基于網絡藥理學探討顛倒木金散治療冠心病的分子機制研究

●葉招娣 劉中勇

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱“冠心病”）是工業化國家最常見的死亡原因，也是發展中國家心血管疾病發病率和死亡率上升的重要原因[1]。2017年的心臟病大會揭示，冠心病的患病率呈攀升態勢，缺血性心臟病的患病率從2003 年的4.6‰提高到2015 年的10.2‰，增加了2倍多[2]。現代醫學治療冠心病的主要手段包括藥物治療如穩定斑塊、降低血脂、改善缺血，還包括有創治療如經皮冠脈介入治療和冠脈動脈旁路搭橋術[3]。冠心病歸屬于中醫學“胸痹心痛”范疇，治療以行氣活血為主，顛倒木金散為這一類藥的代表，方中木香、郁金行氣活血化瘀。在現代基礎研究的體系里發現中藥治療疾病具有多靶點、多通路的特點，基于系統生物學理論的網絡藥理學有助于反映中藥復方背后的分子、通路機制，將中藥轉換成一個個活性成分，活性成分對應的靶點與疾病聯系起來，指導臨床用藥，故而本文運用網絡藥理學的方法探討顛倒木金散治療冠心病的潛在機理。

1 材料與方法

1.1 顛倒木金散相關靶點篩選通過檢索中藥系統藥理學數據庫(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)平臺下載中藥化學成分，根據口服利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18的2個ADME 屬性值進行活性成分初步篩選以獲得活性化合物及其作用的蛋白質靶點，并根據已發表的文獻報道補充未預測到的活性化合物的已知靶點。篩選結束后，為標準化蛋白質靶點信息，統一在Uniprot 蛋白質數據庫（https://www.uniprot.org）將化合物作用的蛋白質靶點進行規范。

1.2 冠心病相關靶點篩選冠心病相關靶點篩選以“cardiovascular disease”“coronary heart disease”“coronary artery disease”為關鍵詞在OMIM 數據庫（http://www.omim.org/）和GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）進行篩選，合并疾病數據庫靶點后，刪除重復值得到冠心病的疾病靶點。

1.3 顛倒木金散成分-冠心病靶點PPI 網絡為尋找顛倒木金散藥物相關靶點與冠心病靶點間的相互作用，將得到的藥物有效成分及靶點與疾病的靶點進行合并，得到顛倒木金散有效成分治療冠心病的靶點。將得到的靶點數據上傳至Cytoscape 3.7.2 軟件中，構建“藥物-成分-靶點”網絡圖。其中節點代表木香、郁金有效成分、靶點等，邊代表木香、郁金成分與成分、成分與靶點之間、藥物與成分靶點之間的關系。

1.4 藥物-疾病核心PPI 網絡構建將藥物和疾病的交集靶點數據輸至STRING 數據庫（http：//stringdb.org）中，將物種定義為“人”，構建郁金-木香治療冠心病的PPI 網絡。將STRING 數據庫文件導入至Cytoscape3.7.2軟件中，并運用其內置工具分析有效成分及靶點的網絡拓撲參數，包括連接度（Degree）、介度（Betweenness）及緊密度（Closenesss）等，以Degree大于平均值為標準，篩選出核心靶點[4]。

1.5 功能富集與生物通路分析將藥物和疾病的交集靶點數據傳輸至DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），選擇“OFFICE_GENE_SYMBOL”“genelist”，種屬選為“Homosapiens”，之后選取“geneontology”下的“GOTERM_BP_DIRECT”及“pathways”下的“KEGG_PATHWAY”進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析及基因本體（Gene Ontology，GO）生物過程的富集分析。

2 結果

2.1 顛倒木金散活性成分的篩選通過TCMSP 數據庫檢索郁金-木香的有效成分，并與文獻中檢索得到的有效成分一同納入，根據篩選標準最終得到活性成分29個（包括一個重復成分），其中木香13個，郁金16個，其中有效成分包括β-谷甾醇、豆甾醇、結晶酚、丁香苷、柚皮素等。見表1。

2.2 顛倒木金散治療冠心病的潛在作用靶點將收集到的郁金-木香靶點刪除重復值后，得到兩味藥有效成分作用靶點78個，冠心病靶點5332個，將藥物與疾病的靶點合集得到藥物與疾病的Venn 圖。由圖1可見，藥物與疾病的共有靶點為67 個，即郁金-木香治療冠心病的潛在靶點。

2.3 藥物-成分-靶點網絡圖顛倒木金散治療冠心病的“藥物-成分-靶點”網絡圖見圖2。其中，里面的小圓圈代表藥物的活性成分，外面的大圓圈代表藥物的作用靶點，節點的面積、顏色透明度和字體的大小代表其度數，面積越大、顏色越深和字體越大說明該節點越重要；線條的粗細也代表兩者關系的緊密。圖中共有108 個節點，其中木香、郁金各1 個，藥物治療疾病的活性成分28 個，藥物的靶點78 個。通過CytoScape3.7.1 內置的NetworkAnalyzer 分析顛倒木金散治療冠心病的核心成分，按Degree 值進行排序，可見β-谷甾醇的介度為0.41197061，緊密度為0.55154639，連接度為50，預測β-谷甾醇為顛倒木金散治療冠心病的主要成分。具體見表2。

圖1 藥物疾病韋恩圖

圖2 顛倒木金散治療冠心病的藥物活性成分靶點圖

表1 顛倒木金散的藥物活性成分表

2.4 藥物-疾病的核心靶點PPI 網絡圖將藥物郁金-木香與冠心病的靶點合并取交集，得到藥物治療疾病的67 個靶點，將這67 個靶點導入STRING 數據庫，物種限定為“人”，得到藥物-疾病PPI 網絡圖，具體見圖3。圖中共有67 節點，106 條邊，平均節點度10.3，節點代表靶標蛋白，邊表示蛋白與蛋白之間的關系。再將該結果以TSV 格式導出，導入到Cytoscape3.7.2 軟件中，以Degree 值大于10 為標準進行篩選，最終得到32 個核心靶點，見圖4。其中顏色越深、字體越大和面積越大代表節點值較高的靶點，其中NOS3（內皮型一氧化氮合酶）、PTGS2（環加氧酶2）可能是顛倒木金散治療冠心病的主要靶點，JUN(禽肉瘤病毒17 的轉化基因)、MAPK1（絲裂原活化蛋白激酶）、CAT（過氧化氫酶）、NR3C1、SOD1（超氧化物歧化酶）、ESR1（雌激素受體1）、MAPK14（絲裂原活化蛋白激酶14）、ACHE（膽堿酯酶）、PPARG（過氧化物酶體增生激活受體γ）等亦為重要的靶點。

2.5 GO生物過程分析將藥物治療疾病的67個靶點錄入David 數據庫并進行GO 分析，得到分子功能、生物過程和細胞成分條目180個，再根據P≤0.05，FDR≤0.05進行篩選，得到GO-BP（生物過程）7條、GO-CC（細胞成分）3 條、GO-MF（分子功能）7 條。并通過在線網址omicsshare（http://omicsmart.com/）對數據進行可視化。由結果可見，多個靶點的功能與冠心病的發生發展密不可分。顛倒木金散主要參與的生物學過程包括對藥物反應、激活腺苷酸環化酶腎上腺素能受體、對有毒物質的反應、調節血壓、對雌二醇的反應、調節平滑肌收縮等。相關靶點治療冠心病的的功能主要富集在類固醇激素受體(steroid hormone receptor activity)、酶結合(enzyme binding)、蛋白質均聚活性(protein homodimerization activity)、藥物結合(drug binding)、類固醇結合(steroid binding)、腎上腺素結合(epinephrine binding)等。見圖5。

表2 顛倒木金散主要活性成分網絡節點特征參數

圖3 顛倒木金散-冠心病靶點PPI網絡圖

圖4 顛倒木金散-冠心病核心靶點PPI網絡圖

2.6 KEGG通路富集分析將藥物作用與疾病的靶點錄入David 數據庫，得到KEGG 通路73 條，以P≤0.05 為篩選標準，篩選出64 條，選取前10 條信號通路，包括神經活性配體-受體相互作用通路（Neuroactive ligand-receptor interaction）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway）、雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、心肌細胞腎上腺素能信號轉導（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）、膽堿能突觸信號通路（Cholinergic synapse）等。見表3。

3 討論

冠心病是危害人類健康的常見病，給社會帶來巨大的經濟負擔。畢穎斐等[5]總結中藥復方在緩解心絞痛、干預PCI 術后再狹窄、防治再灌注后無復流及在心肌梗死二級預防等方面存在一定的臨床優勢。任毅等[6]基于數據挖掘總結出當代名老中醫治療冠心病的核心藥物就包括了木香、郁金。馬維成[7]將70例穩定性心絞痛患者作為研究對象，發現常規療法加用加味顛倒木金散能夠明顯改善患者的臨床癥狀和減少硝酸甘油的使用。王秋月等[8]研究發現毛郁金醇提物具有良好的改善心肌梗死再灌注損傷的作用，能清除氧自由基并減少其生成，抑制脂質過氧化，降低心肌細胞損傷程度，增強機體抗氧化能力，最終達到保護和改善心臟功能。SOD能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。MDA 是氧自由基造成損傷的最主要因素，它不僅把活性氧轉化成活性化學劑，而且還通過鏈式或鏈式支鏈反應，放大活性氧的作用，引起細胞損傷。石冰卓等[9]則進一步證實毛郁金醇提物可以提高SOD/MDA、GSH/MDA 值，清除氧自由基，抑制脂過氧化，并使心肌細胞腫脹和炎性細胞浸潤減輕，從而緩解心肌缺血。冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂出血，繼發血小板的聚集，而動物實驗[10]表明木香揮發油及去氫木香內酯、木香烴內酯成分具有顯著的抑制ADP誘導的血小板聚集作用。

冠心病歸屬于中醫學“胸痹心痛”范疇，其基本病機是本虛標實，根本原因在于氣血陰陽虧虛，心氣鼓動無力，導致痰濁血瘀，內阻心脈，不通則痛[11]。齊婧等[12]基于聚類分析總結冠心病心絞痛基本中醫證候可大致分為熱毒蘊結證、肝郁陰虛證、痰濕阻滯證、瘀血阻絡證、陽氣虛證、心腎氣虛證6類，其中瘀血阻絡證為常見的證型。顛倒木金散出自于《醫宗金鑒》，主治氣、血、熱飲、老痰之胸痛。方中郁金辛散苦瀉，既能活血祛瘀以止痛，又能疏肝行氣以解郁，善治氣滯血瘀之證；木香行氣止痛，調中導滯。

圖5 GO分析圖

表3 顛倒木金散治療冠心病靶點通路富集結果

本研究初步篩選出顛倒木金散治療冠心病的活性成分為β-谷甾醇、豆甾醇、結晶酚、丁香苷、柚皮素。植物甾醇存在于植物油的非皂化組分中，膳食中主要的植物甾醇是谷甾醇和豆甾醇，研究[13]發現植物甾醇能夠使膽固醇吸收降低，從而導致血漿膽固醇含量降低，預防心血管疾病。黃酮類化合物是公認的天然抗氧化劑，有助于心臟保護作用，柚皮素是一種存在于柚子和柑橘類水果中的柑橘類黃酮類化合物，研究[14]發現柚皮素對高膽固醇血癥患者能夠降低血脂和增加抗氧化酶活性，如SOD1（超氧化物歧化酶）、CAT（過氧化氫酶）。過度的炎癥、氧自由基的損害可介導心肌細胞凋亡，而這種不正常的細胞凋亡可加重缺血心肌的損傷。紫丁香苷是一種苯丙醇苷類化合物，研究[15]發現丁香苷可降低炎癥組織MDA 含量，提高SOD活性，起到抗氧自由基的作用，從而保護心臟。

本研究發現，顛倒木金散治療冠心病的靶點主要是NOS3 和PTGS2。NOS 包括三種同工酶:內皮型(eNOS)、神經型(nNOS)和誘導型(iNOS)。eNOS 主要通過抑制白細胞黏附及遷移、減少低密度脂蛋白氧化和抑制平滑肌細胞增殖等途徑來抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成[16]；iNOS 則促進動脈粥樣硬化斑塊形成。研究[17]發現木香的提取物去氫木香內酯能使核轉錄因子（NF-κB）失活而抑制誘導型一氧化氮合酶（iNOS）基因的表達，從而減少斑塊的形成。但是，木香到底是通過激活eNOS 還是通過抑制iNOS 來抑制動脈粥樣硬化斑塊形成，還需在未來的實驗中進一步驗證。PTGS2 在多種細胞類型如巨噬細胞、內皮細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞中均有表達，并被細胞因子、生長因子、激素和癌基因高度誘導，研究[18]發現PTGS2酶抑制劑能顯著縮小梗死面積，證實了PTGS2酶能夠誘導心肌梗死并且導致心肌功能障礙。

顛倒木金散治療冠心病的通路包括神經活性配體受體相互作用信號通路、鈣離子信號通路和雌激素信號通路。神經活性配體受體相互作用信號通路是質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體和配體的集合[19]，此信號通路上的蛋白在心肌細胞和冠狀動脈均有表達，神經活性物質如去甲腎上腺素激動α受體激動，引起心肌收縮力增強、心率加快[20]；再如血管緊張素（Ang）II 促進血管炎癥和動脈粥樣硬化的發生，且還能介導血管內皮線粒體功能障礙[21]。心肌細胞的鈣離子轉運與鈣離子通路有關，心肌收縮高度依賴于細胞內Ca2+水平，鈣通道阻滯劑阻斷鈣離子經過細胞膜上的鈣離子通道進入細胞，減少心肌收縮，減輕心絞痛的癥狀[22]。與男性相比，絕經前女性的心血管疾病減少，但絕經后女性心血管疾病的發病率增加，大量的研究證實可能與雌激素水平相關，雌激素可以與膜受體GPER1結合，結合后激活磷脂酰肌醇-3（PI3）激酶，進而激活蛋白激酶B(Akt)激酶，能夠減少梗死面積，對心臟具有保護作用[23]。故推測顛倒木金散可能通過阻斷鈣離子信號通路以及激活雌激素信號通路來治療冠心病。

綜上，本文運用網絡藥理學的方法提示木香-郁金共有28個活性成分，作用于67個靶點，經過多種蛋白功能，涉及了多種通路和生物進程，表明顛倒木金散通過多成分-多靶點-多途徑治療冠心病。后續可通過實驗驗證其治療冠心病的作用靶點和信號通路。