miR-194通過調控KLF15表達降低缺氧誘導的心肌細胞損傷

韓芬 楊曉

(1鄭州鐵路職業技術學院藥學院基礎醫學教研室，河南 鄭州 450000；2河南中醫藥大學第一附屬醫院耳鼻喉科)

急性心肌梗死嚴重威脅著人類健康及生活質量，而心肌組織缺血缺氧導致的心肌細胞壞死凋亡是重要原因〔1〕。缺氧在多種腫瘤細胞增殖與凋亡、新生血管形成、侵襲與轉移等生物學行為的改變中發揮重要作用，miRNA是一類長度為19～24 nt的非編碼RNA，調控其靶mRNA的翻譯和表達可以改變缺氧誘導腫瘤生物學行為〔2〕。研究發現miR-195通過下調c-myb增強缺氧/復氧損傷誘導的心肌細胞凋亡〔3〕；過表達miR-29b1可抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡〔4〕。而miR-194可抑制喉鱗狀細胞癌增殖〔5〕，miR-194通過調節鼠雙微粒體基因(MDM)-2表達調節卵巢癌細胞中的紫杉醇抗性〔6〕，但miR-194對缺氧的心肌細胞的影響還尚未見報道。KLFs屬于鋅指轉錄因子亞家族，參與早期的胚胎生長發育、細胞分化、組織器官的形成、原癌基因的突變和血管生成等生理病理過程，KLF15是KLF家族的重要成員，具有同樣的功能〔7〕。而KLF15在缺氧誘導的心肌細胞凋亡中作用尚不清楚，且miR-194與KLF15之間的調控關系也不清楚，本研究旨在探討miR-194對缺氧誘導的心肌細胞損傷的影響及其可能作用的分子機制是否與KLF15有關，為心肌細胞損傷及其導致的相關疾病治療提供新靶點和新方向。

1 材料和方法

1.1材料 心肌細胞H9C2購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養液購自Gibco公司；兔抗人KLF15多克隆抗體、兔抗人CyclinD1多克隆抗體、兔抗人酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3多克隆抗體、兔抗人p-STAT3多克隆抗體、兔抗人STAT3多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG均購自上海煊翎生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、反轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒、Trizol試劑、二甲基亞砜(DMSO)購自Solarbio公司；噻唑藍(MTT試劑盒、異硫氰酸熒光素標記的膜聯素V/碘化丙啶(AV-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒、雙熒光素酶試劑盒均購自北京碧云天生物公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自Invitrogen公司；載體質粒均由金瑞斯生物科技公司構建；酶標儀購自南京德鐵實驗設備公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 復蘇H9C2細胞，使用含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培養液，在37℃、5%CO2、95%O2條件下培養；2 d換液1次，取處于對數生長期的細胞進行試驗。

1.2.2細胞轉染和分組 將心肌細胞隨機分為兩組，空白對照(Control)組：不做任何處理；單純缺氧組：將心肌細胞用無血清低糖的DMEM培養基培養，置于持續充入95%N2+5%CO2的密閉培養箱中進行缺氧處理48 h。

將miR-con、miR-194、anti-miR-con、anti-miR-194、pcDNA和pcDNA-KLF15質粒轉染到正常培養的心肌細胞中，記為miR-con組、miR-194組、anti-miR-con組、anti-miR-194組、pcDNA組和pcDNA-KLF15組；再將anti-miR-con組、anti-miR-194組、pcDNA組和pcDNA-KLF15組細胞進行缺氧處理，記為缺氧+anti-miR-con組、缺氧+anti-miR-194組、缺氧+pcDNA組和缺氧+pcDNA-KLF15組。

將miR-194質粒分別和pcDNA質粒、pcDNA-KLF15質粒共轉染到正常培養的心肌細胞中再行缺氧處理，記為缺氧+miR-194+pcDNA組和缺氧+miR-194+pcDNA-KLF15組；將anti-miR-194質粒分別和si-con質粒、si-KLF15質粒共轉染到正常培養的心肌細胞中再做缺氧處理，分別記為缺氧+anti-miR-194+si-con組和缺氧+anti-miR-194+si-KLF15組；轉染均按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

1.2.3qRT-PCR檢測細胞miR-194和KLF15 mRNA水平 用Trizol試劑提取總RNA，分別使用TaKaRa反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒，將RNA反轉錄為cDNA并避光配制反應體系，以β-actin為內參進行PCR擴增，循環條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。每個樣品重復3次，采用2-△△Ct法分析GPX1 mRNA相對表達量。

1.2.4Western印跡檢測蛋白表達水平 收集以上各組細胞，加入RIPA細胞裂解液于冰上裂解30 min；4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清。BCA試劑盒測定蛋白樣品濃度后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結束后，將蛋白電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入兔抗人KLF15多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人p-STAT3多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人STAT3多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人酶切caspase-3多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人CyclinD1多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人β-actin多克隆抗體(1∶1 000)，4℃ 過夜；洗膜后，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)，室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，10 min/次。后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平，實驗重復3次。

1.2.5MTT檢測細胞增殖 在以上各組細胞培養至48 h時加入20 μl(5 g/L)的MTT溶液，繼續孵育4 h；棄去多余培養基并加入150 μl DMSO振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度(A)值。細胞增殖存活率(%)=實驗組A值/空白對照組A值×100%。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 取各組細胞，胰蛋白酶消化后4℃、300 r/min離心10 min，預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后重懸。按照AV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書，分別加入5 μl AV-FITC和10 μl PI，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測激發波長488 nm和發射波長530 nm處的熒光強度，實驗重復3次。

1.2.7熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-194對KLF15的靶向調控 TargetScan數據庫顯示KLF15 3'UTR區域有miR-324-5p結合位點。構建野生型和突變型基因靶點KLF15的3'UTR-熒光素酶表達載體(WT-KLF15和MUT-KLF15)，取對數生長期心肌細胞H9C2接種于24孔板(1×103個/孔)，待細胞生長至80 %匯合時，用LipofectamineTM2000分別將WT-KLF15和MUT-KLF15質粒轉染到H9C2，同時分別轉染miR-194質粒和miR-con質粒。依據說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定，實驗結果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統計學分析。實驗重復3次。

1.3統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1缺氧處理心肌細胞對miR-194和KLF15表達的影響 Western印跡檢測結果顯示，與Control組相比，缺氧組心肌細胞中KLF15蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。可見，缺氧處理促進心肌細胞中miR-194的表達，抑制KLF15的表達。qRT-PCR檢測結果顯示，與Control組相比，缺氧組心肌細胞中miR-194的表達水平顯著升高，KLF15 mRNA的表達水平顯著降低(均P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 檢測心肌細胞中KLF15蛋白表達

表1 缺氧處理心肌細胞影響miR-194和KLF15表達

2.2抑制miR-194表達促進缺氧處理心肌細胞存活和抑制細胞凋亡 Western印跡檢測結果顯示，與Control組相比，缺氧組心肌細胞中酶切caspase-3蛋白表達水平顯著升高，CyclinD1蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)；與缺氧+anti-miR-con組相比，缺氧+anti-miR-194組心肌細胞中酶切caspase-3蛋白表達水平顯著降低，CyclinD1蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)。qRT-PCR檢測結果顯示，與Control

組相比，缺氧組心肌細胞中miR-194表達水平顯著升高，與缺氧+anti-miR-con組相比，缺氧+anti-miR-194組心肌細胞中miR-194表達水平顯著降低(均P<0.05)。MTT法檢測結果顯示，與Control組相比，缺氧組心肌細胞存活率顯著降低(P<0.05)，與缺氧+anti-miR-con組相比，缺氧+anti-miR-194組心肌細胞存活率顯著升高(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示，與Control組相比，缺氧組心肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與缺氧+anti-miR-con組相比，缺氧+anti-miR-194組心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖2、表2。可見，抑制miR-194表達促進缺氧處理心肌細胞存活和抑制細胞凋亡。

1～4：Control組，缺氧組，缺氧+anti-miR-con組，缺氧+anti-miR-194組圖2 流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡

表2 轉染anti-miR-194促進缺氧處理心肌細胞存活并抑制細胞凋亡

2.3miR-194靶向調控KLF15的表達 通過TargetScan數據庫預測到KLF15與miR-194存在結合位點，見圖3A。熒光素酶報告基因檢測實驗結果顯示，相較于miR-con組，miR-194組WT-KLF15的心肌細胞H9C2熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而MUT-KLF15的心肌細胞H9C2熒光素酶活性差異不顯著(P>0.05)。見表3。Western印跡結果顯示，相較于miR-con組(0.54±0.04)，miR-194組(0.23±0.03)心肌細胞H9C2中KLF15表達顯著降低(P<0.05)；而相較于anti-miR-con組(0.49±0.05)，anti-miR-194組(0.84±0.07)心肌細胞H9C2中KLF15表達顯著升高(P<0.05)。見圖3B可見，miR-194靶向調控KLF15的表達。

2.4過表達KLF15促進缺氧處理心肌細胞增殖和抑制細胞凋亡 Western印跡結果顯示，與缺氧+pcDNA組相比，缺氧+pcDNA-KLF15組心肌細胞中KLF15和CyclinD1蛋白表達水平均顯著升高(均P<0.05)，酶切caspase-3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。MTT法檢測結果顯示，與缺氧+pcDNA組相比，缺氧+pcDNA-KLF15組心肌細胞存活率顯著升高(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示，與缺

氧+pcDNA組相比，缺氧+pcDNA-KLF15組心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。可見，過表達KLF15促進缺氧處理心肌細胞增殖及抑制細胞凋亡。見表4，圖4。

1～4：miR-con組,miR-194組,anti-miR-con組,anti-miR-194組圖3 KLF15的3'UTR中含有與miR-194互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

表4 過表達KLF15促進缺氧處理心肌細胞增殖和抑制細胞凋亡

1,2：缺氧+pcDNA組,缺氧+pcDNA-KLF15組圖4 檢測心肌細胞中KLF15蛋白表達

2.5沉默KLF15部分逆轉抑制miR-194對缺氧處理心肌細胞的保護作用 Western印跡結果顯示，與缺氧+anti-miR-con組相比，缺氧+anti-miR-194組心肌細胞中KLF15和CyclinD1蛋白表達水平均顯著升高(均P<0.05)，酶切caspase-3蛋白表達水平顯

著降低(均P<0.05)；與缺氧+anti-miR-194+si-con組相比，缺氧+anti-miR-194+si-KLF15組心肌細胞中KLF15和CyclinD1蛋白表達水平顯著降低，酶切caspase-3蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)。MTT法檢測結果顯示，與缺氧+anti-miR-con組相比，缺氧+anti-miR-194組心肌細胞存活率顯著升高(P<0.05)；與缺氧+anti-miR-194+si-con組相比，缺氧+anti-miR-194+si-KLF15組心肌細胞存活率顯著降低(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示，與缺氧+anti-miR-con組相比，缺氧+anti-miR-194組心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與缺氧+anti-miR-194+si-con組相比，缺氧+anti-miR-194+si-KLF15組心肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表5、圖5。可見，沉默KLF15部分逆轉抑制miR-194對缺氧處理心肌細胞的保護作用。

表5 沉默KLF15部分逆轉降低miR-194對缺氧處理心肌細胞的保護作用

1～4：缺氧+anti-miR-con組,缺氧+anti-miR-194組， 缺氧+anti-miR-194+si-con組，缺氧+anti-miR-194+si-KLF15組圖5 檢測心肌細胞中KLF15蛋白表達

2.6miR-194調控KLF15對STAT3和p-STAT3的表達 Western印跡結果顯示，與Control組相比，缺氧組心肌細胞中p-STAT3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而STAT3蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05)；與缺氧+miR-con組相比，缺氧+miR-194組心肌細胞中p-STAT3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，STAT3蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05)；與缺氧+miR-194+pcDNA組相比，缺氧+miR-194+pcDNA-KLF15組心肌細胞中p-STAT3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，STAT3蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05)。見圖6、表6。可見，上調KLF15表達部分逆轉miR-194對缺氧處理心肌細胞中p-STAT3蛋白表達的抑制作用。

1～6：Control組，缺氧組，缺氧+anti-miR-con組，缺氧+anti-miR-194組，缺氧+anti-miR-194+si-con組，缺氧+anti-miR-194+si-KLF15組圖6 檢測心肌細胞中STAT3和p-STAT3的表達

表6 miR-194調控KLF15對STAT3和p-STAT3的表達

3 討 論

急性心肌梗死是一種常見的心肌壞死型心血管急危重病，有發病急、病程短及死亡率高等特點，主要由冠狀動脈急性或持續性缺氧所引發〔8〕。 miRNAs是心血管疾病新的標志物，急性心肌梗死、心肌病、心律失常和動脈血管硬化等疾病的病理改變早期有miRNA分子的參與，miRNA在其中發揮重要作用〔9〕。篩選缺氧性心肌病相關的miRNA，探討miRNA的作用分子機制，對其診斷、治療和預后具有指導意義。已有研究表明miR-182〔10〕、miR-19a-3p〔11〕等參與心肌細胞的缺氧壞死過程。miR-499可通過活化PI3K/Akt信號通路減少缺氧/復氧所誘導的心肌細胞凋亡〔12〕。miR-194通過調節IGF-1R/Akt信號通路抑制膠質瘤細胞增殖和糖代謝能力〔13〕；miR-194通過負向調控RBX1表達，從而抑制胃癌細胞的生長和轉移，促進細胞凋亡和細胞周期的阻滯〔14〕。miR-194在黑色素瘤細胞中低表達，miR-194表達上調可促進黑色素瘤細胞凋亡并抑制黑色素瘤細胞的增殖，其機制可能與下調CyclinD1蛋白及上調酶切caspase-3蛋白表達有關〔15〕。缺氧會調控miR-194-1啟動子的轉錄調控〔16〕。本研究結果表明，缺氧處理的心肌細胞中miR-194高表達，抑制miR-194表達促進缺氧處理的心肌細胞存活并抑制細胞凋亡。

Krüppel樣因子KLF15是Cys2/His2鋅指DNA結合蛋白的成員，在細胞的生長、分化、凋亡等生理過程發揮重要作用，研究發現KLF15抑制肺腺癌細胞的生長，可作為肺腺癌患者的治療靶點和預后分子標志物〔17〕。KLF15通過上調CDKN1A/p21和CDKN1C/p57表達抑制胃癌細胞的細胞增殖〔18〕。KLF15過表達通過抑制結締組織生長因子保護嚙齒動物模型中β-氨基丙腈誘導的主動脈破裂〔19〕。KLF15通過調節細胞死亡和抑制Akt/ mTOR信號傳導來預防異丙腎上腺素誘導的心臟肥大〔20〕。KLF15可通過反饋調節TGF-β，抑制CTGF及MRTF-A的作用，減輕心肌間質纖維化及心肌成纖維細胞表型轉變，從而改善心功能〔21〕。然而KLF15在心肌細胞中的作用機制還尚未完全清楚，本研究結果顯示，缺氧處理的心肌細胞中KLF15低表達，過表達KLF15促進缺氧處理的心肌細胞存活并抑制細胞凋亡。

周舟〔22〕研究發現caspase-3激活在缺氧誘導心肌細胞凋亡過程中具有重要作用，缺氧可上調心肌細胞caspase-3基因表達，而本研究結果顯示，缺氧心肌細胞中酶切caspase-3蛋白的表達水平顯著升高，而miR-194抑表達和KLF15過表達會使降低缺氧心肌細胞中酶切caspase-3蛋白的表達，證實了前人研究結果。而且有關miR-194與KLF15的調控關系及它們對缺氧誘導的心肌細胞凋亡的影響還鮮有報道，而本研究發現miR-194靶向負調控KLF15的表達。沉默KLF15部分逆轉miR-194抑制表達對缺氧處理心肌細胞的保護作用；過表達KLF15部分逆轉miR-194過表達對缺氧處理心肌細胞中p-STAT3蛋白表達的促進作用。

綜上，抑制miR-194表達能降低缺氧誘導的心肌細胞損傷，其機制可能與調控KLF15及p-STAT3蛋白的表達相關，為心肌細胞損傷的治療提供新思路和新靶點。