 0.5 to 2 kb, and a selective marker is usually contained in the middle. For oligo, the intended mutation and PAM sequence are interspaced by no more than 7 bp)

近年來，單鏈寡核苷酸也被設計用于CRISPRCas 編輯絲狀真菌基因時的同源重組供體。N?dvig等［55］設計了90 bp 的寡核苷酸鏈GE-Oligo1 和GEOligo2，分別與CRISPR-Cas 系統靶向的yA 基因的反義鏈和正義鏈互補，在供體中心引入了AAC 至TAA 的無義突變。無論轉化GE-Oligo1 還是GEOligo2，大于90%的轉化子都表現出yA 基因中斷的表型。隨機挑取基因中斷菌株測序發現，當轉化GE-Oligo1時，12個隨機挑取的基因中斷株中有10 株發生了和設計一致的變化，另外兩株除了包含設計的變化以外，一株在TAA 下游3 個堿基處發生了單堿基缺失，另一株在TAA 下游插入了69個堿基的重復序列；當轉化GE-Oligo2時，所有隨機挑選基因中斷菌株都發生了和設計一致的變化，且沒有其他變化發生［55］。最近的一項研究表明，僅60 bp 長度的單鏈寡核苷酸也可以協助CRISPR-Cas 系統精準改變黑曲霉（A.niger）的靶序列，但需要精巧的設計。Kun 等［56］首先利用設計了90 bp 的單鏈寡核苷酸修復CRISPR-Cas 系統切割黑曲霉轉錄因子gaaR 的缺口，該供體包含了兩處點突變：一處是CRISPR-Cas 系統識別的PAM；另一處是距離PAM位點52 bp的突變。遺憾的是用該供體轉化獲得的轉化子只在PAM 的位點發生了突變，離它較遠的突變并沒有發生，保持同樣的設計，將寡核苷酸鏈長度增加至200 bp 仍然不能獲得預期的變化，這說明這些寡核苷酸修復模板并沒有完全插入到雙鏈缺口中。鑒于此，Kun 等重新設計了長度為60 bp 的寡核苷酸供體，將PAM 和預期突變位點的距離縮短至7 個堿基。在挑取的5 個轉化子中，4 個發生了預期變化，僅有1 個轉化子只發生了PAM 位點的突變。他們還設計了另一條60 bp 的寡核苷酸修補模板，除了包括上述2 個突變外，在距離PAM 15 bp 范圍以內還增加了5 處點突變。在隨機挑取的5 個轉化子中，同樣有4 個都發生了預期的7 處改變。綜上，研究者推測距離DSBs 5'端不長于12個堿基的序列，更傾向于作為同源重組的修補模板［56］。

1.4 宿主的改造

在CRISPR-Cas 編輯絲狀真菌的研究中，針對宿主改造的研究尚不多見。如前所述，NHEJ 和HDR 是宿主修復DSB 的兩種形式，抑制或敲除NHEJ是大幅提高宿主HDR的有效策略，也是目前發現通過改造宿主細胞來提高CRISPR-Cas 精準編輯絲狀真菌基因效率的唯一策略。研究者們通常使用NHEJ 途徑失活的絲狀真菌突變體為出發菌株，構建CRISPR-Cas 系統［56-57］。但是，也有研究發現在NHEJ 沒被抑制的絲狀菌株中，CRISPRCas 系統介導的微同源重組同樣能高效地發生［53］（表1），這提示我們可能存在不與NHEJ 競爭的多種同源重組修復途徑。如何改造宿主對DSBs 進行高效的修復，可能還需依賴CRISPR-Cas 等工具首先解析絲狀真菌中的相關修復途徑，才可能提出行之有效的策略。

2 CRISPR-Cas系統編輯絲狀真菌的挑戰及可能的解決方法

CRISPR-Cas 系統改變了外源片段在絲狀真菌中的整合方式，不僅大幅提高多種模式菌株如構巢曲霉（A. nidulans）、里氏木霉（T. reesei）等基因編輯的效率，甚至實現了傳統方法無法編輯的、遺傳操作困難的非模式菌株如靈芝（G. lucidum）等的精準基因編輯［9，15］。盡管如此，CRISPR-Cas系統并沒有改變外源片段轉化絲狀真菌的效率，此外，編輯效率低也是CRISPR-Cas 系統在非模式絲狀真菌中應用的另一大挑戰（表1），本小節將針對這些挑戰分析可能的原因并提出對應的解決辦法。

2.1 轉化效率低

絲狀真菌的細胞壁是吸收外源DNA 的障礙，人們往往以去掉細胞壁的原生質體作為受體接受外源片段，而原生質體的低再生率限制了轉化效率［58］。嘗試開發不依賴于原生質體的遞送外源片段的方式可能是一種解決方法，這可以從其他難操作宿主的遞送方式的有關研究中獲得啟發。在2015 年的一項研究中，研究者設計了菱形縮頸的芯片，當細胞通過比其直徑小的縮頸時，經歷快速的機械變形可形成短暫的膜破裂或孔洞，gRNA和Cas 蛋白在此時可以從周圍的介質進入到細胞中。利用該方法，Han等［59］成功將CRISPR-Cas系統遞送到了多種細胞中，包括難于轉染的淋巴瘤細胞和胚胎干細胞。此外，向自然界學習病毒侵染絲狀真菌的過程［60］，也可開發高效的、不依賴于原生質體轉化的外源片段遞送方式，其關鍵在于系統鑒定病毒在絲狀真菌體內的復制元件。退而求其次，即便經原生質體再生限制了轉化效率，挖掘菌株特異的自主復制元件用于裝載外源片段，也能極大地提高轉化效率。在前文中提到，AMA1是曲霉屬中唯一發現的自主復制元件，有研究表明它能把黑曲霉（A.niger）的轉化效率提高10～100 倍［61］， 也 可 在 產 黃 青 霉 菌（Penicillium chrysogenum）中實現高效的基因敲除［20］。

表1 CRISPR-Cas系統編輯絲狀真菌的典型例子Tab.1 Examples of CRISPR-Cas system assisted gene editing in filamentous fungi.

2.2 編輯效率低

CRISPR-Cas 系統編輯一些絲狀真菌的效率較低，可能有以下幾方面原因：第一，CRISPR-Cas系統發揮功能的前提是Cas 蛋白和gRNA 同時進入同一個細胞核對DNA 進行切除，很多絲狀真菌具有異核性，中斷其中一個細胞核的基因并不意味著另一個細胞核的基因能被有效中斷，這樣的菌株往往因為仍然具有該基因的功能而不被篩選獲得；第二，絲狀真菌內源的防御機制阻礙CRISPRCas 系統進入細胞；第三，絲狀真菌內源的防御機制包括重復序列誘發的點突變和RNA 沉默等［62］，抑制了CRISPR-Cas系統的活力，導致即便CRIPSR-Cas系統同時進入所有細胞核，它們卻不能有效行使靶向和/或切割功能，進而降低了編輯效率。

針對第一點，通過孢子分離等手段獲得單核、單倍體的突變體，以它為出發菌株進行基因編輯，或許是一種解決辦法。針對第二點和第三點，消除或緩解絲狀真菌的多種內源防御是建立在對其充分認識和理解基礎之上的。而正因為不清楚防御機制的關鍵遺傳決定因子，導致某些絲狀真菌的編輯效率無法得到顯著提高。鑒于此，構建親緣關系相近的模式絲狀真菌的全基因組基因中斷突變體庫，利用報告系統考察突變體的表型，將有效地協助研究者解決上述問題。

3 總結與展望

絲狀真菌成熟基因編輯平臺的構建，對挖掘這類微生物在工業、農業、醫藥等多種行業的應用價值與潛力起關鍵作用。CRISPR-Cas 系統由于其組成和設計簡單、特定靶向的優勢，近年來在多種模式和/或非模式絲狀真菌中得到越來越多的應用。基于CRISPR-Cas 系統開發的絲狀真菌基因編輯形式包括特定位點的插入［24-25］、缺失［9］、堿基轉換［31］和轉錄激活［32］。編輯的基因涵蓋了易篩選的標記基因［14］，非篩選標記的其他功能基因［15］，甚至功能未知的基因［63］，同時編輯的5個基因［33］。編輯的尺度可以是改變1 個堿基［55-56］，也可以是缺失長達48 kb的基因簇［47］。在此基礎上，通過中斷宿主NHEJ 的關鍵基因和精妙的同源重組供體設計，使得CRISPR-Cas 系統能在特定位點引入變化，提高了編輯的精準性。

CRISPR-Cas 系統確實提高了不少絲狀真菌的同源重組效率，在有些菌株中能達到100%的編輯效率，節省了篩選標記的使用，克服了這類微生物可使用篩選標記少的限制［35］。然而，在大多數非模式絲狀真菌中，CRISPR-Cas 系統的基因編輯效率并不高［15，64］，很可能是因為人們對這些難操作的宿主的代謝調控、防御機制認識有限，尚不清楚宿主特異性限制CRISPR-Cas 功能的決定因素。如2.2 中所討論的，構建全基因組范圍的基因中斷突變體庫將為解決這一基礎科學問題奠定基礎。關于構建全基因組范圍的突變體庫，我們目前已在一些模式絲狀真菌如Aspergillus nidulans［65］、Neurospora crassa［66］等中看到希望。

致謝：感謝科技部“國家重點研發計劃”（2018YFA09 00600）、國家自然科學基金（319713144和31600071）和上海市自然科學基金（17ZR1448900 和18ZR1420300）對肖晗博士的資助。感謝上海交通大學鐘建江教授等的支持和有益討論。