梭菌正丁醇代謝工程研究進展

聞志強，孫小曼，汪慶卓，李亞楠，劉文正，蔣宇，楊晟，3

（1 南京師范大學食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210046；2 中國科學院上海生命科學研究院湖州工業生物技術研發中心，浙江 湖州 313000；3 中國科學院分子植物科學卓越創新中心，中科院合成生物學重點實驗室，上海 200032）

2019 年我國原油和石油對外依存度雙破70%，連續多年保持低速穩步增長態勢。一旦因疫情、戰爭或其他事件爆發造成我國外部資源進口遭到封鎖，我國能源供給必須通過其他資源補充。另外，2020 年9 月22 日，習近平主席在第七十五屆聯合國大會上莊嚴承諾，中國的二氧化碳排放力爭于2030 年前達到峰值，努力爭取2060 年前實現碳中和，這要求我國必須加快發展生物能源，減少碳排放。生物質是眾多可再生資源（如太陽能、風能、水能、地熱能等）中唯一一類以碳為基礎的實物性的資源，有潛力替代化石原料生產液體燃料、大宗化學品等，同時可減少碳排放。因此，生物煉制，特別是以豐富、廉價的木質纖維素為原料的綠色生物制造技術在保障國家能源安全和實現碳中和方面意義重大［1］。另外，它也在制止農作物秸稈焚燒、保護環境、促進農村經濟發展等方面有重要作用。

正丁醇（以下丁醇若未特別說明均指正丁醇）是重要的大宗化學品和目前最易工業化、最易普及的可再生、替代性車用燃料之一，可由石油煉制或者梭菌發酵制取。在強調能源安全和碳中和的未來，以生物質為原料的丁醇發酵產業有望迎來新一輪發展機遇。然而，生物丁醇發酵面臨著梭菌育種困難、副產物多、丁醇產量低/比例不高、底物利用效率低等問題［2］。幸運的是，近年來在合成生物學技術的驅動下，產丁醇梭菌在遺傳操作工具開發領域取得很大進步，有力推動了梭菌在丁醇合成途徑優化、底物譜拓展等領域的研究［3-5］。本文作者總結了近年來梭菌丁醇代謝工程的研究進展，力圖勾勒本領域的研究概貌，為后續研究提供借鑒。

1 生物法合成正丁醇的途徑和底盤

產溶劑梭菌如丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）的溶劑發酵［也稱ABE（acetonebutanol-ethanol）發酵］是制備生物丁醇的最主要的方法［6］。歷史上，溶劑發酵也一度成為僅次于酒精發酵的世界第二大發酵工業。產溶劑梭菌中的丁醇合成途徑已經非常清楚，是經典的輔酶A（CoA）依賴的碳鏈延長途徑（圖1）。

近年來，隨著合成生物學的發展，一些新的丁醇合成途徑被鑒定出來，同時跨物種募集基因元件以及重塑底盤細胞成為可能。于是，經典途徑可以被改造優化，而一些新的丁醇合成途徑被解析和組裝，并在一些遺傳背景清晰，遺傳操作工具豐富的底盤細胞如大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等中被重構、調試和應用［7］。圖1列舉了微生物利用各種底物合成正丁醇的代謝途徑，主要包括：①CoA依賴的合成途徑；②ACP依賴的合成途徑；③2-酮酸合成途徑。

1.1 CoA依賴的正丁醇合成途徑

CoA 依賴的正丁醇合成途徑是產溶劑梭菌中天然存在的丁醇合成途徑，也在其他類型微生物中完整地或者部分地存在。該途徑的前體隨底物代謝途徑的變化而有所不同［8］。對食糖類或者食纖維素類微生物，其前體為糖酵解途徑產生的丙酮酸；對食甘油類微生物，前體為甘油還原途徑產生的丙酮酸；而對食氣類微生物而言，前體為合成氣經Wood-Ljungdahl 途徑代謝產生的乙酰輔酶A。接下來，代謝進入以乙酰輔酶A 為起點的CoA 依賴的碳鏈延長途徑。首先2 分子乙酰輔酶A 縮合（或經轉乙酰基/羧化作用）形成1 分子乙酰乙酰輔酶A，然后還原為3-羥基丁酰輔酶A，接著脫水形成巴豆酰輔酶A，再還原為丁酰輔酶A，最后經醇醛脫氫酶2 步脫氫還原為丁醇［9］。

該途徑的優點是，在產溶劑梭菌中該途徑已經研究得比較清楚，可以比較方便地異源引入其他底盤細胞以合成丁醇。James Liao 實驗室早在2008 年率先將丙酮丁醇梭菌中的CoA 依賴的丁醇途徑基因導入大腸桿菌，并通過刪除大腸桿菌內部旁路基因及優化培養方法進一步提升產量至0.55 g/L［10］；同 年 晚 些 時 候，Jay Keasling 和Hideaki Yukawa 實驗室也分別在大腸桿菌和釀酒酵母中以類似方法實現了丁醇生產，產量分別為1.18 g/L和25 mg/L［11-12］。

之后，相關研究逐漸拓展到其他非梭菌的宿主中，如惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）［13］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［13］、丁醇耐受性高的短小乳桿菌（Lactobacillus brevis）［14］、乙酰輔酶A前體豐富的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）［15］、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）［16-17］、藍藻（Synechocystis）［18-19］、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）［20-22］等，如表1所示。

表1 各種微生物發酵生產正丁醇進展比較Tab.1 Comparison of n-butanol production by various microorganisms

需要指出的是，上述研究結果的丁醇產量普遍不高，這說明在異源宿主中直接引入的產溶劑梭菌丁醇合成途徑可以實現丁醇合成，但在天然狀態碳和還原力并不過多地往丁醇合成途徑匯聚。原因一方面在于副產物分流，即在部分代謝節點如丙酮酸、乙酰輔酶A、乙酰乙酰輔酶A、丁酰輔酶A等存在2，3-丁二醇、乙醇、乙酸、丙酮、丁酸等合成途徑，它們可能會消耗丁醇合成所需的碳流或還原力［45］；另一方面，對氧氣敏感而且催化方向可逆的BCD/ETFAB 酶復合體（丁酰輔酶A 脫氫酶）也被認為是影響異源丁醇產量的重要原因［10］。因此，如何尋找合適的催化不可逆反應的酶替代BCD/ETFAB，并合理設計和布局底盤細胞途徑來驅動碳流和電子流往丁醇合成方向并減少副產物是至關重要的。

在新酶替代方面，Bond-Watts 等［46］于2011 年嘗試了齒垢密螺旋菌（Treponema denticola）來源的反式二烯酰CoA 還原酶Ter（trans-enoyl-CoA reductase）。它能不可逆地催化巴豆酰輔酶A為丁酰輔酶A。于是研究者們在大腸桿菌中過表達真養產堿桿菌（Ralstonia eutrophus）來源的乙酰乙酰CoA 合酶基因phaA，齒垢密螺旋菌來源的ter，以及丙酮丁醇梭菌來源的hbd、crt、adhE2 基因組成雜合的CoA 依賴的丁醇合成途徑。另外，過表達丙酮酸脫氫酶復合體操縱子aceEF.lpd 增加前體乙酰輔酶A 的供給，最終生產丁醇4.65 g/L，遠超同類研究。同年，Liao 實驗室也將ter 引入丁醇途徑構建中，更進一步地，他們對底盤細胞大腸桿菌做了理性設計，通過敲除大腸桿菌中幾乎所有還原力消耗途徑（包括丁二酸、乙醇、乳酸等合成途徑），構建了一個厭氧解救平臺，迫使大腸桿菌只能通過生產丁醇來消耗還原力從而存活和實現胞內氧化還原平衡。最終獲得的重組菌在搖瓶中可產15 g/L 丁醇［23］。這顯示了不可逆酶引入與底盤細胞理性設計的巨大潛力，是電子流驅動碳流的經典案例。

在另外幾個研究中，Liao 實驗室延續了這一思路，不同的是以ATP 作為驅動力。他們先是在光能自養細長聚球藻（Synechococcus elongatus PCC 794）中構建了雜合的丁醇途徑，接著替換了部分關鍵途徑基因，利用ATP 驅動反應將乙酰CoA 轉化為丙酰CoA，丙酰CoA 再與乙酰CoA 脫羧縮合驅動乙酰乙酰CoA 的生成，之后又將醛醇脫氫酶（AdhE2）替換為氧耐受的醛脫氫酶（PduP）和醇脫氫酶（YqhD），最終得到的重組藻種通過光和CO2培養12 天可積累產丁醇0.404 g/L［18，19，47］。

還有一種比較特殊的CoA 依賴的丁醇合成途徑是利用脂肪酸-β-氧化中硫酯酶的逆反應，以乙酰CoA 為起點通過反式β-氧化實現碳鏈延長。Dellomonacol 等［24］在大腸桿菌MG1655 中實現了這一途徑，重組菌可產丁醇14 g/L，丁醇轉化率達到0.33 g/g 葡萄糖。目前在這一途徑應用于丁醇生產的研究非常少，但也極具啟發性。

1.2 2-酮酸依賴的正丁醇合成途徑

2-酮酸是氨基酸合成及轉化途徑的中間產物，也是丁醛合成的前體物質，而丁醛僅需通過一步還原即可生產丁醇，因此某些氨基酸的代謝途徑可用于丁醇合成。目前已報道的途徑主要有2 種。一種是從TCA 循環中的草酰乙酸出發，經天冬氨酸和蘇氨酸合成途徑，生成2-酮基丁酸；2-酮基丁酸經2-異丙基蘋果酸合酶作用生成蘋果酸-2-乙酯，接著異構為蘋果酸-3-乙酯，進一步脫羧氧化為2-酮基戊酸；2-酮基戊酸脫羧生產丁醛，丁醛還原生產丁醇［48］。另一種是從丙酮酸出發形成檸蘋酸再脫羧氧化，生成2-酮基丁酸，最后生成2-酮基戊酸和丁醇［49］。

Liao 實驗室最早開始這方面的嘗試。他們證明，只需簡單地表達酮酸脫羧酶和醇醛脫氫酶（乳酸乳球菌來源的酮酸脫羧酶Kvid和釀酒酵母來源的醇脫氫酶ADH2）即可實現丁醇及其他高級醇（如異丁醇、異丙醇等）的生產［48］；另外，他們還嘗試了過表達詹氏甲烷球菌來源的檸蘋酸合酶（CimA）合成檸蘋酸，再脫羧氧化到2-酮基丁酸、3-酮基戊酸，最后在Kivd 和ADH2 的催化下實現丁醇生產［49］。與Liao 實驗室不同，伊利諾伊大學香檳分校趙惠民實驗室以釀酒酵母為底盤細胞生產丁醇。他們對釀酒酵母的2-酮基戊酸途徑做了深入改造，并理性設計了底盤細胞，丁醇產量最高可達0.835 g/L［20-21，30］。

最近報道的一種新途徑是從甘氨酸出發，氧化為乙醛酸，然后與丁酰輔酶A 經蘋果酸合酶催化生成蘋果酸-3-乙酯，再脫羧氧化為2-酮基戊酸，最后一路脫羧還原得到丁醇。Branduardi 等［22］在釀酒酵母中通過表達甘氨酸氧化酶（goxB）實現了這一途徑，但需要以甘氨酸作為輔助碳源，最終丁醇產量92 mg/L。

2-酮酸依賴的丁醇合成途徑的優點是可以利用菌株內源的氨基酸代謝途徑，只在關鍵代謝節點引入朝向丁醇合成代謝的酶即可。但缺點也很明顯，部分宿主的氨基酸代謝流量偏低，導致丁醇普遍產量偏低，需要以氨基酸為輔助碳源，或者進一步改造提升氨基酸前體供應。

1.3 ACP依賴的正丁醇合成途徑

ACP 依賴的丁醇合成途徑以乙酰輔酶A 為起點，以脂肪酸合成的方式來實現碳鏈延伸。與CoA 依賴的途徑不同的是，它合成的是脂酰-酰基載體蛋白（ACP），比如乙酰-ACP 和丙二酰-ACP。待兩者縮合為乙酰乙酰-ACP 后，途徑類似于CoA依賴途徑的還原、脫水和還原，形成丁酰-ACP，再經酰基-ACP 硫酯酶剝離ACP，使之轉化為相應的丁酸，再經羧酸還原酶形成丁醛，然后還原為丁醇。ACP 依賴的丁醇合成途徑也可以視為脂肪酸合成途徑的一部分，因而不需要絕對厭氧條件［25］。氧氣的可及性在一定程度上甚至可以刺激丁醇合成。Jones 等［25］改造大腸桿菌獲得丁酰-ACP，再由ACP 硫酯酶、羧酸還原酶（CAR）和醛還原酶（AHR）作用合成丁醇，在氧氣存在條件下，可生產丁醇0.3 g/L，顯示了較好的潛力。

表1比較了各種微生物利用不同原料合成丁醇的情況。可以看出，利用和改造CoA依賴的丁醇合成途徑是主流，2-酮酸和ACP依賴的途徑的報道相對較少，而且丁醇產量偏低。另外，丁醇合成的底盤細胞也由最初的產溶劑梭菌如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）［38］、糖丁酸多乙酸梭菌（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）［35］等，逐漸拓展到大腸桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、藍藻等模式微生物，以及一些有特殊潛能的底盤細胞，如解脂耶氏酵母（乙酰輔酶A 前體充足）、短小乳桿菌（丁醇耐受性高）等。值得一提的是，大腸桿菌、釀酒酵母等底盤細胞雖不能天然地合成丁醇，但其遺傳背景清晰，遺傳操作工具豐富，可進行比較復雜的遺傳改造以理性設計合成途徑，故而個別研究的丁醇產量已經接近甚至超過傳統產溶劑梭菌的丁醇生產水平。然而，一個潛在的劣勢是，經過多輪煩瑣和復雜的遺傳改造后，工程菌胞內輔因子平衡以及菌株魯棒性可能比較脆弱，不太容易適應粗放的工業發酵條件。

產溶劑梭菌作為丁醇的天然細胞工廠，在產量和生產魯棒性上有較大優勢，然而難在遺傳操作工具匱乏，以及底物譜狹窄［3，50］。幸運的是，近年來合成生物學的發展，已在很大程度上解決了這些困難，酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）［51］、永達爾梭菌（Clostridium ljungdahlii）［40］、嗜纖維梭菌（Clostridium cellulovorans）［52］等菌株的遺傳操作系統和操作工具先后被開發出來，并被改造利用各種原料合成丁醇。

2 產正丁醇梭菌遺傳操作工具開發

梭菌是原核生物中很重要的一個大類，包括近200 個不同的種［53］。梭菌來源廣泛，大多數是梭狀革蘭氏陽性菌，專性厭氧，遇到惡劣環境產孢。基因組GC 含量低（一般在26%～32%）。按其致病性可分為致病性梭菌和非致病性梭菌，其中部分非致病性梭菌如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等由于能夠利用淀粉、糖蜜等糖類原料發酵生產大宗的化學品如乙醇、丁醇、丙酮等，被稱為產溶劑梭菌，有著重要的工業應用價值。還有部分梭菌能夠直接以木質纖維素或者合成氣（含氫氣、一氧化碳、二氧化碳等）為原料生產短鏈的有機酸或者醇類，也具有很大的丁醇開發潛力［8］。

1992 年，Mermelstein 等鑒定并克服了質粒轉移至丙酮丁醇梭菌的主要障礙——Ⅱ型限制性內切酶Cac824I，首次實現了對丙酮丁醇梭菌ATCC824 的代謝工程改造［54］。2001 年，丙酮丁醇梭菌ATCC824 基因組測序完成［55］，這大大加速了梭菌遺傳改造進展。此后，隨著梭菌中各種Ⅱ型限制性內切酶和功能復制子的不斷鑒定，更多的能夠免于梭菌內限制修飾（R&M 系統）破壞的穿梭型質粒被開發出來，使得梭菌的DNA 轉移技術取得很大進步，同時也發展出了多種遺傳操作技術［56-60］。

圖2 梭菌遺傳操作工具開發的里程碑式進展（藍色字體代表基于同源重組的遺傳操作工具，紅色字體代表不依賴于同源重組的遺傳操作工具）Fig.2 Milestones in the development of genetic manipulation tools for clostridia(Blue font represents genetic manipulation tools based on homologous recombination,and red represents genetic manipulation tools independent on homologous recombination)

圖2列舉了近年來梭菌遺傳操作工具開發的里程碑式進展。可以看出，基于同源重組單交換的基因敲除研究早在1994 年就已經報道［61］，但由于梭菌較弱的DNA 修復能力和很低的質粒轉化效率，基于同源重組（homologous recombination，HR）的遺傳工具很不好用，嚴重遲滯了梭菌的基因功能鑒定以及代謝工程研究。盡管不依賴于同源重組的RNA 干擾技術及其改進版本于隨后幾年被成功引入梭菌，但因只能在轉錄水平影響菌株，反響不大［62-63］。這一局面一直到TargeTron 技術的出現才得以扭轉。TargeTron 是一種靶向基因編輯技術，它依賴于二型內含子的點特異性插入，而不是同源重組，因此非常適合梭菌的基因中斷［64］。中科院上海植生所楊晟/姜衛紅合作組和英國諾丁漢大學Nigel Minton課題組于2007年分別獨立地開發了適用于產溶劑梭菌的依賴于乳球乳酸菌（Lactococcus lactis）來源的ⅡA 型內含子（Ll.LtrB）TargeTron 技術［65-66］。根據內含子上的識別序列與目的基因之間的配對作用具有特異性的原理，Nigel Minton 課題組還建立了名為“ClosTron”的網站（www.clostron.com），提供在線免費的內含子序列設計工具［67］。TargeTron技術幾乎不具有宿主特異性，因此幾乎適用于所有梭菌，如產溶劑梭菌Clostridium phytofermentans、C. butylicum、C. tyrobutyricum， 以及纖維素降解梭菌C.cellulolyticum、C. cellulovoran，還有食氣梭菌C.ljungdahli、 C. autoethanogenum 等［65］。 此 外，Mohr 等開發了適用于用于嗜熱梭菌［例如，熱纖維梭菌（C.thermocellum）］的TargeTron 技術［68］，這避免了中溫TargeTron技術在嗜熱菌中的低效率。然而，TargeTron 技術存在一些固有的缺陷，例如存在潛在的脫靶效應和一定概率的極性效應，以及只能中斷而不是精確編輯目的基因等［50，69］。

通過單/雙交換過程進行等位基因交換是基于同源重組進行精確基因編輯操作的經典遺傳工具。它可以實現靶基因無痕的點突變、定點插入或者精確刪除等操作。唯一的障礙是，由于梭菌的同源重組效率低和質粒轉化效率低，獲得陽性單交換突變株，或陽性雙交換突變體的概率非常低［70］，需要多次重復傳代（積累轉化子）以及大量的轉化子驗證才能篩選到罕見的陽性單交換突變株；引入反篩標記（如mazF和tdc 等）［71-72］或者歸巢內切酶I-SceI［73］，可以在第二次單交換時過濾掉絕大部分單交換突變株，減少驗證雙交換突變株的工作量，但仍然面臨著較長的操作周期和較低的第一次單交換效率等問題。

在梭菌中引入CRISPR-Cas9 系統可有效提升第一次單交換頻率，因為核酸酶Cas9 蛋白可以在sgRNA 引導下識別和切割梭菌基因組，在特定位點導致DNA 雙鍵斷裂（double strand break，DSB），迫使梭菌不得不啟用DNA修復系統以完成同源重組，而未能完成同源同組（或DNA 修復）的菌株將被過濾掉，這大大加快了獲得第一次單交換陽性突變株的進程［74］。然而，梭菌較低的同源重組效率往往導致DNA 雙鏈斷裂無法修復，即第一次單交換陽性突變株比較難以獲得［75-76］；此外，低的質粒轉化效率進一步從轉化層面上限制了陽性轉化子的出現，也即在CRISPR-Cas9 系統及修復同源臂元件轉化后往往沒有或者僅有極少轉化子出現。

為了避免雙鍵斷裂造成的細胞毒性，Xu 等［77］和Li等［75］分別在解纖維梭菌和丙酮丁醇梭菌中以Cas9刻痕酶（nCas9，nickase）替代Cas9進行基因編輯。nCas9 是Cas9 的突變體（D10A 或H840A），突變了2 個切割結構域（RuvC 或HNH）中的1 個，僅能切割DNA的一條鏈造成DNA缺刻，因而毒性較小。DNA 缺刻可在不嚴重傷害梭菌的同時，刺激梭菌啟動同源重組修復，因而有效提升了CRISPR/nCas9 系統在梭菌中的基因編輯效率［75，77］。另外，CRISPR/Cpf1 也在艱難梭菌及產溶劑梭菌中有成功應用［78］。目前，大部分梭菌都是采用外源的CRISPR 系統進行基因編輯，也有少數借助內源CRISPR 系統實現基因組編輯的，如巴氏梭菌（Clostridium pasteurianum）［79］和酪丁酸梭菌（C. tyrobutyricum）［34］可分別利用自身的I-B 型CRISPR系統進行基因編輯。

在CRISPR-nCas9 基因編輯系統基礎上，Li等［80］開發了該系統輔助的攜帶有胞苷脫氨酶（Apobec1）和尿嘧啶DNA 糖基化酶抑制劑（UGI）的堿基編輯系統。在該系統中，Apobec1和UGI可以有效地將CRISPR-Cas9 靶向窗口序列中的特定C·G 核苷酸堿基對轉換為T·A，從而可以在基因中產生錯義突變或無效突變。它與Cas9 介導的基因組編輯一樣精確，但是不必切割DNA，因而它不需要DNA 修復模板。這個堿基編輯系統很容易設計和操作，并且在理論上可以編輯梭菌中的任何基因，極具應用潛力。

除基因組編輯外，CRISPR-Cas 系統還可用于調節基因表達［44，75，81］，類似于經典的反義RNA技術［62-63］，以及最近出現的基于小RNA 的基因下調技術［82］。CRISPR-Cas 系統也有望與傳統的轉座子技術結合（轉座子技術可通過轉座酶將隨機插入失活這種突變形式引入基因組，以構建用于篩選特定表型的突變文庫［83-86］）。最近，Strecker 等在大腸桿菌中開發了一種具有CRISPR 相關轉座酶的RNA引導的DNA插入方法［87］。該方法不依賴于同源重組，可望被引入梭菌中用于外源基因的染色體定點整合。事實上，Heap 等已在梭菌中開發了基于等位基因替換的目的基因染色體整合方法，并成功整合了超過40 kb 長λ 噬菌體染色體到丙酮丁醇梭菌中［88］，但在實驗設計、操作方面仍然比較麻煩，尤其在轉化子獲得和驗證時易遭遇轉化子少、假陽性高等挑戰。最近Huang 等［89］開發了噬菌體絲氨酸整合酶介導的不依賴同源重組的染色體整合方法，但需預先利用CRISPR/Cas 系統或者別的方法將整合酶識別序列整合到染色體預定位置。

表2 總結和比較了各種遺傳操作工具的原理效果以及優缺點。在CRISPR/Cas 系統出現之前，TargeTron 一直是梭菌基因敲除的首選，但是現在正逐步被CRISPR/nCas9 或者CRISPR/cpf1 以及它們輔助的堿基編輯技術替代。目前來看，CRISPR-Cas 系統是一種顛覆性技術，幾乎完全改寫了梭菌遺傳操作技術發展的進程，但梭菌的同源重組能力低仍是編輯效率的瓶頸，需要通過引入諸如RecT 之類的重組元件來進一步提高［90］。

3 梭菌正丁醇合成途徑改造研究進展

如前所述，丁醇是溶劑發酵的主要產物。一般來說，溶劑發酵結束時丁醇、丙酮和乙醇的質量比在6∶3∶1左右，也即丁醇僅占溶劑總量的大約60%。在梭菌中，丁醇合成從屬于溶劑發酵，受溶劑發酵途徑和調控的制約［6］。如圖3所示，丁醇合成的主途徑涉及的酶有Pfk/Pyk/Pfor（負責糖酵解途徑以及前體丙酮酸和乙酰輔酶A 的合成和供應）、Thl/Hbd/Crt/Bcd-ETFAB（負責碳鏈延長及丁酰輔酶A 供應）、Aad/Ald/Bdh（負責丁酰輔酶A還原和丁醇生成）。副產物途徑涉及的酶有Pta/Ack（負責乙酸合成）、Aad/Ald/Bdh（與丁醇合成途徑相同，負責乙酰輔酶A 的還原和乙醇合成）、Ptb/Buk（負責丁酸的合成）、CtfAB/Adc（負責丁酸、乙酸的回用，以及丙酮的合成）。在部分梭菌中還存在2，3-丁二醇以及異丙醇的合成途徑。副產物途徑的存在導致了丁醇產量及丁醇比例不高等問題，影響了丁醇生產的經濟性。豐富的適用于梭菌的遺傳操作工具，為丁醇合成途徑的代謝工程改造提供了便利條件。前述遺傳操作工具多數已被應用于丁醇合成途徑及競爭途徑的改造或者調試，以進一步提升丁醇的產量、比例，或者擺脫原有途徑及調控約束，從頭構建丁醇途徑。

表2 梭菌遺傳操作工具比較Tab.2 Comparison of different genetic tools applicable in Clostridium

圖3 梭菌正丁醇合成途徑代謝工程改造（圖中所示基因表達的酶：pfk—6-磷酸果糖激酶；fba—果糖-二磷酸醛縮酶；pyk—丙酮酸激酶；ilvB—乙酰乳酸合酶；aldc—乙酰乳酸脫羧酶；acr—乙偶姻還原酶；pfor—丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化酶；hyd—氫酶；pta—乙酰基磷酸轉移酶；ack—乙酸激酶；thl—硫解酶；hbd—3-羥基丁酰CoA 脫氫酶；crt—巴豆酸酶；bcd—丁酰CoA 脫氫酶；ter—反式烯酰輔酶A 還原酶；ptb—磷酸丁酰轉移酶；buk—丁酸激酶；ctfAB—乙酰乙酰CoA：乙酸/丁酸：CoA轉移酶；adc—乙酰乙酸脫羧酶；sadh—異丙醇脫氫酶；adh—乙醇脫氫酶；bdh/edh—丁醇/乙醇脫氫酶；adhE—醇/醛脫氫酶）Fig.3 Metabolic engineering of clostridia for n-butanol production(pfk—6-phosphofructokinase; fba—fructose-bisphosphate aldolase; pyk—pyruvate kinase; ilvB—acetolactate synthase; aldc—acetolactate decarboxylase; acr—acetoin reductase; pfor—pyruvate-ferredoxin oxidoreductase; hyd—hydrogenase; pta—phosphate acyltransferase; ack—acetate kinase; thl—thiolase; hbd—3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase; crt—crotonase; bcd—butyryl-CoA dehydrogenase; ter—trans-enoyl-CoA reductase; ptb—phosphobutyryl transferase; buk—butyrate kinase; ctfAB—acetoacetyl-CoA: acetate/butyrate: CoA transferase; adc—acetoacetate decarboxylase; sadh—isopropanol dehydrogenase; adh/edh—alcohol/ehanol dehydrogenase; bdh/edh—butanol/ehanol dehydrogenase; adhE—alcohol/aldehyde dehydrogenase)

3.1 代謝途徑改造提升正丁醇產量

產溶劑梭菌的丁醇產量一般在10 g/L左右，距離菌株對丁醇的耐受極限（15～20 g/L）還有一定距離，因而有較大的提升空間［2］。低的丁醇濃度大幅增加了后續產物分離能耗和成本。據推測，傳統丁醇發酵過程產物分離成本約占總成本的20%，而丁醇濃度由12 g/L 提高至19 g/L 時產物分離成本可降低一半［91］。現有的丁醇產量提升的策略很容易理解，主要通過增強主途徑，弱化或者刪除副產物途徑來實現，有關進展如表3所示。

在主途徑增強方面，增加前體如丙酮酸或者乙酰輔酶A 供應，疏通/增強碳鏈延長途徑增加丁酰輔酶A 供給，以及強化丁酰輔酶A 還原最常用到。Ventura 等［92］過表達了內源的6-磷酸果糖激酶基因（pfkA）和丙酮酸激酶基因（pykA），提高了糖酵解通量，增加了ATP 和NADH 供應，使丙酮丁醇梭菌ATCC 824 的丁醇產量提高了29%，達到19.12 g/L。在另一項研究中，Mann等［93］過表達了點突變的硫解酶基因（thl）（R133G，H156N；G222V）（硫解酶對HS-CoA 非常敏感，微摩爾水平抑制效應就很明顯；3 處點突變減弱了輔酶A 對硫酯酶的反饋抑制），增強了Thl 催化乙酰輔酶A縮合的能力，促進了主途徑代謝，結果丁醇產量增加18%，達到12.4 g/L。類似地，Li 等［94］在C.diolis DSM 15410 中過表達了齒垢密螺旋菌來源的

反式烯酰輔酶A 還原酶基因（ter），不可逆地催化巴豆酰輔酶A 為丁酰輔酶A，以對沖內源的Bcd-ETFAB 的可逆催化效應，更大程度地將碳流往丁酰輔酶A 方向拉動，使得重組菌的丁醇產量因此提升了50.5%。同樣，Hou 等［95］在丙酮丁醇梭菌ATCC824 中過表達主途徑基因thl-hbd-crt-bcd 也增強了丁醇生產。在丁酰輔酶A 還原方面，主要用過表達野生型醇醛脫氫酶基因aad（或adhE）及其突變體aadD458G（485 位天冬氨酸突變為甘氨酸后，Aad 對NADH 和NADPH 均有較好親和力，擴大了還原力來源范圍）來實現丁醇增產［37，97-98］。在丙酮丁醇梭菌ATCC 824 中，aadD458G的過表達使丁醇增產11.3%；進一步表達拜氏梭菌（C.beijerinckii）來源的醛脫氫酶基因（ald），以及永達爾梭菌（C.ljungdahlii）來源的丁醇脫氫酶基因（bdh）時，丁醇產量增加了27.1%，達到16.9 g/L［98］。

表3 正丁醇產量提升進展Tab.3 Summary of n-butanol titer enhancement in Clostridium

在副產物途徑弱化或敲除方面，乙酸途徑往往是首選。Cooksley等［99］用TargeTron中斷了丙酮丁醇梭菌的乙酸激酶基因（ack），丁醇產量有22.9%的提升；而在另一個丙酮丁醇梭菌的研究中，Jang 等［45］同樣以TargeTron 中斷了（ack）（中斷位點不同），丁醇產量卻未見明顯變化；有趣的是，當他們以TargeTron 中斷乙酰基磷酸轉移酶基因（pta）時，溶劑產量大幅增加，其中丁醇增加45.8%達到17.2 g/L；乙醇增加100%達到1.8 g/L，丙酮增加42.6%達到7.7 g/L。關于丁酸途徑的弱化，Green 等［104］以非復制型質粒整合的方法敲除了丁酸激酶基因（buk），突變株的丁醇濃度提高10%。利用反義RNA技術下調buk基因轉錄的菌株也有類似表型［62］。在另一項研究中，Jang 等以TargeTron技術分別中斷了丁酸途徑相關基因ptb和buk。其中ptb 的中斷提升了丁醇產量17.8%達到13.9 g/L（乙醇產量幾乎不變）；而buk 的中斷使丁醇產量增加28.8%，達到15.2 g/L，同時乙醇和丙酮也分別有111%和48.1%的增加［45］。至于乙酸和丁酸途徑的組合敲除，Jang 等也有嘗試。他們以TargeTron 連續中斷了pta 和buk 基因，丁醇增加35.6%，達到16 g/L。產酸途徑的單獨或組合敲除在另一種重要的產溶劑梭菌拜氏梭菌中也有較多研究。Wang 等［105］在拜氏梭菌NCIMB 8052 中分別敲除buk 和pta 基因，敲除菌產丁醇濃度分別提高28%和12%。而Liu 等［101］在連續中斷了pta 和buk 后，突變株的丁醇產量提升了36.4%，達到12.64 g/L。意外的是，Liu等發現突變株的碳源利用有明顯變化，葡萄糖、木糖利用幾乎可以同步進行。

相比于單獨的主途徑增強或者副產物途徑弱化，組合策略往往有更好的效果。Jang等［45］在pta和buk 組合敲除菌株的基礎上，過表達了醇醛脫氫酶基因的突變體adhe1D485G（485位天冬氨酸突變為甘氨酸后，AdhE1對NADH 和NADPH 均有較好親和力，擴大了還原力來源范圍），拉動碳流往丁醇方向，使丁醇產量達到18.9 g/L，優于以往任何重組的產丁醇梭菌。在最近的一個研究中，Ngoc-Phuong-Thao 等［103］連續刪除了乳酸合成途徑基因ldhA，酸回用途徑基因ctfAB，丁酸合成途徑基因ptb 和buk，并同時過表達了thl 和3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶基因（hbd）增強主途徑。作者沒有明確菌株的間歇發酵表型，但在連續發酵且輔以氣提移除丁醇抑制的條件下，丁醇產量達到驚人的500 g/L。

需要說明的是，以上研究中的乙酸和丁酸途徑基因的單獨或者組合中斷，并沒有完全消除乙酸或丁酸的生產，這暗示可能存在未知的酸合成途徑［45］。另外，ptb 基因的敲除、中斷或者轉錄下調操作需要謹慎，因為其催化產物丁酰磷酸是胞內重要的磷酸基團供體，對全局性的代謝調控有較大影響，也許會降低丁醇產量［106］。至于個別文獻之間的相同基因的中斷或者敲除的效果迥異甚至互相矛盾的現象，也要辯證看待，要考慮到遺傳操作工具的局限性（如脫靶、極性效應等）以及實驗設計的嚴謹性（比如是否有對照試驗，敲除基因的補全實驗等）。

3.2 代謝途徑改造提升正丁醇比例

目前產溶劑梭菌的丁醇得率普遍在0.2 g/g 葡萄糖左右，遠低于按化學計量學計算出來的理論得率（0.41 g/g）［2，6，91］。丁醇比例的提升有望在丁醇得率、產物分離等方面提升丁醇發酵的經濟性，因而一直是重要的努力方向。眾所周知，溶劑發酵是個典型的雙階段過程，分為“產酸期”和“產溶劑期”。在產酸期，梭菌利用碳源快速增殖，通過底物磷酸化過程產生丁酸、乙酸和ATP，pH迅速下降；在第二階段，丁酸和乙酸被梭菌通過輔酶A 轉移酶（CoA-transferase，CTFAB）回用，pH緩慢回升。酸回用可消除酸的毒性作用，同時為乙醇和丁醇的合成提供乙酰輔酶A和丁酰輔酶A等前體，但也導致副產物丙酮的生成。所以，盡管增強酸回用途徑也是一種重要的丁醇增產策略，但它可能會在一定程度上降低丁醇比例，因而一般會謹慎使用［107］。丙酮是梭菌丁醇發酵的主要副產物，阻斷或者減少丙酮的合成是提高丁醇比例的關鍵［108］。

如圖3 所示，丙酮的合成途徑與輔酶A 轉移酶（CTFAB）以及乙酰乙酸脫羧酶（ADC）密切相關，因而它們成為最主要的改造靶點。Papoutsakis ET課題組最早嘗試利用反義RNA（antisense RNA，atRNA）抑制丙酮合成途徑。他們發現adc 的轉錄下調并不會顯著影響丙酮產量（因為可能存在自發的脫羧反應），而輔酶A轉移酶CTFAB的下調導致丙酮和丁醇產量同時下降（下降近1/3），盡管丁醇比例有一定提升，但并不具有實際意義［37，63］。TargeTron 技術出現后，Jiang等［108］在丙酮丁醇梭菌EA2018中利用該技術首次成功中斷adc基因，證實adc的缺失確實會同步影響丁醇產量。不過經發酵條件優化（培養基中添加CaCO3及甲基紫精），丁醇產量仍可以回復。最終，重組菌的丙酮產量降低至0.1 g/L，下降90.8%，而丁醇產量達到14.1 g/L，比例由70% 提 升 至82%。后 來，Cooksley 等［99］和Lehmann等［109］也分別嘗試了adc的中斷，確認丙酮途徑的阻斷會顯著影響丁醇的合成。在輔酶A轉移酶的中斷方面，Cooksley 等發現分別中斷ctfA 和ctfB，丙酮會完全消失，但乙醇和丁醇產量也有明顯降低；Lehmann等證實了ctfA的中斷結果［109］，而Jang 等證實了ctfB 的中斷結果［45］。上述研究說明，在產溶劑梭菌中，丙酮的生產與丁醇的高產存在很大程度上的耦聯關系，試圖通過改造丙酮合成途徑實現丁醇高量和高比例生產有很大難度。所以，在維持丙酮合成途徑的同時，通過前述策略盡可能提升丁醇產量，進而提升丁醇比例可能是比較可行的方法。事實上，Jang等［45］通過敲除產酸途徑以及過表達丁醇合成途徑關鍵酶獲得的幾株丁醇高產菌的丁醇比例都在80%左右，最高可達87.8%。Hou等［95］敲除了丙酮丁醇的adc 基因，同時以過表達ctfAB以及主途徑的thl-hbd-crt-bcd-adhE關鍵基因來補償丁醇合成，獲得的突變株實現了丁醇增產和比例增加的雙重效果（產量14.86 g/L，比例81.4%）。

以上研究主要是是在產溶劑梭菌中進行（如表4 所示），很難突破雙階段溶劑發酵特性的剛性約束，也就無法實現丁醇合成與丙酮合成的解耦。如果從普通底盤細胞的角度看待梭菌，完全可以重構非丙酮耦聯的丁醇合成途徑，從而實現同型丁醇（homobutanol）發酵［7］。

表4 正丁醇比例提升進展Tab.4 Summary of n-butanol ratio enhancement in Clostridium

3.3 代謝工程重構正丁醇合成途徑

近年來，隨著系統生物學和合成生物學的發展，越來越多的非常規梭菌開始進入科學家視野，包括產丁酸梭菌（如C. butylicum 和C. tyrobutyricum）、食氣梭菌（如C. ljungdahli、C. autoethanogenum、C. carboxidivorans P7）、纖維素降解梭菌（如C.cellulolyticum、C.cellulovoran 和C.thermocellum）、甘油利用梭菌（如C. pasteurianum 和C. diolis）等［8］。它們的遺傳背景日漸清晰，遺傳操作系統和遺傳操作工具也在不斷完善，有作為底盤細胞的潛力。由于同屬梭菌屬，CoA依賴的丁醇合成途徑在這些梭菌中天然地全部或者部分地存在（如圖4所示），為丁醇代謝途徑重構提供了極大便利。

酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）是最高效的發酵糖類原料生產丁酸的梭菌之一，在優化的培養條件下，批次發酵丁酸產量接近50 g/L［110］。該菌有非常特殊的丁酸和乙酸回用機制，借助其獨有的輔酶A轉移酶（Cat1）可以將乙酸、丁酸高效轉化為乙酰輔酶A和丁酰輔酶A，完全不需要和丙酮合成耦聯。以上特點使得C. tyrobutyricum 特別有潛力作為丁醇高效合成的底盤細胞。俄亥俄州立大學楊尚天課題組長期致力于酪丁酸梭菌的研究，在丁酸和丁醇合成途徑重構、底物范圍拓展、纖維床生物反應器開發、連續發酵工藝優化等領域取得多項重要進展［110］。他們僅在酪丁酸梭菌引入丙酮丁醇梭菌來源的醇醛脫氫酶（AdhE2），便可使重組菌以葡萄糖為碳源生產1.1 g/L丁醇。在ack基因缺失的底盤中如此操作，丁醇產量達到10 g/L［51］；他們曾嘗試在此突變株的基礎上過表達拜氏梭菌來源的輔酶A 轉移酶基因ctfAB，但對丁醇產量增加的貢獻有限（從10 g/L提升到12 g/L），且引入了丙酮這一副產物［111］。在其他的研究中，他們嘗試了多種農林廢棄物資源（如木薯渣、玉米纖維、棉花秸稈、甘蔗渣等）的水解液作為碳源，丁醇產量均超過12 g/L。特別需要指出的是，當該菌以還原性底物山梨醇為碳源時，產量甚至可達20.5 g/L［51，111-114］。最近，美國奧本大學王義課題組刷新了這一紀錄。他們在測試酪丁酸梭菌內源Type I-B CRISPR/Cas系統的基因編輯效果時，偶然發現使用醇醛脫氫酶基因adhE2原位替換替代cat1基因后，丁醇產量達到史無前例的26.2 g/L［34］。然而該菌的副產物乙酸和丁酸的終濃度仍然較高（分別為15.2 g/L 和2.4 g/L），因此需要繼續深入精細設計酸回用途徑，使更多碳流用于丁醇合成。

與酪丁酸梭菌類似，嗜纖維梭菌（C.cellulovoran）的主要產物也是丁酸，而且可以直接以纖維素原料為碳源底物［39］。尤其值得注意的是，該菌種有完整的非丙酮耦聯的CoA 依賴的丁醇合成途徑，但是幾乎不能生產丁醇。在嗜纖維梭菌中重構丁醇途徑長期受困于遺傳操作系統和工具的匱乏。楊尚天課題組最早鑒定了該菌的限制修飾系統，并通過過表達醇醛脫氫酶的方法使該菌能利用微晶纖維素生產丁醇［52］。同期，中科院上海植生所楊晟課題組也獨立開發了該菌的遺傳操作系統，并在該菌中驗證了TargeTron、Allelic exchange、CRISPR/Cas9 等多種遺傳操作工具的效果［44］。基于這些遺傳操作工具，Wen 等［115］在一個可耐受高濃度丁醇的嗜纖維梭菌馴化株中通過補全溶劑發酵途徑（表達ctfAB-adc-adhE1 基因）的方式實現了3.47 g/L 丁醇生產，但有副產物丙酮的產生。在接下來的研究中，Wen 等［39］對嗜纖維梭菌的丁醇合成途徑進行了從頭設計，以避免副產物丙酮，并提升丁醇得率。他們聚焦于糖-乙酰輔酶A-丁酰輔酶A-丁醇的代謝途徑的4 個限速步驟（木糖利用、乙酸/丁酸回用、丁酰輔酶A 可逆合成、丁醛還原），提出基于碳流“推—拉”策略的代謝工程改造思路。獲得的工程菌的丁醇產量較野生型提升了235 倍，達到4.96 g/L，為重組單梭菌直接降解木質纖維原料產丁醇的最高水平，展示了嗜纖維梭菌在直接降解纖維素產丁醇領域的應用潛力。楊尚天課題組［116］也在對嗜纖維梭菌的潛力做持續挖掘和探索，最新研究的丁醇產量（以微晶纖維素為碳源）已達到4.0 g/L。

圖4 梭菌的正丁醇合成途徑重構［綠色代表梭菌的糖類代謝途徑；黃色代表梭菌的甘油代謝途徑；湖藍色代表食氣梭菌的合成氣代謝途徑；正藍色代表梭菌內的正丁醇代謝途徑（部分梭菌途徑并不完整）。圖中所示基因表達的酶：dhaBCE—甘油脫水酶；dhaT—1，3-丙二醇脫氫酶；gldA—甘油-3-磷酸脫氫酶；dhaKL—磷酸二羥丙酮激酶；mgsA—甲基乙二醛合酶；yqhD—醇脫氫酶；fucO—1，2-丙二醇脫氫酶；hk—己糖激酶；gpi—果糖-6-磷酸異構酶；gapdh—甘油醛-3-磷酸脫氫酶；codh—一氧化碳脫氫酶；acs—乙酰輔酶A 合酶；fdh—甲酸脫氫酶；fhs—甲酰-四氫葉酸合成酶；folD—亞甲基四氫葉酸環化酶/脫氫酶；metF—亞甲基四氫葉酸還原酶；metTr—甲基轉移酶；cat1—輔酶A轉移酶（圖3已出現的基因代表的含義此處不再列出）］Fig.4 Reconstruction of n-butanol synthesis pathway in clostridia[Green lines represent carbohydrate metabolic pathway; the yellow lines represent the glycerol metabolic pathway; the lake blue represents the syngas metabolic pathway in gas-fermenting clostridia; the positive blue lines represent the synthesis pathway of n-butanol in Clostridium.dhaBCE—glycerol dehydratase; dhaT—1,3-propanediol dehydrogenase; gldA—glycerol-3-phosphate dehydrogenase; dhaKL—dihydroxyacetone phosphate kinase; mgsA—methylglyoxal synthase; yqhD—alcohol dehydrogenase; fucO—1, 2-propanediol dehydrogenase; hk—hexokinase;gpi—fructose-6-phosphate isomerase; gapdh—glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; codh—carbon monoxide dehydrogenase;acs—acetyl-CoA synthase; fdh—formate dehydrogenase; fhs—formyl-tetrahydrofolate synthase; folD—methylenetetrahydrofolate cyclase/dehydrogenase; metF—methylenetetrahydrofolate reductase; metTr—methyltransferase; cat1—CoA transferase (Genes appeared in Figure 3 is not listed here)]

同為纖維素降解菌，解纖維梭菌（C.cellulolyticum）和熱纖維梭菌（C.thermocellum）沒有像嗜纖維梭菌中那樣完整的乙酰輔酶A 到丁酸的代謝途徑，產物主要是乙酸和乙醇。在解纖維梭菌和熱纖維梭菌中需重建乙酰輔酶A到丁酰輔酶A的碳鏈延長途徑（包括thl-hbd-crt-bcd等基因），以及丁酰輔酶A 的還原途徑（包括adhE 等基因）。Gaida 等［117］和Tian等［118］分別在解纖維梭菌和熱纖維梭菌中重建了丁醇合成途徑，相應的丁醇產量僅分別達到0.12 g/L 和0.357 g/L，這暗示復雜的途徑重建的效果有時不盡人意，更精細的途徑規劃和理性設計勢在必行。

以合成氣（包括氫氣、一氧化碳和二氧化碳）為原料的食氣梭菌也面臨上述這樣的問題。食氣梭菌的產物往往以乙酸（和乙醇）為主。這意味著，要使這些菌株生產丁醇，就必然要引入碳鏈延長和丁酰輔酶A 還原途徑。以研究得比較多的C. ljungdahli、C.autoethanogenum 為例，兩菌通過Wood-Ljungdahl（WL）途徑（也稱還原性乙酰輔酶A途徑）來吸收和固定CO2和CO。該途徑是由甲基分支反應和羰基分支反應兩個通路組成。CO2經甲基分支反應途徑生成甲基四氫葉酸。隨后與（CO或CO2經羰基分支反應形成的）碳基以及輔酶A、甲基在一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合成酶（CODH/ACS）的催化下形成乙酰輔酶A，然后進入中心代謝途徑［119］。WL途徑的效率決定了乙酰輔酶A的供給水平，也決定了乙酰輔酶A下游途徑的代謝通量。食氣梭菌C. ljungdahli、C.autoethanogenum、C.aceticum等的遺傳操作系統已經建立［40，119-122］，引入異源的碳鏈延長途徑以及丁酰輔酶A還原途徑也不十分困難，但僅有少數幾個產微量丁醇的報道，這暗示丁醇途徑重構與調試還有問題有待解決。食氣梭菌C.carboxidivorans P7可天然地利用合成氣生產濃度在g/L水平的丁醇和己醇［41］，顯示了極大的潛力，但該菌的遺傳操作系統開發尚未報道。

常見的利用甘油的梭菌如巴氏梭菌（C.pasteurianum）中盡管有完整的丁醇代謝途徑，但是以甘油為唯一碳源時，1，3-丙二醇產量很高，有時甚至超過丁醇［123］。有研究表明，引入糖類作為共同碳源，通過優化甘油和糖的配比，可以顯著降低1，3-丙二醇產量［36］。但要完全消除1，3-丙二醇的合成，則必須對1，3-丙二醇合成途徑或者丁醇合成途徑進行改造。Pyne 等［124］在C.pasteurianum ATCC 6013 中以TargeTron 中斷了1，3-丙二醇脫氫酶基因dhaT 后，丁醇產量提升近30%，1，3-丙二醇產量減少超過80%，意外的是1，2-丙二醇代謝途徑變得活躍，產生了0.43 g/L 1，2-丙二醇；在另一項研究中，Schwarz 等［125］開發了一種適用于巴氏梭菌的基于同源重組的無痕基因敲除方法，成功刪除了甘油脫水酶基因（dhaBCE），完全消除了1，3-丙二醇的合成，而丁醇的合成幾乎不受影響（最終生產了約7 g/L）。他們還測試了與產溶劑途徑密切相關的脫氫酶基因hydA以及氧化還原響應調控基因rex的敲除對代謝途徑的影響，發現敲除前者可使1，3-丙二醇產量降低19%（約12 g/L），丁醇產量提高12.8%（約7.78 g/L）；敲除后者可使1，3-丙二醇產量降低50%（約7 g/L），丁醇產量提高43%（約9.8 g/L）。這再次證實，在以甘油為底物時，梭菌內的1，3-丙二醇途徑和丁醇合成途徑在碳流和電子流方面存在緊密而復雜的聯系，要完全解耦兩者，實現完全的丁醇合成，必須敲除1，3-丙二醇途徑。

值得注意的是，丙酮丁醇梭菌中也有丁醇合成途徑重構的研究。丙酮丁醇梭菌很早就被觀察到，當它丟失攜帶產溶劑操縱子（sol operon）的大質粒pSOL1時，其產溶劑能力喪失，也即菌株退化（退化的菌株被命名為M5 或者DG1）［126-127］。丙酮丁醇梭菌的這一特性，讓研究者意識到，可以在突變株中重構非丙酮耦聯的丁醇合成途徑。Nair 和Papoutsakis［127］最早在突變株M5中引入醇醛脫氫酶基因（ald），發現重組菌可回復丁醇生產至6.23 g/L，沒有丙酮產生。大質粒丟失導致M5 缺失酸回用途徑，因而乙酸、丁酸積累較多，Sillers 等［128］嘗試在M5 中分別敲除ack 和buk 基因，然后轉入ald，但僅獲得乙酸敲除株的過表達轉化子，且該突變株的丁醇產量未見明顯提高。Jang等則在M5中同時過表達了ald及ctfAB，可使丁醇濃度提高到11.41 g/L，但仍有較多乙酸和少量積累［129］。

總的來說，丁醇合成途徑的重構擺脫了產溶劑梭菌的溶劑發酵途徑和調控機制的約束，在同型丁醇發酵以及丁醇高產方向已取得重要進展，如表5所示。更重要的是，該策略很好地借助了各種梭菌的固有的碳源利用能力，賦能梭菌直接利用木質纖維原料（農業廢棄物）、甘油（生物柴油的主要副產物）或合成氣（工廠尾氣）等生產丁醇，極大地拓展了丁醇的原料范圍，是未來的重要研究方向。

4 代謝工程改造產正丁醇梭菌的戊糖代謝途徑

直接利用木質纖維原料或合成氣發酵生產丁醇代表了未來的重要發展方向，而當前，使用木質纖維原料（如秸稈、玉米芯等）經物理或者化學預處理后的酶解液作為碳源是非糧丁醇發酵成本最低，最接近工業化的選擇［2］。木質纖維原料的酶解液成分復雜，除了少量的乙酸、糠醛、呋喃、5-羥甲基糠醛等發酵抑制物，主要是D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖等各種糖類物質，其中木糖和阿拉伯糖的含量僅次于葡萄糖。由于碳源代謝抑制效應，在葡萄糖存在的情況下，梭菌無法高效利用木糖、阿拉伯糖等戊糖，這嚴重影響了丁醇發酵的速率以及得率［132］。改進梭菌戊糖利用效率的第一步是理解梭菌的戊糖轉運、代謝途徑，及其碳源代謝抑制效應的調控機制，然后再進行針對性改造。不過，梭菌戊糖代謝的解析、重構及工程改造一直在交織進行，從未嚴格分開（表6）。

表5 正丁醇合成途徑重構研究進展Tab.5 Summary of n-butanol synthesis pathway reconstruction in Clostridium

2010 年，Gu 等［140］率先通過使用TargeTron 結合其他遺傳和生化方法，鑒定了丙酮丁醇梭菌中木糖代謝的一些關鍵基因，并根據他們以前的研究和比較基因組學的預測，在丙酮丁醇梭菌中重建了木糖代謝途徑。接著，Liu 等［141］通過同位素示蹤技術揭示了丙酮丁醇梭菌如何通過戊糖磷酸途徑（PPP）和磷酸酮醇酶途徑（phosphoketolase pathway，PK 途徑）同時代謝木糖。他們用TargeTron 敲除了xfp（CA_C1343，編碼木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸酮醇酶）基因，出乎意料地發現木糖代謝沒有明顯變化。有趣的是，該基因與阿拉伯糖的磷酸酮醇酶代謝途徑密切相關，這已被Servinsky 等證實［142］。在另一項研究中，Zhang等［143］利用TargeTron 分析了丙酮丁醇梭菌中阿拉伯糖代謝調控基因araR 和核糖激酶基因araK 的功能，然后重建了阿拉伯糖代謝途徑。上述研究基本上比較清晰地繪制了產溶劑梭菌中戊糖轉運代謝途徑，即木糖和阿拉伯糖經各自的特異性轉運蛋白進入胞內后，各自經過異構及磷酸化作用后匯聚于木酮糖-5-磷酸，然后經PPP 途徑或者PK 途徑進入中心代謝，并與轉運葡萄糖的磷酸轉移酶系統（phosphotransferase system，PTS）和代謝途徑有緊密聯系（圖5）。

基于這些認識，Gu 等［133］過表達了大腸桿菌來源的PPP 途徑轉醛醇酶基因talA，提升了木糖利用速率，但木糖利用仍受葡萄糖抑制。進一步，Jin 等［134］過表達了內源的PPP 途徑的轉醛醇酶基因（tal）、轉酮醇酶基因（tkl）、核糖-5-磷酸異構酶基因（rpe）、核酮糖-5-磷酸3-差向異構酶基因（rpi），發現重組菌木糖利用明顯增快，溶劑產量提升42%。此外，木糖轉運工程研究也取得了不少進展。Xiao 等［139］鑒定了拜氏梭菌中的D-木糖特異性的轉運蛋白編碼基因（xylT），然后過表達它以增強拜氏梭菌的木糖攝取。同時，Sun 等［144］證明了六蛋白模塊XylFII-LytS/YesN-XylFGH 與拜氏梭菌中的木糖利用有關。他們進一步證實，這是一種新的“三組分”木糖響應和調節系統，其分子機理也在隨后得到了深入分析［145］。在另一項研究中，Xiao 等［135］證實葡萄糖轉運的弱化也能帶來戊糖利用的改進。他們利用TargeTron 中斷了PTS 系統組成基因（glcG，編碼PTS 系統的酶II，與木糖代謝阻遏高度相關），然后過表達內源

木糖轉運蛋白基因（xylT）以及木糖異構酶基因（xylA）和木酮糖激酶基因（xylB）。獲得的重組菌基本上消除了碳代謝抑制效應（carbon catabolite repression，CCR），溶劑產量增加24%。

表6 產正丁醇梭菌的戊糖代謝工程總結Tab.6 Summary of pentose metabolism pathway engineering in n-butanol-producing Clostridium

圖5 產正丁醇梭菌的戊糖代謝途徑及其調控蛋白（XylT/XylFGH—木糖特異性轉運蛋白；AraE/AraFGH—阿拉伯糖特異性轉運蛋白；PTS—己糖的磷酸轉移酶系統；GlcG—PTS的組成酶II，與碳源代謝抑制效應密切相關；G6P—葡萄糖-6-磷酸；F6P—果糖-6-磷酸；FBP—果糖-1，6-二磷酸；E4P—赤蘚糖-4-磷酸；S7P—景天庚酮糖-7-磷酸；Ru5P—核酮糖-5-磷酸；Xu5P—木酮糖-5-磷酸；G3P—3-磷酸甘油醛；DHA—二羥丙酮；DHAP—磷酸二羥丙酮；PEP—磷酸烯醇式丙酮酸圖中所示基因表達的酶：xylA-I/II—木糖異構酶；xylB—木酮糖激酶；araA—阿拉伯糖異構酶；araB/K—核酮糖激酶；araD—核酮糖-5-磷酸異構酶；rpi—5-磷酸核糖異構酶；tal—轉醛酶；tkt—轉酮酶；pk—磷酸酮醇酶）Fig.5 Pentose metabolism pathway and involved regulatory proteins in n-butanol-producing clostridia[XylT/XylFGH—xylose-specific transporter;AraE/AraFGH—arabinose-specific transporter; PTS—phosphotransferase system; GlcG—enzyme II of PTS, closely related to the CCR; G6P—glucose-6-phosphate; F6P—fructose-6-phosphate; FBP—fructose-1,6-Diphosphate; E4P—erythrose-4-phosphate; S7P—sedum heptulose-7-phosphate; Ru5P—ribulose-5-phosphate; Xu5P—xylulose-5-phosphate; G3P—3-Glyceraldehyde phosphate;DHA—dihydroxyacetone; DHAP—dihydroxyacetone phosphate; PEP—phosphoenolpyruvate; xylA-I/II—xylose isomerase; xylB—xylulose kinase;araA—arabinose isomerase; araB/K—ribulose kinase; araD—ribulose-5-phosphate isomerase; rpi—5-phosphoribose isomerase; tal—transaldolase;tkt—transketolase;pk—phosphoketolase(Genes appeared in Fig.2～4 are not listed here)]

在梭菌戊糖代謝的調控機理解析方面，研究人員已經認識到，在梭菌中，碳源代謝抑制效應主要由分解代謝控制蛋白A（CcpA）介導。它可以與組氨酸磷酸化蛋白HPr（heat-stable，histidine，phosphoryl protein）形成復合物［146］。該復合物可以與靶標基因的啟動子區域，或共轉錄單元編碼序列中的分解代謝物響應基序（catabolite responsive element，CRE）結合以抑制轉錄［147］，使CcpA 可以在一定程度上抑制木糖代謝［137］。

基于構效關系的深入理解，Wu 等［52］對CcpA蛋白進行了定點突變（V302N），以削弱其與HPr-Ser46-P 的結合能力，可有效緩解CcpA 對木糖代謝的負調控作用，從而實現葡萄糖、木糖的同步發酵。由于CcpA 是多效調控因子，Perry Chou 課題組將目光投向其互作蛋白及靶標調控基因。他們在過表達木糖代謝途徑操縱子之前，突變了基因上攜帶的CRE 序列，使CcpA 不能與之正常結合，從而在增強木糖代謝的同時，一定程度上豁免碳代謝抑制效應。所獲得的突變株的木糖利用增多、變快，但仍明顯落后于葡萄糖［138］。在隨后的研究中，他們利用CRISPR/dCas9 抑制了hprK 基因（編碼HPr 磷酸化酶/激酶，HPrK）的轉錄，以減少CcpA 與Hpr 的結合，從而減少負調控效應，使重組菌在一定程度上能同時利用木糖和葡萄糖［81］。

梭菌中的木糖代謝也受其他一些機制的調節。Hu 等［148］和Xiao 等［139］分別在丙酮丁醇梭菌EA 2018和拜氏梭菌NCIMB 8052中鑒定出了與木糖代謝有關的CEA_G2622 和Cbei_2385（xylR）等轉錄調節子。xylR中斷失活已被證明可以顯著上調木糖異構酶基因（xylA-II，CA_C2610）和木糖激酶基因（xylB，CA_C2612）的轉錄，從而促進木糖代謝利用［139］。最近，Liu 等研究了拜氏梭菌中阿拉伯糖代謝調控子編碼基因araR 的功能，證實araR的中斷可有效提升阿拉伯糖的代謝效率［101］。

總的來說，梭菌中的戊糖代謝途徑和調控機制已經比較清晰，為戊糖利用效率提升打下了良好基礎。然而需要注意的是，上述研究多在產溶劑梭菌中進行，相關認知需要在其他梭菌中進一步驗證。Yu 等［131］和Wen 等［39］分別在酪丁酸梭菌和嗜纖維梭菌驗證了過表達xylT、xylA、xylB 的作用，以及敲除xylR、araR 并過表達xylT 的作用，暗示前述梭菌的戊糖代謝途徑相似性和改造策略通用性較高，在嚴謹驗證的前提下有較好的推廣價值。

5 總結與展望

生物丁醇作為重要大宗化學品和極具前景的可再生能源，在減少碳排放和保障國家能源安全方面有重要作用。當前生物丁醇遭遇的最大困難在于生產成本高昂，難以和化石來源的丁醇競爭。目前有很多研究致力于提升生物丁醇的經濟性，包括使用廉價原料、提升菌株性能、優化發酵工藝、引入氣提等節能分離提取方法等等，其中產丁醇菌株的代謝工程改造仍是研究重點。

近年來，合成生物學的飛速發展為梭菌的遺傳改造提供了豐富的工具和資源。目前梭菌在丁醇產量和比例提升、丁醇合成途徑重構、戊糖代謝途徑改造等領域已經取得很大進展，但仍面臨一些問題，尤其是菌株對高濃度的丁醇及木質纖維素水解液中的抑制物耐受能力不足［149-150］。眾所周知，菌株的抗逆性能往往和細胞生理特性、全局性調控網絡等密切相關，涉及到DNA 修復、蛋白質合成與泛素化、酶的活性調節、細胞膜組成變化等多個層面［151-152］，這其中的基因靶點也未完全揭示，這意味著現有的代謝工程手段和策略可能無法很好地勝任抗逆性能提升的工作。而一些傳統的、非理性的適應性馴化，或者物理化學誘變方法反而能更快幫助菌株獲得優異的抗逆表型［149］。當然，在利用系統生物學、合成生物學以及遺傳驗證獲得關鍵靶點后，反向代謝工程在構建背景清晰的高性能菌株方面仍大有用武之地。

產丁醇菌株開發的另外一個瓶頸是，目前幾乎沒有菌株可以直接利用木質纖維素高效生產丁醇［3］，因為這涉及到纖維素酶生產、木質纖維素降解、己糖戊糖共發酵、丁醇高效合成等多個環節，對單個菌株的要求極高。在纖維素降解菌中引入丁醇代謝途徑（表6），或者在高產丁醇梭菌中過表達纖維素酶均未能達到預期目的［153］。Wen等［43-44，154］利用合成生物學的理念，設計和構建由纖維素降解菌和丁醇生產菌構成的共生菌群，再輔以代謝工程改造協調兩菌分工合作，可直接發酵木質纖維素，獲得的丁醇發酵水平與玉米糖培養基發酵水平接近，顯示了合成生物學“師法自然”、超越自然的獨特魅力。

可以預期，隨著合成生物學的進一步發展，未來的梭菌丁醇代謝工程將更多地與遺傳操作工具開發、基因組規模代謝網絡模型預測、多組學分析、適應性馴化/高通量篩選、功能菌群設計和調試等合成生物學技術及思想緊密結合，為下一代產丁醇梭菌開發做出更大貢獻。