貝類多糖研究進展

劉志芳,趙前程,劉志東,段蕊,林娜,張俊杰

1(江蘇海洋大學 食品科學與工程學院,江蘇 連云港,222005)2(大連海洋大學 食品科學與工程學院,遼寧 大連,116023)3(中國水產科學研究院東海水產研究所,農業農村部遠洋與極地漁業創新重點實驗室,上海,200090)

貝類屬軟體動物門,全球現有貝類品種11萬種以上,是動物界中僅次于節肢動物的第二大門類[1]。貝類分布廣泛,根據生活環境的不同,可以分為海水貝類、淡水貝類和陸生貝類,又以海水貝類居多,約占海水養殖總產量的80%。目前,我國已經成為全球最大的海水貝類養殖國,2019年,我國貝類產量達1 500萬t[2]。我國現有海水養殖貝類約30多種,達到規模化生產水平的貝類主要有牡蠣、蛤、扇貝、蟶和貽貝等。

豐富的貝類品種,巨大的生物資源量為開發貝類生物活性物質提供了良好的原料基礎。貝類種屬、習性及生存環境的差異導致了貝類多糖組成及結構的復雜性,促成了貝類多糖生物活性和功能特性的獨特性和多樣性[3]。貝類多糖具有抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫調節、延緩衰老等生物活性,以及降血壓、降血糖、降血脂、溶血栓、緩解動脈硬化、降低肝臟損傷等藥理作用。這些功效決定了貝類多糖可以成為功能性食品、特膳食品和創新藥物的良好來源,具有廣闊的開發利用前景。

本文綜述了貝類多糖的制備、分離純化、結構解析、生物活性和功能特性的研究進展,總結歸納了制備方法、結構及活性三者間的關系,以期為貝類多糖的開發利用提供參考。

1 貝類多糖的制備

常用制備方法主要有水提法、堿提法、酶解法和鹽提法及超聲波輔助提取法等,如表1所示。提取方法不同,貝類多糖的組成、結構、活性及應用等也不盡相同。貝類多糖的含量、得率等受原料的屬性、采收時間、組織部位、儲藏方式及預處理方法等因素影響。雄性鮑魚內臟中所含的還原糖較雌性高；不同養殖場中縊蟶游離總糖含量差別較大,最大含量差約為40%,且隨季節變化程度大[4-5]。冷凍和冷藏均會降低貝類多糖提取率,冷藏影響更大,扇貝裙邊及柱中多糖提取率存在差異[6]。原料的生熟則會影響紫貽貝肉多糖含量,熟貝肉較生貝肉制得的多糖提取率高[7]。

表1 貝類多糖提取方式的對比Table 1 Different extraction methods of shellfish polysaccharides

1.1 水提取法

水提法即以水為溶劑進行提取,包括冷水、熱水提取法,條件簡單、溫和,成本低,無試劑殘留,但多糖提取率明顯低于其他方法,且花費時間長,與多糖相連的多肽鏈不易去除,適用于多糖含量高的組織提取。ADANE等[8]采用125.01 ℃的亞臨界水提取牡蠣凍干粉中多糖,得率為18.66%,較常溫水提牡蠣脫脂粉多糖得率高出2.56%[9]。

1.2 中性鹽提取法

中性鹽提取即以氯化鈉、醋酸鈉、磷酸鹽等為溶劑進行提取,該方法較溫和,但會破壞多糖的硫酸基團,含硫酸基團的多糖生物活性較中性多糖強,因此中性鹽提取法不適用于含硫酸基團的多糖的制備。陳駿洪[10]采用中性鹽提取法提取縊蟶粉多糖,結果表明在80 ℃、料液比1∶90(g∶mL)、提取2 h時,多糖得率最高,為1.43%。

1.3 堿提取法

堿提法主要通過堿溶液(主要是NaOH、KOH等)破壞糖與蛋白間的酯鍵,促進多糖溶于溶液,但也會對多糖的糖苷鍵造成一定破壞。QIN等[11]重復了不同實驗中水提、KOH提取及酶解制備牡蠣多糖的最優條件,最終確定KOH提取時上清液中多糖含量最高。研究發現,多糖在強堿作用下易水解,堿提法在提取多糖后一般需要透析數天以清除鹽殘留,若操作不當,多糖易被分解,可采用膜分離技術有效脫除小分子雜質。研究發現,二價陽離子(Ca2+、Mg2+)對硫酸多糖有聚集作用,比一價陽離子(Na+、K+)影響大。因此,堿提法應該選取具有低價鍵的陽離子以防止硫酸多糖變性[12]。

1.4 酶解法

酶解法主要利用蛋白酶切斷蛋白肽鍵使得多糖溶出,不破壞多糖結構,提取效率高,能夠有效去除與多糖相連的肽鏈,實現脫蛋白。目前應用于貝類多糖制備的蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶及枯草桿菌蛋白酶等。不同酶切割位點各不相同,部分可能重合,因此,多種酶同時使用時要考慮其是否具有更高的效率。劉志昌[6]通過響應面優化實驗發現加酶量僅為鮮重的0.3%時酶解率即達到最高值,其他條件為料液比1∶3(g∶mL),時間5 h,提取率為7.49%,水提法提取率最高為4.22%,酶解制備多糖較水提法得率高出0.77倍,且耗時短,酶解所需溫度低于水提。YUAN等[13]采用酶解法和水提法提取縊蟶多糖,在可見光及紫外可見光成像中可以明顯觀察到酶解制得的多糖量更多,在最佳條件下提取率最高可達到17.72%。

1.5 超聲波輔助提取法

研究表明,超聲波對組織結構的破壞是無差別的,超聲波輔助提取法能夠有效促進組織分離,加速多糖溶出,同時也會對多糖內部結構造成破壞,一般作為輔助提取方法使用。超聲波輔助提取法制備多糖的得率較單獨水提或酶解高,孫萍萍等[14]利用響應面優化法優化縊蟶的制取,發現超聲波輔助提取法能夠提高水提和酶解法的多糖提取率,多出約1 mg/g。

1.6 其他

此外,多糖的制備還有其他方法,微波輔助提取法會破壞多糖結構；超臨界流體萃取法成本較其他方法高,但效率高、試劑殘留少；H2O2輔助提取法適用于寡糖的制備[15]。

采用酶解法制備貝類多糖得率大于堿提,水提、酸提法得率次之,多種方法疊加或多種酶復合進行提取得率普遍較單一方法高。多種方法制取河蚌多糖時,酶解制多糖得率最高,其次是堿提,水提多糖得率最低,電場輔助酶解能夠使其得率提高約1%[16]。堿提法制得的紫貽貝多糖得率最高,其次是水提法,酸提法得率遠遠低于其他2種方法[17]。

2 貝類多糖的脫蛋白

多糖脫蛋白的常用方法有Sevage法、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)法、鹽酸法、酶解法、葡萄糖酸-δ-內酯(glucono-delta-lactone,GDL)法。酶解法多用于脫除蛋白含量高的多糖中蛋白。

Sevage法作用條件溫和,但去除與多糖相連蛋白的效果差,需要重復數次,試劑毒性大,不利于操作及試劑的脫除[18]。

TCA法脫蛋白效果好且多糖損失率較Sevage法低,但高濃度、長時間處理會破壞多糖結構,試劑難以及時脫除,在使用酸法脫蛋白時要綜合考慮溶液與酸接觸時間,較Sevage法更適用于貝類多糖脫蛋白[19]。

GDL法脫蛋白率高,無毒,經濟,耗時長。劉瑀等[20]比較了TCA法與GDL法用于蝦夷扇貝多糖脫蛋白的效果。結果表明,GDL法脫蛋白率達到了99.06%,較TCA法高10.41%,試劑用量少,更經濟,但需要加熱,TCA法脫蛋白試劑用量較前者用量高出3～20倍,無需加熱。

雙水相萃取法是利用2種互不相溶的溶質在特定濃度或溫度下形成不互溶富水相,以實現分離。CHEONG等[21]采用雙水相萃取法,以去除牡蠣多糖所含蛋白,該方法易操作、無毒、低成本,多糖與蛋白不能單獨存在于某一相中,單一溶質最多能夠提取67.02%的多糖,所得多糖分子量較低。

反復凍融法可以使含疏水基團的蛋白變性、沉降,多次冷凍有利于蛋白的脫除,多糖得率有所下降。XIONG等[22]實驗發現凍融法的蛋白脫除率與糖得率均高于Sevage法,處理不宜超過10次。

雙醛纖維素(DAC)通過與蛋白結合達到脫蛋白目的,磁性殼聚糖微球(MCM)、樹脂能夠吸附蛋白,其中DAC法效果優于Sevage法,吸附法綠色可回收[23-25]。

除Sevage法外,目前大部分方法可以在脫蛋白的同時脫色。

3 貝類多糖的結構

3.1 貝類多糖的結構解析方法及基本結構

貝類多糖的單糖組成、支鏈結構、特征基團、連接方式等存在顯著差異,如表2所示。

表2 貝類多糖的結構解析Table 2 Structural analysis of shellfish polysaccharides

結構決定性質,性質反映結構,開展貝類多糖結構的解析有利于探究其作用機理。貝類多糖主鏈中含有吡喃葡萄糖和甘露糖,其他單糖糖種類及含量不固定,主要含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖,及多種糖胺、糖醛酸,支鏈結構多樣,支鏈平均間隔6～7個主鏈單糖。LIU等[3]分析了5種貝類所含糖醛酸,結果表明甘露糖醛酸與其他3種非甘露糖醛酸具有組織及物種特異性,僅存在于部分貝類中,貝類所含糖醛酸種類與親緣關系相關。曹九零[37]分析了20種海洋貝類多糖,結果表明其中性及硫酸多糖含量與種屬間無顯著關系。由于目前多糖研究涉及的貝類種類較少,結構解析尚缺乏種間、活性間的相關分析,也無法針對貝類多糖的結構與種間關系進行系統性分析。已有信息表明,淡水螺較海水螺單糖組成簡單,雙殼貝類較單殼貝類支鏈組成更為復雜。

3.2 影響貝類多糖結構的因素

冷水提和熱水提較酶解獲得的多糖單糖組成簡單,高溫、萃取劑、堿會破壞多糖結構降低其分子質量。酶解獲得的紫貽貝多糖MT0-A1單糖組成較復雜,含有α-D-GalNAcp、β-D-GlcNAcp、α-D-Manp、α-D-Galp、α-L-Fucp等,其中主鏈部分主要由→2)Galp-(1→,→3)Manp-(1→,→3)Galp-(1→組成,側鏈部分主要由Manp-(1→,Fucp-(1→組成,冷水提取的多糖LTS1-A在所有提取所得多糖中含糖量最高,高達79.4%,單糖組成最簡單,僅主要由Glc單糖構成。另外一種冷水提多糖由多種單糖組成,但該多糖所占比例較小,熱水提所得的多糖單糖組成較單一,主鏈主要是(1→4)-α-D-Glcp,主鏈單糖∶支鏈=6∶1,支鏈由不同鍵連接的葡聚糖構成[7]。因此,酶解法制得的多糖較水提法制得的多糖單糖組成更全面,結構更為完整,更具研究價值。

亞臨界水提取牡蠣多糖(CGPs)的平均分子質量為108 kDa,低于熱水萃取法,高于雙水相萃取法,后兩者所得多糖平均分子質量分別為6 500 kDa、3.48 kDa,其活性各有特點[7]。高蒙蒙[9]采用常溫、熱水、堿提取的牡蠣多糖其分子量、糖及蛋白含量各不相同,分子質量分別為2 100、2 000、980 kDa,其中堿提法制得多糖蛋白含量最高(47.7%)。在制備高純度、結構完整的多糖時不建議采用雙水相萃取法、堿提法。

4 貝類多糖的生物活性

4.1 貝類多糖的主要生物活性

由表3可知，貝類多糖普遍具有抗氧化、抗紅細胞溶血的活性,部分具有抑菌、提高免疫細胞活性、抑制癌細胞生長的活性,對多種急慢性疾病具有顯著療效,能夠抗疲勞、降三高、護肝、溶解血栓、延緩衰老,某些貝類多糖還具有抗流感病毒、HIV、HSV、HBsAg的能力。貝類多糖生物活性多樣,無毒副作用,部分活性強的多糖可以藥用,以減少機體損傷。

表3 貝類多糖的生物活性Table 3 Biological activities of shellfish polysaccharides

研究表明,多糖具有保濕、美白、修復受損皮膚等功效,安全性高,特別是來源于動物的透明質酸(酸性黏多糖)保濕效果更佳,能夠有效阻隔紫外線、細菌侵襲,并滲入皮膚細微改變皮膚狀態。現有的多糖口服液多以植物原料為主,水產品中海參多糖口服液具有保健滋補功效,可知貝類多糖產品仍具有廣闊應用前景。企鵝珍珠貝、馬氏珠母貝多糖具有一定的保濕能力,但效果弱于牡蠣、翡翠貽貝多糖,可以用于以保濕為目的的化妝品原料,其他功能方面仍有待研究[29]。貝類多糖活性多樣、來源廣泛、效果顯著,對其功能的深入研究將有利于化妝品、特膳食品、醫藥等的研發。

4.2 影響貝類多糖生物活性的因素

4.2.1 原料及制備方法

貝類的組織部位及制備方法等均會影響多糖種類及結構,進而影響其生物活性及穩定性。酶解制得的多糖結構更為完整,更有利于結構解析及活性的保持,酸性環境不利于貝類多糖維持其活性,高溫會造成貝類多糖活性的損失。劉志昌[6]提取的扇貝裙邊多糖與扇貝柱多糖相比,清除自由基、超氧陰離子、亞硫酸根能力及鐵還原能力更高,酶解法較水提法制得的多糖活性高。程仕偉等[17]研究了采用不同方法制備的紫貽貝多糖的抗氧化活性,水提和堿提法制備的多糖·OH、超氧陰離子、亞硝酸根清除能力較酸提多糖強。此外,不同干燥方式也會影響貝類多糖的生物活性,如真空冷凍干燥處理,多糖的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、·OH清除能力強于真空干燥處理多糖,兩者自由基清除能力均強于熱風干燥處理多糖[54]。

4.2.2 多糖分子質量及組成

研究表明,分子質量不同的貝類多糖生物活性存在差異,具有抗氧化活性的貝類多糖多以α-吡喃葡聚糖為主要成分,糖蛋白具有抗腫瘤的生物活性。YANG等[54]研究發現,褶紋冠蚌分子質量大于30 kDa的糖蛋白對小鼠S180肉瘤、EAC腹水瘤抑制效果明顯且無毒害作用,小于30 kDa的多糖基本無抑制作用。ZHONG等[55]將低分子質量的牡蠣多糖LMW-OPS(主要成分為α-D-葡萄糖醛酸,分子質量為1 980～2 630 Da)注射到小鼠腹腔,能夠抑制其體內的CMT93和CT26腫瘤細胞生長,但并不直接抑制2種細胞的增殖,而是通過緩解腫瘤細胞對骨髓源性樹突細胞功能的抑制作用,激發樹突狀細胞活性,增強其免疫調節活性,進而起到抗腫瘤作用。SHI[38]等研究發現牡蠣多糖CGPS-1(分子質量約為6.50×106Da的葡萄糖聚合物)能夠降低AST、ALT、MDA含量,提高SOD活性,進而改善肝損傷。雷曉凌等[56]對酶解獲得的糖胺聚糖SG1(含氮2.7%)進行體外抗HL260細胞實驗,結果表明,不同劑量SG1對HL260細胞均有抑制作用,且抑制作用隨著用量的增加而增強,脫蛋白的縊蟶多糖具有多種抗氧化活性,暫時還沒有關于高純度縊蟶多糖免疫及抗腫瘤活性的報道。

4.2.3 改性

為了獲得目標生物活性或功能特性更強的多糖,研究人員開展了多糖的改性研究。目前,貝類多糖的改性主要以硫酸化為主,能夠顯著增強其免疫活性,賦予其抑制癌細胞增殖的活性。TAWUT等[57]將硫酸化的紫貽貝多糖SP作用于野生貽貝,探究其免疫應答效應,實驗發現SP會增加貽貝血細胞活性,溶菌酶活性也有所提高。硫酸酯化后的青蛤多糖對人胃癌細胞增殖具有顯著抑制作用[58]。硫酸酯化的牡蠣多糖CT-S2具有增強凝血效果的作用,并且對HCT-116、HL-60、A-549細胞也具有抑制作用[9]。牡蠣C6取代的硫酸化多糖SOG較C2和C3取代的SOG1刺激淋巴細胞增殖的效果更明顯,因此,取代基團的位置也會影響改性多糖的活性[59]。

5 結語

本文綜述了貝類多糖的制備、分離純化方法、結構特征、生物活性和功能特性,分析了影響貝類多糖組成、結構及活性的內在和外在因素,探究了貝類多糖的構效關系,探討了其在化妝品、保健品和醫藥領域的應用,期望能夠為貝類多糖的深度利用提供基礎信息。未來,不同種類的貝類多糖、結構、功能及機理研究還有待深入和拓展,期望本文能夠為貝類多糖的深度開發利用提供參考。