馬克斯克魯維酵母與釀酒酵母混合發酵對液態法黃酒風味的影響

劉夢,繆禮鴻,劉蒲臨,王霜,高瑞杰

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院,湖北 武漢,430023)

黃酒是以稻米、黍米等為主要原料，經加曲、酵母等糖化發酵劑釀制而成的一種發酵酒。傳統黃酒發酵由細菌、霉菌、酵母菌等多種微生物參與完成，風味成分主要包括酸類、酯類、高級醇和醛類等[1-4]。酒藥是黃酒釀造中使用的重要糖化發酵劑，而酒藥中的酵母主要包括釀酒酵母、扣囊復膜孢酵母和隱球酵母等，其作為發酵黃酒的主要微生物，對黃酒風味特征的影響一直是黃酒釀造研究的熱點[4-6]。

早期研究認為，非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵時，非釀酒酵母的早衰現象會對酒的風味和口感產生不利影響，但隨著研究的深入，發現非釀酒酵母的加入有助于改善酒的香氣和風味[7-12]。馬克斯克魯維酵母是食品安全級酵母，廣泛存在于酸奶、水果、酸乳酒等環境中[13]，具有耐高溫能力強、安全性好、底物利用范圍廣等特性[14-15]，并具有產乙酸乙酯等多種風味物質的能力[16]。馬克斯克魯維酵母基于上述優點，一些研究人員開始嘗試將馬克斯克魯維酵母應用于釀酒生產中。LPEZ-ALVAREZ等[17]將馬克斯克魯維酵母應用于龍舌蘭酒發酵中，制備出了具有較高乙醇濃度和芳香化合物的龍舌蘭酒。GARAVAGLIA等[18]將馬克斯克魯維酵母應用于葡萄汁發酵中，發酵產物富含β-苯乙醇。馬克斯克魯維酵母在乳清酒發酵[19]、稀奶油發酵[20]等方面均表現出良好的發酵性能。此外，國內已有研究者開展了將馬克斯克魯維酵母應用于奶啤發酵的研究中[21]。

本實驗室分離并報道了1株高產乙醇和乙酸乙酯的馬克斯克魯維酵母菌株HY32[22-23]，在此基礎上，采用液態法黃酒發酵工藝，對HY32菌株與釀酒酵母混合發酵對黃酒的效果進行了研究，從微生物數量、酒精度、各風味物質的成分和含量以及酒樣的感官評定等方面來探索以HY32與釀酒酵母混合發酵制備黃酒的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)HY32,本實驗室分離保存；釀酒酵母(Sacchromycescerevisiae)TRADY,某酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

糯米,市售；耐高溫α-淀粉酶、糖化酶,棗莊杰諾生物酶有限公司；葡萄糖、乳酸(分析純),天津科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

酵母種子培養基(YPD,g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10,115 ℃滅菌30 min。固體YPD培養基需加入20 g/L瓊脂。

馬丁孟加拉紅固體培養基(g/L)：葡萄糖10、蛋白胨5、KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.5、孟加拉紅33.4 mg、瓊脂20,115 ℃滅菌30 min。

糯米糖化發酵培養基：稱取一定量的糯米粉,按料液比1∶2.5(g∶mL)加入蒸餾水,加液化酶(15 U/g)進行液化(95 ℃,90 min),加糖化酶(150 U/g)進行糖化(65 ℃,30 min),冷卻后即為糖化發酵培養基。

1.2 儀器

ZWYR-2102C恒溫培養振蕩器,上海智城分析儀器制造公司；DNP-9082恒溫培養箱,上海精宏實驗設備有限公司；HH-6恒溫水浴鍋,國華電器有限公司；UV-5900PC紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司；7890A氣相色譜儀,美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃酒發酵工藝流程

糯米→粉碎→液化→糖化→接種→主發酵→后發酵→過濾→巴氏殺菌→成品

工藝要點：將糯米粉碎后過40目篩,稱取糯米粉71.4 g于500 mL三角瓶中,按料液比1∶2.5(g∶mL)加入178.5 mL蒸餾水。混勻后按15 U/g干糯米加入耐高溫α-淀粉酶,于95 ℃水浴鍋中液化90 min,冷卻后用乳酸調pH至4.5～5.0,再按150 U/g干糯米加入糖化酶,于65 ℃水浴鍋中糖化30 min,期間用玻璃棒不斷攪拌,使糯米粉充分液化、糖化。冷卻后接種,28 ℃進行發酵。

1.3.2 酵母菌種子液的培養

先將酵母菌HY32和TRADY分別劃線接種于YPD固體平板上活化24 h,然后再接種于YPD液體培養基中搖床培養14～16 h,最后采用血球計數板法分別測定菌液濃度以確定接種體積。

1.3.3 發酵溫度對HY32發酵糯米產黃酒的影響

按1.0×107個/mL接種發酵培養基,接種完成后分別置于28和37 ℃進行靜置發酵,繪制生長曲線,比較2種情況下的酒精度和風味物質的含量。

1.3.4 通氣量對HY32發酵糯米黃酒的影響

按1.0×107個/mL接種量接種糯米發酵培養基,分別于28 ℃,100 r/min的搖床和28 ℃靜置發酵,不同時間取樣,繪制生長曲線并測定酒精度和風味物質的含量。

1.3.5 不同比例的HY32與TRADY混合發酵方法

將TRADY與HY32分別按種不同的總菌數比(1∶1、2.5∶1、5∶13)接種,計算不同比例混合發酵所需菌液的體積,接種后于28 ℃下靜置發酵7 d。

1.3.6 HY32純種及混合發酵酵母活菌數的測定方法

采用稀釋平板涂布法測定：每隔24 h對發酵液取樣,經無菌水系列稀釋后,純種發酵液的稀釋樣直接涂布于YPD平板上計數；混合發酵液的稀釋樣涂布于孟加拉紅平板上計數,由于HY32酵母菌落在孟加拉紅平板上顯白色,而TRADY顯紅色,因此可根據酵母菌落的顏色差異來區分2種酵母。

1.3.7 還原糖測定方法

還原糖采用3,5-二硝基水楊酸法進行測定[24]。

1.3.8 乙醇含量及風味物質的測定

取發酵液和蒸餾水各100 mL于500 mL蒸餾瓶中蒸餾,收集前100 mL蒸出液,用氣相色譜儀測定。檢測器：氫火焰離子化檢測器(FID)；色譜柱：J&W CP-Wax 57 CB Acidic(50 m×0.25 mm,0.2 μm)；載氣：N2；儀器參數為：進樣量1 μL,分流比10∶1,H2流速為30 mL/min,空氣流速為400 mL/min,N2流速為25 mL/min,進樣口溫度220 ℃,檢測器溫度為200 ℃,初始溫度為60 ℃,維持5 min,以10 ℃/min的上升速率升至160 ℃,維持5 min,總運行時間20 min。

1.3.9 主成分分析方法

主成分分析應用SPSS軟件進行[25]。

1.3.10 酒樣的感官評定方法

感官品評人員由14名經培訓的感官品評人員組成,感官評定指標及各指標得分參照表1進行,感官評定操作參照GB/T 13662—2018《黃酒》[26]進行。

表1 黃酒感官評分等級表Table 1 Sensory rating scales of rice wine

2 結果和分析

2.1 HY32菌株純種發酵結果

2.1.1 發酵溫度對HY32發酵活菌數及黃酒組分的影響

2種溫度下HY32在糯米發酵培養基中的生長曲線如圖1所示。HY32活菌數均在發酵初期24 h內快速增長并達到最大值,37 ℃下的最大活菌數高于28 ℃,分別為1.15×108和0.81×108個/mL。此后,活菌數均開始下降,在48～120 h保持穩定或稍有上升,發酵120 h后,活菌數開始減少。從整體來看,HY32在37 ℃下發酵的活菌數要高于28 ℃,這可能與HY32本身是耐熱酵母菌有關。

圖1 不同發酵溫度下HY32的生長曲線Fig.1 Growth curves of HY32 at different fermentation temperatures

2種溫度下的黃酒發酵產物的氣相色譜分析結果如表2所示。37 ℃發酵條件下,HY32發酵黃酒的乙醇體積分數達7.13%,比28 ℃發酵時的乙醇體積分數(3.25%)高出2.2倍。37 ℃下發酵產生的乙酸乙酯、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇和醋嗡含量分別是28 ℃下發酵產生量的1.96、2.47、3.73、3.27和7.48倍,而37 ℃下發酵產酸能力有明顯降低,其中乙酸、異戊酸、己酸含量分別只有28 ℃下發酵的81.95%、22.50%和66.46%。

表2 HY32發酵產物的氣相色譜分析結果 單位：mg/mL

2.1.2 通氣量對HY32發酵乙醇含量及風味物質的影響

搖床和靜置發酵2種情況下的HY32生長情況如圖2所示。發酵24 h時，搖床和靜置2種發酵條件下的活菌數均達到最大值,分別為1.3×108和0.81×108個/mL,搖床培養的最大活菌數高于靜置培養。此后,兩者活菌數均開始下降,在48～120 h保持在相對穩定水平,發酵120 h后,酵母活菌數開始減少。

圖2 不同通氣條件下HY32的生長曲線Fig.2 Growth curves of HY32 under different aeration conditions

發酵完成后,發酵產物氣相色譜分析結果如表3所示。100 r/min搖床發酵的酒精度為3.29%(體積分數),與靜置發酵的酒精度無顯著差別；而乙酸乙酯含量達1 369.69 mg/L,是靜置發酵樣品的乙酸乙酯含量的9.66倍。有研究表明,乙酸乙酯的合成是好氧代謝[16],隨著搖瓶轉速增加培養液中溶氧也增大,乙酸乙酯產量呈上升趨勢[27]。

表3 不同通氣條件下發酵產物的氣相色譜分析結果 單位：mg/mL

除乙酸乙酯外,100 r/min搖床發酵下的異丁醇、異戊醇、醋嗡、乙酸和己酸的含量均顯著高于靜置發酵,但乙醛、正丙醇、丙酸、丁酸、戊酸的含量均有所降低。

2.2 HY32與TRADY混合發酵結果

2.2.1 HY32與TRADY按不同比例混合發酵結果

將酒精度、β-苯乙醇和乙酸乙酯的含量作為確定混菌發酵最佳混合比例的3個標準。HY32與TRADY按不同比例混合發酵結果如表4所示。在保證接種總菌數不變的情況下,HY32與TRADY按不同比例混合發酵時,酒精度隨TRADY的比例增加無明顯變化,3種比例下的酒精度都在10%(體積分數)左右。乙酸乙酯含量隨HY32比例的減小而逐漸降低,β-苯乙醇含量隨HY32比例的減小而逐漸增加,但增加量較小。結果表明,當混菌發酵比例為1∶1時,酒精度為10.76%(體積分數)、乙酸乙酯含量為77.62 mg/L、β-苯乙醇含量為62.25 mg/L,三者均在較佳狀態。因此,后續混菌發酵實驗均采用1∶1的比例混合。

表4 HY32與TRADY按不同比例混合發酵氣相色譜結果Table 4 GC results of HY32 and TRADY co-fermented culture with different proportions

2.2.2 1∶1混合發酵的酵母生長曲線

HY32與TRADY按1∶1混合發酵的生長曲線如圖3所示。2種酵母在發酵初期的前24 h菌數快速增長并且數量相當,分別為0.35×108和0.33×108個/mL,此時的HY32活菌數達到最大。在發酵24 h后,HY32活菌數開始下降,到72 h時降至0.02×108個/mL,而TRADY在發酵24 h后反而處于緩慢上升狀態。這表明HY32與TRADY混合發酵時,按相同接種量接種,前期兩者菌數相當,后期TRADY占絕對優勢,這可能與釀酒酵母具有較好的乙醇耐受能力有關。

圖3 按1∶1混合發酵酵母生長曲線Fig.3 Growth curves of HY32 and TRADY under mixed fermentation(ratio 1∶1)

2.2.3 1∶1混合發酵過程的動態變化曲線

發酵過程中酒精度及殘糖的動態變化曲線如圖4所示。隨著發酵時間的延長,酒精度逐漸增加,殘糖量逐漸降低。1∶1混合發酵的酒精度和殘糖量變化曲線與純種TRADY的酒精度和殘糖量變化曲線大體相同,純種HY32的酒精度則偏低,殘糖量則偏高。

圖4 純種及混合發酵過程中酒精度與殘糖的動態變化曲線Fig.4 Curves of ethanol and sugar content under monoculture and co-culture

發酵過程中乙酸乙酯含量的動態變化曲線如圖5所示。1∶1混合發酵樣的乙酸乙酯的產生主要發生在發酵前3 d。第3天以后,乙酸乙酯的含量基本保持不變。這與混合發酵時2種酵母的生長曲線結果相符,因為HY32是乙酸乙酯的主要產生者,其在混合發酵時的第3天基本已經死亡。與純種HY32相比,混合發酵樣的乙酸乙酯含量有所降低,但仍比純種釀酒酵母高許多。

圖5 發酵過程中乙酸乙酯含量的變化曲線Fig.5 Variations of ethyl acetate content under monoculture and co-culture

發酵過程中β-苯乙醇含量的動態變化曲線如圖6所示。在整個發酵過程中,β-苯乙醇的含量基本都處于上升狀態,1∶1混合發酵樣的β-苯乙醇含量介于純種TRADY和純種HY32之間,更接近純種TRADY。由此可知,1∶1混合發酵與純種TRADY發酵相比,β-苯乙醇含量略有降低,但影響不大。

圖6 發酵過程中β-苯乙醇含量的變化曲線Fig.6 Variations of β-phenethyl alcohol content under monoculture and co-culture

2.2.4 按1∶1混合發酵酒樣的氣相色譜分析結果

混菌發酵黃酒完成后的發酵產物氣相色譜分析結果如表5所示。混菌發酵與TRADY純種發酵的黃酒酒精度相近,均在14%(體積分數)左右,與TRADY純種發酵相比,混合發酵的乙酸乙酯、乙酸含量分別由21.43、284.09 mg/L增至52.79、371.90 mg/L,己酸乙酯、醋嗡、2,3-丁二醇、丁酸、戊酸、己酸等風味物質的含量均高于純種TRADY發酵。

表5 HY32和TRADY單獨發酵及1∶1混合發酵的氣相色譜分析結果 單位：mg/mL

HY32與TRADY按1∶1混合發酵黃酒樣的乙酸乙酯和乙酸含量分別比單一釀酒酵母提高了2.46倍和1.31倍,而高級醇(正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇)總量為513.3 mg/L,是單一釀酒酵母發酵酒樣高級醇含量(626.5 mg/L)的81.9%。此外,混合發酵還增加了一些新的風味成分,如己酸乙酯、2,3-丁二醇(左旋),有效改善了黃酒的質量和風味。

2.2.5 主成分分析結果

將混合發酵的氣相色譜結果進行主成分分析,以尋求各風味物質與各酵母菌株的關系,其結果如圖7所示。第一、二主成分各占77.21%和22.16%,2個主成分可以反映全部信息的99.37%,提取較為完全。分析的風味成分可分為3組,組1包括3種醇類、3種酯類、2種醛類以及異戊酸,這些組份含量越高,樣本在主成分一上的載荷就越大；組2包括4種酸類、乙酸乙酯和異丁醇,這些組份含量越高,樣本在主成分一上的載荷就越小；組3包括戊酸、丁二醇、乙酸乙酯以及醋翁,這些組份含量越高,樣本在主成分二上的載荷就越高。組1和組2所包含的成分分別分布在坐標軸的兩端,說明HY32和TRADY所產生的風味物質相差較大,組1所含成分主要由TRADY貢獻,組2所含成分主要由HY32貢獻。組3所含成分在TRADY或HY32單獨發酵時含量很低甚至不產生,當兩者混合發酵時就會產生較高的組3成分。

圖7 混合發酵酒樣風味物質的主成分分析圖Fig.7 Principal component analysis of mixed fermentation

2.3 混菌發酵成品黃酒的理化指標及感官評定結果

由表6可知,HY32與TRADY按1∶1混合發酵的黃酒成品各理化指標適宜,符合國家清爽型半甜黃酒的標準(GB/T 13662—2018)。

發酵酒樣感官評定結果如表7所示,感官加權評分值為各指標等級得分與相應權重乘積的總和。由表7可知,按1∶1混合發酵酒樣的加權評分高于TRADY純種發酵。2種酒樣在色澤上沒有太大差別,均透明,呈淡黃色。在香氣、口感和風格上,1∶1混合發酵酒樣的口感更加爽口柔和,醇香更為濃郁,具有黃酒應有的風格。相比之下,TRADY純種發酵酒樣的口感較單薄,略帶澀。

表6 按1∶1混合發酵酒樣理化結果Table 6 Physical and chemical analysis of 1∶1 mixed fermentation

表7 黃酒樣的感官評定Table 7 Sensory evaluation of Huangjiu samples

3 結論與討論

目前,酵母菌的混合發酵已成為改善酒類產品風味和開發新產品的重要研究方向[28-29]。一般認為非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵時,非釀酒酵母由于受到釀酒酵母代謝物的抑制作用和在厭氧低糖條件下對酒精的不耐受性,其數量會迅速下降[30]。雖然混菌發酵時非釀酒酵母后期數量很少,但在前期可以積累各種風味物質。本研究結果表明,當HY32與TRADY菌株按相同接種量接種時,發酵前期兩者菌數相當,后期HY32菌株受到抑制。

乙酸是黃酒中主要的酸類物質之一,是生成酯類的前驅物質。酸類含量過低,則酒味短淡、發苦,優質酒類酸含量均較高。酯類是黃酒中的重要香味成分,酵母菌主要通過酯酶合成途徑將醇和酸轉化為酯。HY32與TRADY混合發酵黃酒樣的乙酸乙酯和乙酸含量分別比單一釀酒酵母提高了2.46和1.31倍,這可能是由于馬克斯克魯維酵母的產乙酸能力高于釀酒酵母所導致的。混合發酵不僅提高了發酵液的酸類、酯類、醛類含量,降低了高級醇含量,同時還產生了己酸乙酯和2,3-丁二醇這2種新的風味物質。己酸乙酯是一種具有菠蘿香型香氣的風味成分,是濃香型白酒的主體香氣之一；2,3-丁二醇在酒類中主要起緩沖作用,使酒增加綿甜、回味和醇厚感,因此混合發酵有效改善了黃酒的質量和風味。經感官評定,混合發酵酒樣醇香濃郁,口感柔和,成分協調,具有黃酒應有的風格。

本研究表明發酵溫度對馬克斯克魯維酵母發酵特性具有明顯影響。本研究曾測定過發酵結束后2種不同發酵溫度下酒樣的殘糖量,發現28 ℃發酵比37 ℃發酵酒樣的殘糖量要高,因此推測馬克斯克魯維酵母在較低溫度下產乙醇能力下降可能是由于其乙醇脫氫酶等與乙醇生成有關的酶活力下降導致的。馬克斯克魯維酵母在較低的溫度下產酒精能力顯著下降,同時產酸能力顯著提高,可以利用這一特點釀造低醇酒類。高級醇是黃酒的重要風味物質成分,能夠賦予黃酒酒體特殊的香氣,但高級醇含量過高時會造成“上頭”、“宿醉”等作用。因此,適度降低黃酒中高級醇的含量具有重要價值[31]。本研究還發現馬克斯克魯維酵母在較低溫度下發酵黃酒產異戊醇等高級醇的能力顯著降低,為了控制黃酒中高級醇的含量,發酵過程中應選擇較低的發酵溫度。