合成生物學助力廢棄塑料資源生物解聚與升級再造

錢秀娟，劉嘉唯，薛瑞，劉豪杰，聞小紅，楊璐，徐安明，許斌，信豐學，2，周杰，2，董維亮，2，姜岷，2

（1 南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211816；2 南京工業大學材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816）

塑料是重要的基礎材料，為人類生產和生活帶來了極大的便利。2019 年，全球塑料產量達3.68 億噸，相比2018 年增加900 萬噸［1］。隨著塑料應用領域的拓寬和使用量的急劇增加，廢棄塑料不合理處置導致的“白色污染”問題已越來越被社會所關注。截至2018 年，全球累計產量已超過90 億噸［2］。而其中70%的塑料垃圾被填埋或者遺棄，11%被焚燒處理，只有19%的廢塑料被回收利用［3］。如圖1 所示，根據再生塑料資訊（CPRA）報道，2019 年中國產生廢塑料6300 萬噸，其中填埋量為2016 萬噸，占比32%；焚燒量1953 萬噸，占比31%；遺棄量為441 萬噸，占比7%；回收量為1890 萬噸，廢塑料總體回收率為30%［4］。此外，全球每年有約800 萬噸的塑料進入海洋，導致海洋動物吞食大量塑料微粒而死亡，這些塑料微粒甚至會通過海產品、海鹽等途徑富集到人體，最終威脅人類健康［5-6］。

開發廢棄塑料資源回收利用技術是解決“白色污染”問題的重要途徑。當前回收塑料的處理方法主要有填埋、焚燒、再生利用和塑料油化［7-8］。填埋法是處理廢塑料的最常用方法，我國每年有約1400 萬噸的廢舊塑料被填埋處理。然而廢塑料在自然環境下很難被降解，塑料中的增塑劑和添加劑滲出導致嚴重的土壤和水體污染；焚燒法可以回收大量的熱量，且焚燒后的廢舊塑料體積會減少90%以上。然而，焚燒產物除了CO2和水外，還會產生多環芳烴化合物、酸性化合物等有害物質，造成嚴重的大氣污染；再生利用法采用機械回收處理塑料廢棄物，使其還原為類似的塑料產品進行循環使用。但是簡單再生獲得的塑料制品性能不高，且機械回收處理塑料廢棄物需要耗費大量能源和人力資源，回收工藝復雜；塑料油化通過加熱使塑料中的C—C 鍵發生斷裂，同時伴隨著C—H 鍵斷裂，產生的自由基繼續通過各種組合反應生成不同小分子烴類物質，為各種化工產品提供基礎原料。但是，熱解處理對塑料廢棄物的清潔度、品質均勻性和化學試劑有較高要求，而實際回收過程中各種類型的塑料通常混合在一起，各批次的廢塑料原料類型很難統一，這就對熱解工藝、催化劑的實用性、活性和穩定性提出了很高的要求。綜上而言，應用這些物理和化學方法對塑料的回收或是效率普遍偏低，或是回收過程是一種降級循環回收的路線（downcycling），經濟性差，并且存在嚴重的環境二次污染問題。

圖1 2019年中國廢塑料處理情況［4］Fig.1 Fates for China's waste plastics in 2019[4]

回收手段的局限性成為限制塑料回收的主要因素。近年來，探索塑料廢棄物生物降解回收技術成為國內外研究的熱點［9-10］。利用合成生物學思想構建具有生物解聚功能的微生物或酶元件將塑料解聚為單體，反應條件溫和，不產生二次污染，進一步利用合成生物學的技術策略搭建塑料解聚物到高附加值產品的生物轉化線路，可實現廢棄塑料資源的“升級再造”。因此，基于合成生物學技術組建的“生物解聚→生物降解→高值化生物轉化”一體化生物回收過程，有望成為塑料廢棄物回收處置的重要手段。本文綜述了國內外關于塑料解聚微生物篩選、解聚酶挖掘與設計、塑料單體降解途徑解析以及塑料降解物高值化生物煉制等方面的最新研究進展，以期為建立更加高效的“降塑再造”技術平臺提供新的思路。

1 塑料生物解聚研究進展

根據分子組成及其結構的不同，塑料主要分為以下幾種：聚烯烴［聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）］、聚氯乙烯（PVC）、聚苯乙烯（PS）、聚對苯二甲酸乙二酯（PET）、聚氨酯（PU）、聚乳酸（PLA）和聚羥基脂肪酸酯（PHA）等；根據解聚機制的不同，又可分為水解型塑料和非水解型塑料。

1.1 水解型塑料解聚微生物的篩選及解聚酶挖掘

水解型塑料主要指單體通過酯鍵聚合而成的高分子塑料，以PET、PU 類為代表，該類聚合物的降解主要是通過斷裂其內部的酯鍵來完成，其生物降解過程相對簡單，目前已篩選獲得來自于不同菌屬的多種微生物對該類塑料具有降解效果，其降解途徑也比較明確（表1）。

PET塑料是由對苯二甲酸和乙二醇通過酯鍵連接而成的高分子化合物，通常以無定形和半結晶的形式存在，主要用于飲料瓶等包裝材料［24］。微生物通過分泌一些胞外解聚酶，水解PET 塑料中的酯鍵實現對聚合塑料的解聚，獲得的小分子解聚物可被微生物進一步礦化為水和CO2［25］。結晶度是影響PET 生物解聚的重要因素之一，結晶度越高，解聚難度越大。因此，研究人員通常采用無定形或低結晶度薄膜為模式底物，進行PET降解微生物的篩選和解聚特性的研究。目前報道的PET降解微生物主要包括腐皮鐮孢菌（F. solani）［11-12］、特異腐質霉（H.insolens）［13］等，真菌和嗜熱子囊菌（T. fusca）［14-17］、綠色糖單孢菌（S. viridis）［18］等放線菌（表1），但這些微生物大多只在PET 表面進行降解改性，對實際PET 塑料廢棄物降解能力十分有限。2016 年，Yoshida 等［19］分離出了一株細菌I.sakaiensis 201-F6，在30 ℃的條件下反應6周后，完全降解低結晶度PET薄膜，是目前已報道對PET降解效果最好的一株細菌。

表1 水解型塑料降解微生物研究進展Tab.1 Microorganisms responsible for depolymerizing plastics through hydrolysis

因PET 塑料具有較高的玻璃轉化溫度，直接利用酶在高溫（60～70 ℃）條件下對PET 進行解聚成為近年來研究的熱點。目前已挖掘的具有PET解聚活性的酶元件種類較多，包括脂肪酶、酯酶和角質酶等，其中角質酶是目前研究較多的一種PET 高效解聚酶［26］（表2）。T. fusca DSM43793 來源的角質酶TfH在55 ℃催化條件下，3周內可使結晶度為10%的PET 膜質量損失50%［27］；來自特異腐質霉H.insolens的角質酶HiC在70 ℃條件下96 h內幾乎可以完全降解低結晶度PET 薄膜，是迄今報道酶活性最高且熱穩定性最好的真菌來源聚酯水解酶［28］；來源于植物堆肥的角質酶LCC在70 ℃條件下，經24 h 催化可降解25%無定形PET 薄膜，該酶與TfH 聚酯水解酶具有一定的同源性［29］。此外，來源于嗜熱鏈霉菌（Thermomyces insolens）、南極假絲酵母（Candida antarctica）、曲霉屬（Aspergillus sp.） 的脂肪酶和來源于枝孢菌（Cladosporium 和Cladosporioides）、格拉子囊菌熱白 絲 菌（Melancarpus albomyces）、 檸 檬 青 霉（Penicillium citrinum）的酯酶也對PET 有一定解聚效果，但僅是增加了PET 表面的親水性并引起其表面形態變化。

PU 塑料是由異氰酸酯、多元醇和擴鏈劑3 種組分縮合而成的含有氨基甲酸酯鍵重復單元結構的聚合物。PU 是一種半結晶的熱固性塑料，其中異氰酸酯構成其結晶部分，稱為PU 的硬段，決定了PU 塑料的硬度和拉伸強度；多元醇和擴鏈劑構成其非結晶部分，稱為PU 的軟段，決定了PU 的彈性及延伸特性。PU 的生物降解過程主要通過斷裂其軟段的酯鍵來完成解聚，因此，目前報道的具有PU 降解能力的微生物大多是針對聚酯型PU的降解，聚醚型PU 的降解微生物報道較少［38］。鐮刀菌屬（Fusarium sp.）、彎孢菌屬（Curvularia sp.）、枝 霉 屬（Cladosporium sp.）、青 霉 菌 屬（Penicillium sp.）、芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）等多種微生物均被證實具有降解PU 塑料能力，見表1。álvarezbarragán 等［23］分離出6 種Cladosporium sp.菌株，在兩周內可降解75%～85%的水性PU（Impranil DLN），對聚酯型PU 有著較高的降解水平；Aspergillus sp.是目前報道具有聚酯型PU 降解能力的一類真菌，從垃圾堆土壤中分離出來的黃曲霉（Aspergillus flavus）可利用聚酯型PU 薄膜作為唯一碳源，在30 d 內降解60.6%的聚酯型PU［20］；從固體廢棄物傾倒點分離的Aspergillus sp.strain S45，在28 d 內可降解20%的聚酯型PU 薄膜［22］；Khan等［21］從垃圾場中分離出油曲霉（Aspergillus tubingensis），在含2%葡萄糖的無機鹽液體培養基培養21 d 后，可將聚酯型PU 薄膜降解成碎片。然而，關于利用這些微生物降解真實聚酯型PU 廢棄塑料研究還很少［39］。

生物酶可以通過水解PU 的酯鍵或脲鍵來實現對PU 塑料的解聚，常見的酶種類有酯酶、脲酶和蛋白酶等［40］。酯酶是目前降解PU 塑料效果最優的酶，例如叢毛單胞菌Comamonas acidovorans TB-35 來源的酯酶PudA［32-33］，假單胞菌屬來源的酯酶PueA、PueB 和PulA［35-36］。這些已經克隆的酯酶雖然可以有效解聚水性聚氨酯DLN，但對于真實的PU廢棄物幾乎沒有效果。木瓜蛋白酶在37 ℃下處理PU 薄膜1～6 個月后，GPC 和FTIR 分析表明氨基甲酸酯鍵發生了一定程度的斷裂［41］；α-胰凝乳蛋白酶降解PU時，25 ℃反應10 d后，其平均分子量也能降低30%以上［42］。目前，關于脲酶降解PU的報道相對較少，Phua 等［41］發現脲酶（EC 3.5.1.5）對PU 處理后，通過GPC、紅外等分析發現其產生了降解，且主要歸因于PU 中脲鍵的水解。 此 外， Schmidt 等［37］發 現 角 質 酶LCC、TfCut2、Tcur1278和Tcur0390在降解PET塑料的同時，也表現出一定的聚酯型PU降解能力，在70 ℃條件下，經過100 h 的降解，PU 塑料降解率達到0.3%～3.2%。

表2 水解型塑料解聚酶挖掘Tab.2 Depolymerases responsible for plastics depolymerization through hydrolysis

1.2 非水解型塑料降解微生物的篩選及解聚酶挖掘

非水解型塑料是指由烯烴類單體聚合而成的高分子塑料，以PE、PS 類塑料為代表，其主鏈化學組成為烷基碳，C—C 鍵惰性強、反應能壘高，導致其難以斷裂，這也是該類塑料很難被微生物降解的重要原因［43］。

研究人員已經分離出了一些可以降解PE 類塑料的微生物，見表3。韓秋霞等［44］從農田土壤中分離到一株可以改性PE 膜為唯一碳源的Aspergillus niger M6，30 d 對PE 膜 質 量 損 失 達20%；Balasubramanian 等［45］從印度馬納爾灣的塑料廢物堆放場中分離出15 株高密度PE 塑料降解細菌，其中Arthrobacter sp. GMB5 和Pseudomonas sp.GMB7可以在30 d內分別降解12%和15%的PE薄膜；Tribedi 等［49］從土壤中富集分離得到一株降解低密度PE 的假單胞菌Pseudomonas sp. AKS2，可在45 d 使PE 的質量損失達4%～6%。同樣在農田廢棄地膜中富集分離出了紅球菌Rhodococcus sp. C208 可實現以每周0.86%的速率降解PE 塑料薄膜［50］。

關于PS 塑料降解的微生物報道相對較少，Eisaku 等［51］首次從土壤中分離出來了5 株可以降解PS 的微生物，包括黃單胞菌屬（Xanthomonas sp.）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium sp.）和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）等；此外，季榮等［48］將Penicillium variabile CCF3219 應用于臭氧氧化預處理后的14C 標記的PS 薄膜，在16 周內將其幾乎完全礦化成CO2和水。近年來，利用昆蟲腸道微生物菌群降解聚烯烴類塑料發展迅速。楊軍等［46，52］發現印度谷螟幼蟲（Plodia interpunctella Hübner）可以啃食PE 薄膜，從其腸道內分離出2 株能夠降解PE 的 細 菌：Enterobacter asburiae YT1 和Bacillus sp.YP1。同時，該團隊還發現黃粉蟲（the larvae of Tenebrio molitor Linnaeus）對PS 薄膜有一定的降解能力，并進一步從其腸道中分離出1 株PS 降解菌Exiguobacterium sp.YT2，該菌株可以在60 d內降解7.4%PS［47］。在未來研究中，昆蟲腸道微生物菌群將為聚烯烴類塑料高效降解微生物的挖掘提供重要的篩選來源。

參與PE、PS 等非水解型塑料生物降解過程的酶種類很多，如漆酶、錳過氧化物酶（MnP）、木質素過氧化物酶（LiP）和烷烴羥化酶（AH）等均被證實對預處理后的非水解型塑料有一定降解效果［53］。 在Cu2+存 在 的 條 件 下， PE 塑 料 經Rhodococcus ruber C208 來源的漆酶處理后，PE 塑料中羰基量顯著增加，聚合物的重均分子量（Mw）和平均分子量（Mn）分別降低了20%和15%，且氧化和斷裂的部位都發生在PE 膜的非結晶區［54］；Trametes versicolor 來源的漆酶在1-羥基苯并三唑的介導下加速了對PE 膜的降解速率［55］。烷基羥化酶家族的烷烴羥化酶可通過碳氫化合物的氧化末端或亞末端實現對其降解［56］；在大腸桿菌BL21中外源表達Pseudomonas sp. E4 來源的AH 編碼基因alkB，37 ℃培養80 d，可將20%的低分子量PE 轉化為CO2［57］。進一步整合P.aeruginosa E7的AH 催化系統（包括烷烴單加氧酶、紅色素和紅色素還原酶），工程菌BL21 降解PE 的效率提升到30%［58］。目前，關于PS 解聚酶的報道只有來自木質素脫色細菌Azotobacter beijerinckii HM121 的非血紅素氫醌過氧化物酶，其可在兩相系統（二氯甲烷-水）中降解不溶性PS，當過氧化氫和四甲基氫醌存在時，PS可在5 min內被降解為水溶性小分子產物［59］（表4）。

表3 非水解型塑料降解微生物分離研究進展Tab.3 Microorganisms responsible for plastics depolymerization through non-hydrolysis pathways

2 塑料解聚酶的設計與改造

目前，塑料解聚酶元庫存在催化效率低、穩定性差、表達量低等問題，限制了塑料解聚酶的規模化生產與應用。利用理性設計、定向改造等蛋白質工程技術方法，有望提高塑料解聚酶的活性、穩定性和特異性。

2.1 提高酶的熱穩定性

玻璃轉化溫度是影響塑料生物降解的重要因素之一，在玻璃轉化溫度下，PET塑料的非晶態部分具有更高的柔性，從而更易被酶接觸并發生解聚。PET 的玻璃轉化溫度在65 ℃左右，因此要求解聚酶具有較強的耐熱性能［61］。二價金屬離子（Ca2+和Mg2+）能夠將聚酯水解酶TfCut2 的熔點溫度提高10.8～14.1 ℃，從而提高其熱穩定性，改造酶在65 ℃、48 h 處理條件下對半結晶PET 的水解效率提高到12.9%［17］。通過在TfCut2 中引入二硫鍵，使其熔點溫度提高了25 ℃，半失活溫度提高了17 ℃，該酶突變體在70 ℃、48 h 處理條件下，可解聚25% PET 薄膜，其催化效率較原始酶提高了一倍［16］。此外，法國圖盧茲大學的Marty 團隊［62］通過引入二硫鍵取代LCC 金屬離子結合位點附近的氨基酸殘基，將LCC 的熔點溫度提高了9.8 ℃，從而提高了其對PET 塑料的降解效率。因此，增強酶的熱穩定性能夠有效提高酶對塑料底物的催化效率。

2.2 增大酶的底物結合口袋

通過改造酶的催化中心以促進酶與底物的結合是提升酶催化效率最常用的策略之一［63］。若能擴大底物結合口袋，使得塑料大分子更容易進入酶的催化中心，將提高塑料降解酶的催化活性。Araújo 等［11］對FsC 角質酶的活性中心附近的氨基酸進行突變，利用丙氨酸替代方法擴大了底物結合口袋，突變體Leu182Ala 和Leu81Ala 對PET 纖維的水解活性分別提高了4 倍和5 倍；近期，法國圖盧茲大學的Marty 團隊［62］通過調控LCC 的底物結合口袋與PET 底物的吻合度確定影響酶催化效率的關鍵氨基酸殘基，通過排列組合改變催化凹槽內的所有氨基酸殘基，其中F243I和F243W表面的“凹槽”與PET 最容易嵌合，突變體可顯著提高酶催化效率。在此基礎上，進一步引入二硫鍵取代金屬離子結合位點附近的氨基酸殘基以提高酶的熱穩定性，最終獲得的酶突變體可在10 h 內解聚90%以上的瓶級PET，這是迄今為止報道的最高效的PET解聚酶。

表4 非水解型塑料解聚酶元件挖掘研究進展Tab.4 Depolymerases responsible for plastics depolymerization through non-hydrolysis pathways

2.3 強化酶與底物的可及性

聚合物表面的疏水性特性，使得解聚酶表面的親水基團無法有效地吸附到聚合物表面，即降低了酶與底物的可及性。若能在PET解聚酶中引入疏水結合模塊，將增加酶與底物的可及性。Ribitsch等［64］將PET 角質酶Thc_Cut1 和兩種木霉疏水蛋白HFB4 和HFB7 進行融合，獲得的融合酶對PET 的水解效率提高了16 倍以上。Ribitsch 等［65］通過在PET角質酶Thc_Cut1中引入兩種疏水性蛋白酶：分別來自于Hypocrea jecorina的纖維二糖水解酶CBM和來自于Alcaligenes faecalis 的聚羥基鏈烷酸解聚酶PBM，獲得的融合酶對PET 的水解活性提高了3.8 倍。同樣，Gamerith 等［66］在Nocardia farcinica的聚酰胺酶PA中引入了來自于A.faecalis的聚羥基鏈烷酸解聚酶PBM，融合酶PA_PBM水解聚合物的活性較PA提高了3倍。因此，增加酶與底物的可及性是提高解聚酶對疏水性聚合物水解活性的有效策略。另外，通過增加酶分子底物結合口袋的疏水性，促進疏水性塑料聚合物與酶吸附結合從而提高酶的催化效率，是強化酶與底物可及性的另一種方法。例如，Silva 等［67］通過設計雙突變Gln132Ala/Thr101Ala 來增加角質酶Tfu_0883 底物結合口袋的疏水性，突變體對PET 纖維的降解活性提高了1.6倍。

2.4 減少酶的產物抑制

PET 在水解之后，會產生對苯二甲酸雙酯（BHET）、對苯二甲酸單酯（MHET）、對苯二甲酸（TPA）和乙二醇（EG）這些降解單體，其中BHET和MHET會競爭性地結合到PET水解酶的底物結合位點，進而抑制PET 酶的解聚活性。針對這一問題，Wei 等［68］對TfCut2 的第62 位的氨基酸殘基進行了突變，得到的G62A 突變體無法與MHET 相互作用，該酶對MHET 的結合常數降低到原來的2/11，對PET 的降解效率提高了2.7 倍。Carniel 等［69］通過組合C. antarctica 的脂肪酶CalB與HiC，可消除PET解聚產物MHET的積累，雙酶體系對PET 的降解效率較單酶催化系統提高了7.7倍；Barth 等［70］建立了固定化雙酶體系（TfCa-TfCut2 和TfCa-LCC）對PET 進行降解，其中TfCa用于水解中間產物BHET和MHET，與單酶處理相比，雙酶的協同作用使得BHET和MHET的生產量分別增加了91% 和104%，提高了PET 的降解效率。

3 塑料降解物的高值化生物煉制

建立從塑料降解物到有用化學品的生物轉化技術體系，不僅能推動循環經濟發展，還能有效節約石油、天然氣等不可再生資源，減少溫室氣體排放，保護生態環境。然而廢塑料結構復雜、分類難度大、降解物多樣，要想實現塑料降解物的高值化生物煉制，解聚過程需要化學方法和生物方法并用。無論是通過生物還是化學策略解聚獲得的塑料單體，在明確降解所得的小分子單體或寡聚物后，定向挖掘可以利用這些小分子化合物的微生物，解析其降解路徑，并利用合成生物學技術，設計與構建塑料降解物到高值化學品的合成途徑，有望建立“降塑再造”的廢棄塑料資源循環經濟。

3.1 塑料降解物生物利用途徑解析

結構的復雜與解聚條件的差異導致塑料降解物成分多樣，主要包括有機酸、有機醇、芳香類化合物以及脂肪烴化合物，針對這幾種塑料單體的生物利用過程，國內外研究者已經開展了大量研究，并取得了階段性突破。

3.1.1 有機酸類塑料降解物

（1）己二酸 PU 等塑料的降解物之一，其代謝途徑在不動桿菌（Acinetobacter）中已被解析［71］。如圖2 所示，己二酸首先在琥珀酰CoA 轉移酶（DcaIJ）的催化下形成己二酰CoA，緊接著在酰基CoA 脫氫酶（DcaA）的催化下生成5-羧基-2-戊烯酰CoA，隨后被烯酰CoA 水合酶（DcaE）催化生成3-羥基己二酰CoA，然后在3-羥基己二酰CoA 脫氫酶（DcaH）作用下生成3-酮基己二酰CoA，最后在酰基CoA 硫解酶（DcaF）的催化下生成琥珀酰CoA 和乙酰CoA，進而進入TCA 循環，用于細胞的生長和代謝。

（2）6-羥基己酸 存在于PU塑料的降解物中，如圖2 所示，6-羥基己酸可被微生物胞內的6-羥基己酸脫氫酶（ChnD）和6-氧己酸脫氫酶（ChnE）兩步催化轉化為己二酸，然后通過上述己二酸降解途徑，最終形成琥珀酰CoA 和乙酰CoA 進入TCA循環［72］。

3.1.2 有機醇類塑料降解物

（1）乙二醇 PET、PU 等塑料的解聚產物之一，近年來，利用惡臭假單胞菌（P.putida）等土壤微生物轉化乙二醇合成更高價值的乙醇酸、乙醛酸、鼠李糖酯等生物化學品受到廣泛關注［73］。如圖3（a）所示，在惡臭假單胞菌P. putida KT2440 中，乙二醇首先在周質吡咯并喹啉醌（PQQ）依賴性醇脫氫酶（PedE、PedH）的催化下轉化為乙醇醛，緊接著在胞質醛脫氫酶PP_0545和PedⅠ的作用下生成乙醇酸，繼而在膜錨定的乙醇酸氧化酶GlcDEF 的作用下生成乙醛酸。生成的乙醛酸可以通過兩種方式進入TCA 循環：①在異檸檬酸裂解酶（AceA）的作用下與丁二酸縮合形成異檸檬酸進入TCA循環；②在蘋果酸合成酶（GlcB）的作用下與乙酰CoA 縮合形成蘋果酸，進入TCA循環［74］。然而，在路徑①中，異檸檬酸轉化為丁二酸的過程中伴隨著兩分子CO2的脫除，因此，乙二醇提供的兩分子的碳元素無法進入中心代謝供給細胞生長；在路徑②中，乙酰CoA 的不足制約了乙醛酸進一步轉化為蘋果酸進入中心代謝。因此，P. putida KT2440 無法利用乙二醇作為唯一碳源進行生長［74］。而在P.putida JM37 中存在另一條乙二醇代謝通路，乙醛酸可以通過乙醛酸羧化酶（Gcl）催化生成酒石酸半醛，緊接著在羥基丙酮酸異構酶（Hyi）和酒石酸酯半醛還原酶（GlxR）的作用下生成甘油酸，進而轉化為2-磷酸甘油酸進入糖酵解途徑，并最終進入TCA 循環［74］。因此，P. putida JM37 可以在以乙二醇為唯一碳源的培養基上良好生長。通過對乙二醇代謝路徑中各基因元件的表達與轉錄水平進行全面考察發現，Gcl 和GlxR是乙二醇利用過程的關鍵節點，同時表達Gcl和GlxR 的惡臭假單胞菌實現了在以乙二醇為唯一碳源的培養基上的快速生長［73］。此外，在產乙酸木 桿 菌（Acetobacterium woodii）中，Trifunovi?等［75］發現pdu 基因簇編碼的丙二醇脫水酶（PduCDE）和CoA 依賴的丙醛脫氫酶（PduP），除了可以催化1，2-丙二醇和2，3-丁二醇的降解外，還可以催化乙二醇脫水形成乙醛，并進一步轉化為乙酰CoA 和乙醇。生成的乙酰CoA 被轉化為乙酸，并通過底物水平磷酸化過程生成ATP。乙醇則部分被氧化為乙酸，產生的還原當量用于Wood-Ljungdahl通路固定CO2合成乙酸。

圖2 有機酸類塑料單體（己二酸和6-羥基己酸等）的生物降解途徑（途徑涉及的關鍵酶：DcaIJ—琥珀酰CoA轉移酶；DcaA—酰基CoA脫氫酶；DcaE—烯酰CoA水合酶；DcaH—3-羥基己二酰CoA脫氫酶；DcaF—酰基CoA硫解酶；ChnD—6-羥基己酸脫氫酶；ChnE—6-氧己酸脫氫酶）Fig.2 Biological degradation pathway for plastics from organic acid based monomers(adipic acid,6-hydroxyhexanoic acid,etc.)(Key enzymes in metabolic pathway:DcaIJ—succinyl-CoA transferase;DcaA—acyl-CoA dehydrogenase;DcaE—enoyl-CoA hydratase;DcaH—3-hyroxyacyl-CoA dehydrogenase;DcaF—acyl-CoA thiolase;ChnD—6-hydroxyhexanoate dehydrogenase;ChnE—6-oxohexanoate dehydrogenase)

圖3 有機醇類塑料單體（乙二醇和1，4-丁二醇等）的生物降解途徑（途徑涉及的關鍵酶：PedE，PedH—醌依賴性醇脫氫酶；PP_0545和PedI—醛脫氫酶；GlcDEF—乙醇酸氧化酶；Gcl—乙醛酸羧化酶；Hyi—羥基丙酮酸異構酶；GlxR—酒石酸酯半醛還原酶；AceA—異檸檬酸裂解酶；GlcB—蘋果酸合成酶；PduP—丙醛脫氫酶）Fig.3 Biological degradation pathway for plastic from organic alcohol based monomers(ethylene glycol,1,4-butanediol,etc.)(Key enzymes in metabolic pathway:PedE,PedH—quinoprotein alcohol dehydrogenase;PP_0545 and PedI—aldehyde dehydrogenase;GlcDEF—glycolate oxidase;Gcl—glyoxylate carboligase;Hyi—hydroxypyruvate isomerase;GlxR—artronate semialdehyde reductase;AceA—isocitrate lyase;GlcB—malate synthase;PduP—propionaldehyde dehydrogenase)

（2）1，4-丁二醇 PU 的主要降解產物之一。P. putida KT2440 可以在以1，4-丁二醇為唯一碳源的培養基中生長，但其生長速率非常緩慢。通過適應性進化可以提高KT2440 對于1，4-丁二醇的利用效率。基于此，Li 等［76］通過對突變菌株進行基因組測序以及蛋白組學分析，解析了1，4-丁二醇的生物降解路徑。如圖3（b）所示，1，4-丁二醇首先被氧化為4-羥基丁酸，這一步主要由PP_2674-2680 ped 基因簇編碼的高表達脫氫酶催化完成。生成的4-羥基丁酸可通過以下3條途徑進行下一步的代謝：①進一步經ped 基因簇編碼的脫氫酶催化氧化為琥珀酸；②經acyl-CoA 合成酶AcsA1（PP_4487）活化和acyl-CoA 催化為琥珀酰CoA；③通過β-氧化轉化為乙醇酰CoA 和乙酰CoA［76］。目前，只有第3條路徑得以確證，琥珀酸合成途徑和琥珀酰CoA合成路徑有待進一步證實。

3.1.3 芳香類塑料降解物

（1）對苯二甲酸 PET的另一重要降解物。轉化對苯二甲酸合成更高價值的芳香族化合物可提高PET 塑料制品循環使用的經濟性。叢毛單胞菌（Comamonas sp.）［77］、 戴 爾 福 特 菌（Delftia tsuruhatensis）［78］、紅球菌（Rhodococcus sp.）［79］等微生物都可以在以對苯二甲酸為唯一碳源的培養基上生長代謝。如圖4（a）所示，對苯二甲酸在微生物胞內的降解途徑為：對苯二甲酸經1，2-雙加氧酶（TphAabc）和1，2-二羥基-3，5-環己二烯-1，4-二羧酸酯脫氫酶（TphB）兩步作用生成重要中間產物原兒茶酸［80］。原兒茶酸是一種簡單的酚酸，可進一步轉化合成沒食子酸、鄰苯三酚、黏康酸和香草酸等高價值芳香化合物，或用于合成鼠李糖酯、PHA 等重要生物制品。水溶性差，發酵底物濃度低是制約對苯二甲酸作為發酵底物的瓶頸之一。針對這一問題，Kenny 等［81］采用對苯二甲酸與甘油共底物用于P. putida GO16 培養發酵，PHA的生產強度達到108.8 mg/（L·h）。

（2）2，4-二氨基甲苯 PU 等塑料的一種解聚物。2020 年，Espinosa 等［82］從塑料垃圾場土壤中分離獲得一株可以利用PU 降解寡聚物與2，4-二氨基甲苯為碳/氮源進行生長的假單胞菌Pseudomonas TDA1，通過基因組學分析，初步提出了2，4-二氨基甲苯的降解路徑。如圖4（b）所示，2，4-二氨基甲苯的甲基基團經氧化、脫羧和脫氨后形成4-氨基鄰苯二酚，4-氨基鄰苯二酚可能以二元醇的形式轉化為4-氨基-2-羥基黏康酸，并通過類似兒茶酸的代謝途徑進行進一步降解轉化。未來，需對預測代謝途徑中的相關基因進行蛋白質組學與轉錄組學方面的全面分析，并考察代謝中間物的分布與通量變化，從而準確繪制2，4-二氨基甲苯的降解路徑。

3.1.4 脂肪烴類塑料降解物

PE、PP、PVC 等塑料制品經熱解法處理后可獲得多種小分子的脂肪烴。脂肪烴的代謝途徑在自然界中廣泛存在。在假絲酵母（Candida sp.）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）等真核微生物中，脂肪烴首先被內質網上CYP52 家族的單加氧酶P450 氧化為脂肪醇，脂肪醇隨后在內質網或過氧化物酶體被氧化為脂肪醛，并進一步氧化為脂肪酸。脂肪酸經酰基CoA 催化生成脂酰CoA，脂酰CoA 或用于三酰甘油的合成，或在過氧化物酶體經β-氧化完全氧化為乙酰CoA 進入中心代謝途徑［83］。

圖4 芳香類塑料單體（對苯二甲酸和2，4-二氨基甲苯等）的生物降解途徑（途徑涉及的關鍵酶：TphAabc—對苯二甲酸1，2-雙加氧酶；TphB—1，2-二羥基-3，5-環己二烯-1，4-二羧酸酯脫氫酶）Fig.4 Biological degradation pathway for plastics from aromatic monomers(terephthalic acid,2,4-diaminotoluene,etc.)(Key enzymes in metabolic pathway:TphAabc—TPA 1,2-dioxygenase;TphB—1,2-dihydroxy-3,5-cyclohexadiene-1,4-dicarboxylate dehydrogenase)

對于苯系的脂肪烴而言，其降解路徑主要有開環和側鏈氧化兩種方式，如圖5所示。開環降解報道不多，主要存在于紅球菌中［84］：苯乙烯的芳環首先被苯乙烯雙加氧酶（SDO）羥基化生成苯乙烯順式乙二醇，再經順式乙二醇脫氫酶（CGDH）進一步氧化形成3-乙烯基鄰苯二酚，進而轉化為丙酮酸進入中心代謝。開環路徑無特異性，可以作用于所有包含苯環結構的物質。側鏈乙烯基的氧化途徑是苯乙烯的主要降解路徑，廣泛存在于Pseudomonas sp.［85］、Corynebacterium sp.［86］、Rhodococcus sp.［87］等微生物中。苯乙烯經過苯乙烯單加氧酶（SMO）、氧化苯乙烯異構酶（SOI）和苯乙醛脫氫酶（PAALDH）等酶作用轉化生成苯乙酸。苯乙酸進一步完成羥基化后，通過β-氧化過程生成乙酰CoA 進入TCA 循環或轉化為PHA。此外，苯乙烯氧化中間物苯乙酸還可以為苯乙醇和苯乙胺等高價值化學品的合成提供重要前體物質［88］。

3.2 塑料降解物合成高值化學品的路徑設計與構建

PHA 是多數細菌胞內碳源和能源的儲備物，因其可完全生物降解，被認為是可替代傳統塑料的新型生物材料。近年來，利用塑料降解物為底物合成PHA受到廣泛關注。2011年，Jasmina等［89］利用P. putida CA‐3 轉化苯乙烯獲得了3.36 g/L 的PHA 產出，建立了芳香族環境污染物降解與脂肪族PHA 合成的獨特聯系，為PS 塑料的循環利用提供了可行的方向。進一步，以低密度的PE 粉末為底 物，經 過21 d 的 生 物 轉 化，Sen 等［90］利 用Cupriavidus necator H6 積累了細胞干重3.18%的短鏈PHA，這也是直接降解PE 材料并進行生物化合物合成的首次報道。此外，發現惡臭假單胞菌P.putida GO16、P.putida GO19 和弗雷德里克假單胞菌Pseudomonas frederiksbergensis GO23 在降解PET的同時可積累一定量的中等長度PHA，其中GO16和GO19積累PHA的速率可達到8.4 mg/（L·h）［91］。

圖5 脂肪烴類塑料單體的生物降解途徑（途徑涉及的關鍵酶：P450—單加氧酶P450；SDO—苯乙烯雙加氧酶；SMO—苯乙烯單加氧酶；CGDH—順式乙二醇脫氫酶；SOI—氧化苯乙烯異構酶；PAALDH—苯乙醛脫氫酶）Fig.5 Biological degradation pathway for plastics from aliphatic hydrocarbon monomers(Key enzymes in metabolic pathway:P450—monooxygenase P450;SDO—styrene dioxygenase;SMO—styrene monooxygenase;CGDH—cis-ethylene glycol dehydrogenase;SOI—styrene oxide isomerase;PAALDH—phenylacetaldehyde dehydrogenase)

表面活性劑可以乳化水性介質中的疏水性物質，從而增加細胞對疏水性物質的利用度。因此，PE、PP、PVC 等塑料經熱解獲得的疏水性脂肪烴等疏水性底物常用于表面活性劑的合成研究。例如，沙門菌Renibacterium salmoninarum 27BN 可利用正十六烷為唯一碳源生長并積累鼠李糖酯，鼠李糖酯的分泌又能進一步促進十六烷的利用［92］。值得一提的是，鼠李糖酯的合成與PHA 共用R-3-羥基鏈烷酸前體庫，因此，許多具有同化塑料降解物合成PHA 的微生物也具有合成鼠李糖酯的潛力［93］。

油脂是微生物體內能量存在的主要物質，產油微生物可轉化脂肪烴類塑料降解物合成并積累油脂。Y.lipolytica strain 78-003 可直接利用PP 塑料熱裂解混合物（主要包含脂肪醇、烷烴和烯烴），細胞生物量達2.34 g/L，油脂含量達細胞干重的23%，底物到細胞轉化率達0.13 g/g，其中油脂收率為0.03 g/g底物［94］。

芳香類化合物是苯系塑料降解物進行高值化生物再造的首選去向。Hee 等［80］通過在大腸桿菌內外源表達來自Comamonas sp. E6 的TphAabc 和TphB，獲得工程菌株HBH-1，首先實現苯二甲酸到原兒茶酸的轉化。進一步，以原兒茶酸為前體，Hee等又進行了一系列高價值芳香類化學品的合成研究。首先，通過外源表達來自P. putida KT2440的對羥基苯甲酸酯羥化酶（PobA），大腸桿菌Escherichia coli GA-1 可以轉化原兒茶酸合成

1.4 mmol/L 沒食子酸，轉化率達40.1%。為消除沒食子酸單菌合成中輔因子失衡問題，Hee等將沒食子酸的合成途徑分成兩個模塊：原兒茶酸合成模塊（PCA-1）和沒食子酸合成模塊（HBH-2）。在最優菌株接種情況下，系統轉化原兒茶酸合成沒食子酸的轉化率達92.5%。運用同樣的策略，通過在沒食子酸合成菌株GA-1 中外源表達沒食子酸脫羧酶（LpdC），工程菌PG-1a 可以實現32.7%對苯二甲酸到鄰苯三酚的轉化。為解決此轉化過程中副產物兒茶酚的積累，Hee等構建另一條以兒茶酸為中間物的鄰苯三酚合成途徑：原兒茶酸經脫羧形成鄰苯二酚，再經過酚羥化酶（PhKLMNOPQ）的作用生成鄰苯三酚。通過混合培養兒茶酸合成菌株與鄰苯三酚合成菌株，最終對苯二甲酸轉化合成鄰苯三酚的產量達到0.6 mmol/L，是單菌培養的3 倍。運用同樣的策略，Hee 等還完成了對苯二甲酸到黏康酸和香草酸的合成，這些成果為PET降解物的高值回收提供了寶貴經驗。

許多塑料降解物或其降解中間代謝物具有細胞毒性，嚴重抑制了細胞的生長和產物的合成。例如，中間代謝物乙醇醛與乙二醛是乙二醇代謝過程的重要中間產物，4 mmol/L乙醇醛和7.5 mol/L乙二醇便可完全抑制惡臭假單胞菌的生長［73］。加快醛類物質到對應毒性較弱的醇或者酸的轉化，是降低醛類物質毒性的常用策略。基于此，Franden等［73］通過過量表達乙醇酸氧化酶GlcDEF，減少了乙醇醛的積累， 使P. putida 工程菌MFL114，可以耐受2 mol/L（約124 g/L）乙二醇，并最終消耗0.5 mol/L（31 g/L）乙二醇生成細胞干重32.19%的PHA。

塑料降解物成分多樣，單一微生物往往無法實現其完全降解。采用多細胞混合培養技術，針對性地選用功能微生物，或可加速塑料降解物的生物煉制過程。PU塑料的降解單體主要是己二酸、乙二醇、1，4-丁二醇和異氰酸酯［甲苯-2,4-二異氰酸酯（2，4-TDI）或4,4′-二苯基甲烷二異氰酸酯（4，4′-MDI）］，異氰酸酯進一步衍生轉化為2，4-甲苯二胺。基于此，研究人員首先鑒定并構建了聚氨酯單體的降解微生物［95］：據報道，拜氏不動桿菌Acinetobacter beijingii ADP1 具有很好的己二酸降解能力，通過克隆其己二酸降解關鍵閱讀框dac（dcaAKIJP）并外源表達于P.putida KT2440，工程菌株P.putida KT2440 A12.1p 獲得了在己二酸為碳源的培養基快速生長的能力；突變菌株P. putida KT2440 B10.1 和 工 程 菌P. putida KT2440ΔgclR ΔPP_2046 ΔPP_2662：：14d 分別可以降解1，4-丁二醇和乙二醇。研究發現，2，4-甲苯二胺表現出嚴重的細胞毒性，同時也影響了聚氨酯水解體系中其他單體的生物利用效率。因此，研究人員利用石蠟油和二（2-乙基己基）磷酸（D2EHPA）作為溶劑和反應性萃取劑（助溶劑），對聚氨酯水解體系進行了TDA 萃取去除。在pH4 的情況下，TDA 的去除效率達到了93%。在此條件下，通過混合培養P. putida KT2440 A12.1p、P. putida KT2440 B10.1和P. putida KT2440ΔgclR ΔPP_2046 ΔPP_2662：：14d，實現了混菌體系對體系其余塑料單體的完全轉化。進一步，通過在己二酸、1，4-丁二醇和乙二醇降解的3個惡臭假單胞菌中外源表達鼠李糖酯合成關鍵基因RhlA 和RhlB，實現了聚氨酯塑料單體到鼠李糖酯的增殖生物再造。

4 展 望

近年來，國內外研究人員開展了各種廢塑料降解微生物資源篩選和關鍵酶元件的挖掘改造工作，在PET 等聚酯型塑料的酶法解聚與催化機制方 面 取 得 了 令 人 矚 目 的 重 要 突 破［19，62，96-97］，CARBIOS 公司宣布將在法國化學谷建設PET 塑料酶法回收的工業示范工程，建立從PET 廢棄物降解到單體利用的完整工業鏈，預計年利用能力在5 萬噸到10 萬噸之間（https：//www.hbmedia.info/petplanet/2020/07/17/carbios-launched-construction-ofindustrial-demonstration-plant-for-the-enzymatic-petrecycling/？s=）。這些成果充分證明了基于合成生物學的生物解聚技術將是實現廢棄塑料資源循環利用的有效途徑。然而，廢棄塑料種類多、成分復雜，除了PET 塑料之外的其他廢棄塑料的生物解聚仍然面臨著降解菌種/酶匱乏、解聚機制不明晰、降解體系效率低、降解物難以高效利用等一系列瓶頸問題亟待突破。

（1）非水解型塑料的生物氧化機制 非水解型塑料（聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯等）的市場占有率達到60%以上，其化學結構含有豐富的惰性C—C 主鏈并且不含其他活性官能團，這導致該類塑料可以抵抗生物酶的襲擊，僅能通過高能氧化反應斷裂［98］。目前，昆蟲及其腸道微生物對非水解型塑料的解聚作用已有一些成功報道，但生物解聚效率相對較低，且涉及其降解過程的生物氧化酶和催化機制尚需要進一步明確［46-47，99-102］。聚乙烯和直鏈烷烴的單體結構相同，推測它們的生物降解機制也類似，烷烴羥化酶/單加氧酶（AlkB）被認為是參與降解聚乙烯的候選酶［103］；而木質素分解酶（如LMSs）對于芳香族結構降解是有效的，可能是潛在的芳香族塑料聚苯乙烯的降解者［104］。鑒于此，基于烷烴羥化酶/單加氧酶和木質素分解酶的分子催化機制，結構導向“自下而上”的生物氧化酶從頭設計方法可能比“自上而下”的昆蟲降解更適合揭示非水解型塑料的生物氧化機制。

（2）塑料解聚酶的高效異源表達 塑料解聚酶制劑的高效低成本制備是實現塑料生物法降解產業化示范應用的關鍵。目前塑料解聚酶在大腸桿菌、畢赤酵母、枯草芽孢桿菌等宿主中的可溶性表達水平普遍較低，細菌來源PETase 可溶性表達量為6.3 mg/L，真菌來源角質酶TfCa 可溶性表達量為41.6 mg/L。宏基因組來源聚酯水解酶LCC可溶性表達量約為40 mg/L。漆酶、過氧化物酶、P450 酶等氧化還原酶的表達量更低。塑料解聚酶在異源表達過程中，當溶質-溶質（蛋白質-蛋白質）相互作用強烈于溶質-溶劑（蛋白質-緩沖液）相互作用時，蛋白質之間相互作用力（靜電作用力、疏水作用力等）加強導致蛋白質聚集是影響其高效表達的重要因素［105-108］。隨著合成生物技術發展，通過蛋白質工程提高蛋白質的膠體和結構穩定性［109-110］、翻譯后修飾工程提高蛋白質的糖基化程度［105，111］將有望從源頭上為塑料解聚酶聚集問題提供一種有效的解決方案。

（3）混合塑料解聚多酶/混菌體系構建 針對結構復雜的塑料（例如PU）或者混合塑料，單一的降解微生物/酶往往難以實現有效降解，為減輕單一微生物的代謝壓力，可以將降解過程分成多個不同的過程來完成。細菌Ideonella sakaiensis 201-F6 就是通過分泌高活性PETase 和MHETase 協同作用使PET 得到充分的降解［62］；Chen 等［112］基于極端嗜熱混菌堆肥技術也實現了活性污泥中混合微塑料的原位生物降解。在廢棄碳資源降解領域多酶/混菌降解體系已經取得了良好的效果，例如木質纖維素生物降解等［113］。與木質纖維素相比，塑料的疏水性和結晶程度更高、抗生物降解能力更強［114］，因此在獲取多種塑料降解微生物和降解元件的基礎上，設計并構建高效、穩定的多酶/混菌體系，針對不同類型塑料組成定向調控多酶/混菌體系動態變化，將是塑料生物解聚重點突破的方向。

（4）塑料降解物高值化生物煉制途徑 建立“塑料垃圾-解聚單體-高值化產品”的生物利用途徑，不僅能推動塑料產業循環經濟發展，還能有效節約天然資源，減少溫室氣體排放，保護生態環境。歐盟早在2015 年就啟動了針對塑料生物降解和高值化利用項目-歐盟地平線2020 塑料生物降解及利用項目P4SB（from plastic waste to plastic value using Pseudomonas putida synthetic biology），打通了以PET 塑料單體乙二醇/對苯二甲酸和PUR塑料單體丁二醇/己二酸合成生物可降解塑料PHA和生物表面活性劑鼠李糖酯的技術路線［73，76，115-116］，形成了一支國際塑料降解領域頂尖的研究團隊（https：//www.p4sb.eu/）。然而，現有的高值化生物煉制途徑效率仍然較低［117］，設計并構建高效的塑料單體降解途徑和同化途徑，并調控兩條途徑之間及與底盤細胞之間的適配性，真正實現“降塑再造”，推動循環經濟發展，合成生物技術將發揮重要作用。

鑒于“白色污染”與廢棄塑料資源浪費問題的嚴重性，我國“十三五”科技計劃高度重視塑料生物降解與轉化利用研究。國家自然科學基金委與歐盟委員會于2019 年在“塑料降解微生物菌群”方向共同資助了2項高強度國際（地區）合作與交流項目并開展實質性合作研究，“合成塑料降解轉化微生物菌群”項目由山東大學祁慶生教授和愛爾蘭阿斯隆理工學院Margaret Brennan Fournet教授作為負責人（https：//www.bioicep.eu/），“廢塑料資源高效生物降解轉化的關鍵科學問題與技術”項目由南京工業大學姜岷教授和亞琛工業大學Lars M.Blank 教授作為負責人（https：//www.mix-up.eu/）。同年，科技部又在國家重點研發計劃“變革性技術關鍵科學問題”和“合成生物學”重點專項中分別部署了“合成塑料解聚酶的定向進化工程及應用”和“活性污泥人工多細胞體系構建與應用”兩個指南方向，江南大學吳敬教授和中科院微生物研究所劉雙江研究員分別獲得2 個項目的資助。2020 年，在剛剛發布的國家重點研發計劃“綠色生物制造”重點專項2021 年度指南征求意見稿中，對塑料生物解聚關鍵技術也進行了布局。2020年是上述塑料生物降解相關項目的啟動實施之年，相信隨著合成生物技術發展并在塑料生物降解轉化過程的廣泛應用，我國在廢棄塑料資源的生物法降解轉化方向將取得令人振奮的研究進展。