痰瘀同治法對動脈粥樣硬化大鼠易損斑塊的影響

靳宏光 朱星 李鐵 王義強 成光宇

(長春中醫藥大學 1附屬醫院，吉林 長春 130021；2針灸推拿研究所)

動脈粥樣硬化(AS)是一種常見慢性進行性全身性疾病，往往同時累及多處血管，嚴重影響人類健康，其病變的嚴重程度，主要取決于斑塊的穩定性。目前認為，在AS過程中，斑塊的易損性與炎性水平關系密切，且炎癥反應是斑塊易損過程中的主要驅動力，貫穿AS始終〔1〕。本實驗從炎性因子角度觀察具有痰瘀同治作用的參紅通絡方對AS大鼠主動脈易損斑塊的影響，以期揭示該中藥復方治療AS的可能機制。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級雄性SD大鼠80只，體重(280±20)g，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，許可證號SCXK(吉)2011-0004。飼養于吉林大學基礎醫學院動物飼養室，分籠飼養，大鼠自由飲水。飼養室溫度控制在18～22℃，濕度控制在50%～70%，通風良好。基礎飼料由20%面粉，3%米粉，25%玉米，25%麩皮，20%豆料，3%骨粉，4%魚粉配制組成。高脂飼料由77%的基礎飼料加入3%膽固醇，10%蛋黃粉，10%豬油構成。制備時先將基礎飼料與膽固醇、蛋黃粉、豬油充分混合攪拌均勻后，加入適量開水制成模餅，用微波爐烤干?；A飼料、膽固醇、蛋黃粉、豬油均由吉林大學動物實驗中心提供。

1.2藥物、試劑、材料和儀器 中藥方：參紅通絡方(主要由人參，紅景天，丹參，水蛭，栝蔞，石菖蒲等藥物組成)農本顆粒(吉林省萊沃藥業有限公司)；辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司，國藥準字J20130068，規格20 mg/片)；低分子肝素鈉(吉派林，杭州九源基因工程有限公司，國藥準字 H19990035，規格0.3 ml/瓶)；青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，國藥準字H13020657，規格80萬U/瓶)。血脂四項〔總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)〕試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20171111)；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒：sCD40L(天津安諾瑞康生物技術有限公司，批號208180418)、細胞間黏附分子(ICAM)-1(美國Cell Sciences 公司，批號20161018)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(天津安諾瑞康生物技術有限公司，批號569180418)、白細胞介素(IL)-1β(天津安諾瑞康生物技術有限公司，批號370180611)，ACS-H1電子天平、電子計重秤AWH(SI)、4K15低溫高速離心機、小型臺式離心機、酶標儀、AB×51型OLYMPUS光學顯微鏡、Olympus PM-10AO全自動顯微照相裝置、HH·W21·600電熱恒溫水浴箱、LKB～V型超薄切片機、病理攤烤片機、JEDA801D形態學圖像分析系統。

1.3方法 實驗動物在適應性喂養1 w后，采用隨機數字表法分為假手術組、模型對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、辛伐他汀組，每組各16只。球囊損傷術：除假手術組只結扎頸外動脈，不行球囊損傷術，其余各組大鼠均用球囊損傷主動脈。所有大鼠麻醉后，仰臥固定，頸部備皮，取頸部正中偏左3 mm切開皮膚，切口長2.5～3.5 cm，鈍性分離皮下組織與肌肉。在左側頸總動脈，下穿兩根4號絲線，結扎遠端，另一根線放置近端備用。在靠近血管遠端結扎處，剪開一“V” 形小口。假手術組直接在小口近心端結扎，其余各組大鼠用準備好的球囊沿小口處插入頸外動脈，繼續順著血管往下插，經過頸總動脈到達主動脈，調節壓力泵以6～8ATM擴張球囊，放松絲線，恢復血液供應，重復來回緩慢抽動球囊3次后，撤出球囊，靠近頸總動脈分叉處結扎頸外動脈近端，抽去頸總動脈處絲線，恢復動脈血流，同時查看頸總動脈及頸內動脈是否充盈搏動良好。各組大鼠均用碘伏清洗組織，再用生理鹽水沖洗3遍，逐層縫合。術后 3 d預防性應用青霉素 20萬U皮下注射，低分子肝素鈣繼續抗凝 3 d。術后普通飼料飲食，自由飲水1 w。術后第2周，除假手術組仍給普通飼料外，其余各組均予以高脂飼料喂養。高脂飲食飼喂6 w后開始采用相應藥物灌胃。中藥低劑量組、中藥高劑量組分別予以痰瘀同治中藥參紅通絡方生藥量7.15 g/(kg·d)、28.60 g/(kg·d)灌胃；辛伐他汀組以辛伐他汀1 mg/(kg·d) 灌胃；假手術組、AS模型組予以等容積的生理鹽水灌胃，1次/d，連續8 w。觀察指標與測定方法：①一般狀態觀察：包括動物精神狀態、毛色、飲食量、尿量、體重、死亡等情況。②血清樣品制備：實驗結束后，經眼球摘除取血，所取血液室溫放置30 min至2 h，待其血清析出后，離心制備血清，-20℃冰箱貯存待測。③標本測定：酶法測定血清中TC、TG的含量，選擇性沉淀法檢測LDL-C，HDL-C的含量，ELISA法測定血清中sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β的含量。取大鼠主動脈常規石蠟包埋，切片后做蘇木素-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察組織形態學變化。

1.4統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1一般情況 各組大鼠體重均明顯增加，其中以模型對照組最為明顯。假手術組、中藥高劑量組大鼠性情較溫順，精神狀態好，毛色光澤，體態勻稱，進食水及排尿便正常。模型對照組、中藥低劑量組、辛伐他汀組大鼠性情較暴躁，易撕咬，體態肥胖，多數大鼠精神不同程度萎靡，運動有所減少，皮毛蓬松而無光澤，其中又以模型對照組更為突出，排便相當。

2.2對AS大鼠血脂的影響 與假手術組比較，模型對照組血清TC、TG、LDL-C含量顯著升高(P<0.01)，HDL-C含量顯著降低(P<0.05)。與模型對照組比較，中藥高劑量組、中藥低劑量組與辛伐他汀組TC、TG、LDL-C含量均顯著下降(P<0.05，P<0.01)，中藥高劑量組HDL-C含量顯著升高(P<0.05)，中藥高劑量組在降低TC、LDL-C，升高HDL-C方面與辛伐他汀組相當(P>0.05)，但在降低TG方面明顯優于辛伐他汀組(P<0.05)，中藥低劑量組在改善TC、LDL-C水平方面明顯優于辛伐他汀組(P<0.05)。見表1。

表1 各組血脂水平比較

2.3對AS大鼠血清sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β的影響 與假手術組比較，模型對照組動物血清sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β含量均顯著升高(均P<0.01)。與模型對照組比較，中藥高劑量組、中藥低劑量組與辛伐他汀組sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β含量均顯著下降(P<0.05，P<0.01)，且中藥高劑量組與辛伐他汀組相當(P>0.05)，中藥低劑量組sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β含量均顯著高于辛伐他汀組(P<0.05,P<0.01)。見表2。

2.4主動脈病理情況 假手術組內膜光滑，平滑肌細胞排列整齊，模型對照組大鼠內膜欠光滑，平滑肌排列紊亂、增生，伴有大量泡沫細胞的蓄積，而經過藥物干預后，內膜相對光滑，平滑肌細胞排列相對規整，少量泡沫細胞的蓄積和平滑肌增生改善，其中，中藥高劑量組及辛伐他汀組顯著優于中藥低劑量組。見圖1。

表2 各組血清sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β水平比較

圖1 各組主動脈病理觀察(HE，×200)

3 討 論

AS發病機制尚未完全闡明，但損傷-炎癥反應學說目前被大多數學者所認可〔2〕，炎癥已成為AS發生發展過程中的核心因素。易損斑塊的形成即是一個損傷與抗損傷、炎癥激活與機體防御的慢性炎癥過程〔3〕，炎癥反應貫穿于AS斑塊形成、發展和破裂的全過程。研究表明，sCD40L可刺激血管內皮細胞、巨噬細胞及平滑肌細胞等產生如IL、ICAM、TNF等多種與AS斑塊形成相關的炎癥因子，從而加速斑塊的形成，當其表達水平越高時，其斑塊形成速度越快〔4〕，且與斑塊的易損性密切相關，被認為是心血管疾病患者預后的獨立預測因素〔5～7〕。

參紅通絡方由人參、紅景天、丹參、水蛭、栝蔞、石菖蒲等藥物組成，具有益氣活血、豁痰通絡作用。前期研究證實，痰瘀同治法對血脂異?；颊哐捻椌胁煌潭雀纳啤?〕，能降低頸動脈粥樣斑塊患者頸動脈內膜中層厚度(IMT)及斑塊 Crouse 積分〔9〕，同時能提高不穩定型心絞痛療效及降低血空腹胰島素(FINS)、超敏C反應蛋白(hs-CRP)水平〔10〕。通過主動脈病理觀察顯示，參紅通絡方能保護血管內膜、減少脂滴沉積和泡沫細胞形成，具有穩定斑塊的作用。綜上，說明該復方制劑有較好的降脂、抑制炎性因子、保護血管內膜的作用，可能是其抗AS、穩定易損斑塊的部分機制。