血尿清膠囊對IgA腎病模型大鼠腎組織中MMP-9及TIMP-1表達的影響

金迪 張守琳 鄒迪

(1長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2長春中醫藥大學附屬醫院)

IgA腎病(IgAN)占國內外原發性腎小球疾病的43.45%，發病率最高〔1〕，以IgA、IgG免疫復合物沉積在腎小球系膜區為特點。IgAN最初被認為是良性原發性腎小球疾病，但越來越多的臨床研究數據表明，在確診后的20～30年里將有30%～40%的IgAN患者發展至終末期腎臟病(ESRD)〔2〕。血尿清膠囊是長春中醫藥大學附屬醫院院內制劑，具有滋陰補腎、清熱利濕、涼血止血的作用。臨床應用近20年，取得了顯著效果，本研究旨在探討血尿清膠囊治療IgAN的療效及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇6～8周齡，SPF級雄性SD大鼠，共80只，體重(180±20) g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供〔許可證號SCXK(京)2016-0006〕。

1.2實驗儀器、試劑及藥物 全自動尿液分析儀URIT-1500購自上海三葳醫療設備有限公司；熒光素標記兔抗大鼠IgA抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；四氯化碳(CCl4)購自北京化學試劑廠；電子秤TD10002A購自余姚市金諾儀器有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；基質金屬蛋白酶(MMP)-9酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒、金屬蛋白酶抑制因子(TIMP)-1 ELISA檢測試劑盒(批號20180620A，規格96T/盒)購自美國RD公司；血尿清膠囊(墨旱蓮、車前草、小薊、蒲黃、三七)，批號：20180608，由長春中醫藥大學附屬醫院中醫藥研究中心制備提供；腎炎康復片(國藥準字Z10940034)購自天津同仁堂集團股份有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1造模方法 參照陸慧渝等〔3〕報道的方法制備IgAN動物模型；將BSA以蒸餾水配成100 g/L的濃度，從實驗第1天開始以BSA 400 mg/kg(4 ml/kg)灌胃，隔日1次，共8 w；皮下注射CCl4 0.1 ml+蓖麻油0.3 ml，1次/w，共9 w；于第6周尾靜脈注射LPS 0.05 mg/只(以0.9%NaCl配成溶液0.25 g/L，0.2 ml/只)。第9周各組隨機選取2只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠取腎組織，經蘇木素-伊紅染色(HE)及免疫組化觀察證實IgA造模是否成功。

1.3.2分組及給藥 第9周驗證IgAN大鼠模型成功后，將大鼠隨機分成模型組、血尿清膠囊高、中、低劑量組、腎炎康復片組。第10～16周給予藥物治療給予空白組和模型組每只大鼠2 ml/(kg·d)生理鹽水灌胃；血尿清膠囊高、中、低劑量組分別給予血尿清膠囊2 ml/(kg·d)灌胃〔相當于生藥量0.648 g/(kg·d)、0.324 g/(kg·d)、0.162 g/(kg·d)〕；對照組給予腎炎康復片2 ml/(kg·d)灌胃〔相當于生藥量0.648 g/(kg·d)〕。療程共8 w。

1.3.3觀測指標 觀察大鼠治療前后的一般狀態，檢測治療前后各時相尿紅細胞計數(RBC)、24 h尿蛋白定量(UTP)及治療后腎組織中MMP-9、TIMP-1含量。

1.3.4標本收集方法 將大鼠于0、4、6、8、10、12、14、16 w末放于代謝籠中收集24 h尿液，觀察尿液顏色變化，記錄尿量，應用磺基柳酸法檢測UTP；應用尿沉渣計數法測定尿RBC；給予藥物治療結束后，處死大鼠，取腎臟，采用ELISA(具體詳見試劑盒說明)檢測腎組織中MMP-9、TIMP-1含量。

1.4統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1一般情況 實驗過程中，空白組死亡2只，模型組死亡6只。空白組大鼠始終狀態良好，第6周開始造模組大鼠出現食欲差，乏力嗜睡倦怠，毛色晦暗，尿色加深，體重下降。給藥后，血尿清膠囊高、中、低劑量組和腎炎康復片組大鼠癥狀開始好轉。

2.2大鼠各時相尿RBC水平比較 空白組大鼠尿檢正常，其余各組大鼠自第6周開始尿RBC升高，自第10周起，各治療組大鼠尿RBC明顯較模型組下降(P<0.05)，血尿清膠囊中劑量組明顯優于腎炎康復片組(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠各時相尿RBC水平比較個/HP)

2.3大鼠各時相UTP水平比較 空白組大鼠尿檢正常，其余各組大鼠自第6周開始UTP升高，自第10周起各治療組大鼠UTP明顯較模型組下降(P<0.05)，血尿清膠囊中劑量組明顯優于腎炎康復片組(P<0.05)，見表2。

2.4各組腎組織中MMP-9、TIMP-1水平比較 與空白組比較，模型組大鼠MMP-9水平明顯下降，TIMP-1水平明顯上升，MMP-9/TIMP-1比值明顯降低(均P<0.05)；與模型組比較，各治療組MMP-9水平明顯上升，TIMP-1水平明顯下降，MMP-9/TIMP-1比值明顯上升，以血尿清膠囊中劑量組變化更為明顯(均P<0.05),且明顯優于腎炎康復片組(P<0.05)。見表3。

表2 大鼠各時相UTP水平比較

表3 各組腎組織中MMP-9，TIMP-1水平比較

3 討 論

IgAN以血尿、蛋白尿為主要臨床表現。對于腎小球源性血尿合并蛋白尿>1.0 g/d以上者，現代醫學以腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)阻斷劑、激素聯合免疫抑制劑為主治療，而對于單純性血尿尚無有效的治療方法。中醫藥治療血尿，較之西藥治療有獨特的優勢，臨床療效較好、副作用小，不僅能控制血尿，同時能有效改善患者的腰痛、乏力等臨床癥狀。“尿血”“溺血”是血尿在中醫里的名稱。多半以上的醫生認為引起血尿病因病理主要是濕熱，故多以清熱利濕、涼血止血為主要治病原則。但血尿極易反復發作，病情纏綿難愈，其根本原因在于“久病多虛”“久病多瘀”，慢性腎炎患者由于長期血尿傷及腎臟，不僅存在“下焦濕熱”，同時還存在腎陰虧虛、瘀血阻絡的病理機制，由于單純注重清熱涼血以治其標，而忽略了滋陰補腎扶其本，造成血尿反復經久不愈。血尿清膠囊是長春中醫藥大學附屬醫院老中醫經過多年臨床經驗總結研制而成，歷經20年的臨床應用，療效顯著，能夠有效降低血尿及蛋白尿。早蓮草能涼血止血，同時入肝腎二經，具有滋補肝腎，固本培元，使水旺則火自熄的作用，為君藥；小薊能清下焦熱，有止血、散瘀解毒的功效；梔子苦寒，清熱瀉火，除煩利濕，涼血以止血，二者共為臣藥，既能助君藥涼血止血，同時還能破瘀生新，保精養血，使止血而不留瘀；佐使藥為蒲黃、三七、車前草，有化瘀涼血止血的作用；諸藥合用，攻補兼施，共奏滋陰補腎以扶正，清熱涼血止血，化瘀通絡的作用，使止血而不留瘀。

IgAN的發病往往是由多種原因共同作用的結果。目前研究發現，細胞外基質(ECM)降解酶系統紊亂，會引起ECM積聚導致進行性腎小球硬化(GS)和間質纖維化(TIF)，最終進入ESRD〔4，5〕。而MMP-9是調節ECM的最重要的酶〔6，7〕，TIMP-1是一種主要抑制腎臟ECM降解導致GS的酶〔8～10〕。TIMP-1與 MMP-9以1∶1形成MMP-TIMP復合物，阻斷MMP-9與底物結合，從而影響ECM積聚和降解平衡〔11，12〕,TIMP-1/MMP-9任何兩者間的比例失衡都可能使ECM異常聚積，引發腎小球疾病，導致腎小球結構重塑，血尿和蛋白尿形成。因此維持 MMPs/TIMPs系統平衡顯得非常重要。

本研究結果表明血尿清膠囊能夠降低血尿和蛋白尿，而MMP-9、TIMP-1的異常表達參與了IgAN的發病機制，血尿清膠囊通過調節MMP-9/TIMP-1的平衡從而達到治療IgAN的目的。