以巧克力為載體的益生菌膳食補(bǔ)充劑的開發(fā)

馬申嫣,王晶,趙巖,曹江,翟齊嘯,張灝,趙建新,田豐偉,陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

低聚半乳糖是一類重要的膳食益生元,作為腸道有益菌的發(fā)酵底物,可以抑制有害菌增殖,促進(jìn)腸道內(nèi)乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的生長繁殖,使有益菌處于優(yōu)勢狀態(tài)[1]。膳食補(bǔ)充低聚半乳糖已被證明可以排除體內(nèi)毒素,減輕肝臟負(fù)擔(dān),提高機(jī)體免疫力,從而緩解重金屬鉛對機(jī)體的損害[2]。張家超等的研究發(fā)現(xiàn)小鼠攝入植物乳桿菌的同時(shí)外源補(bǔ)充低聚半乳糖可以減少益生菌導(dǎo)致的腸道菌群適應(yīng)性突變,從而改善腸道菌群的整體穩(wěn)定性[3]。因此,益生元和益生菌的聯(lián)用可能更有利于維護(hù)宿主健康[4]。在前期實(shí)驗(yàn)中,江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心篩選到的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM8661已被證明可有效降低機(jī)體鉛蓄積并緩解鉛暴露造成的氧化應(yīng)激損傷,對機(jī)體具有較好的保護(hù)效果[5-6]。然而,L.plantarumCCFM8661和低聚半乳糖復(fù)配的膳食補(bǔ)充劑的開發(fā)仍存在空白。

目前,市場上的益生菌膳食補(bǔ)充劑形式主要為粉劑、片劑和膠囊等,產(chǎn)品種類單一,且在經(jīng)胃腸等消化系統(tǒng)后益生菌存活率低,功效減弱[7-8]。因此,益生菌膳食補(bǔ)充劑的活菌數(shù)與儲藏時(shí)間及成分之間的相互作用是其發(fā)揮益生功效的關(guān)鍵,也是膳食補(bǔ)充劑產(chǎn)品品質(zhì)的重要評價(jià)指標(biāo)[9]。研究表明巧克力的水分含量低、油脂含量高,可以使菌體在長時(shí)間的保存后仍能保持其生物活性和功能特性,是益生菌膳食補(bǔ)充劑的優(yōu)良載體[10]。

綜上所述,本研究擬開發(fā)一種以巧克力作為載體復(fù)合L.plantarumCCFM8661和低聚半乳糖的緩解鉛毒性的膳食補(bǔ)充劑,探究巧克力制作過程中益生菌加入溫度、攪拌時(shí)間、結(jié)晶溫度、結(jié)晶時(shí)間以及回溫時(shí)間對巧克力品質(zhì)的影響，并對其儲藏特性進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可可液塊和可可脂,無錫上可食品有限公司；脫脂奶粉,內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；大豆卵磷脂,上海善優(yōu)生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基,中國國藥化學(xué)試劑公司；低聚半乳糖,百思特天驕優(yōu)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及制備

將L.plantarumCCFM8661的二級純化培養(yǎng)液以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)物經(jīng)離心(4 ℃、5 000×g)后去上清液,洗滌后,菌體沉淀用10%的脫脂乳重懸后冷凍干燥。凍干菌粉(活菌數(shù)1012CFU/g)保藏于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 以巧克力為載體的膳食補(bǔ)充劑的制作流程

以巧克力為載體的膳食補(bǔ)充劑由28%可可液塊、40%白砂糖、16%脫脂奶粉、15%可可脂和0.3%大豆卵磷脂組成(以上含量均為質(zhì)量百分比)[11]。將稱取的可可液塊及可可脂在40 ℃下熔化后[12],加入白砂糖、脫脂奶粉,混合均勻后制得巧克力漿,將巧克力勻漿置于60 ℃的環(huán)境下,精煉36 h[13]。在精煉結(jié)束前,將大豆卵磷脂加入其中,并繼續(xù)混合30 min。精煉結(jié)束后,在一定溫度下將L.plantarumCCFM8661凍干菌粉(108CFU/g巧克力)及低聚半乳糖(6 g/100 g巧克力)[14]加入到制備的樣品中,攪拌一定時(shí)間后,進(jìn)行3階段的調(diào)溫。第1階段,將物料冷卻至29 ℃；第2階段,從29 ℃冷卻至結(jié)晶溫度并結(jié)晶一定時(shí)間；第3階段,回溫至29～30 ℃[15]。澆注成型后置于8 ℃下冷卻25 min,脫模,包裝后儲存。

1.2.3 以巧克力為載體的膳食補(bǔ)充劑的工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)

按照1.2.2小節(jié)的方法制作巧克力,設(shè)置精煉結(jié)束后,設(shè)置益生菌接種溫度為32、35、37和40 ℃,攪拌時(shí)間為2.5、5、10和15 min,結(jié)晶溫度22、24、26、28和30 ℃,結(jié)晶時(shí)間10、15、20、25和30 min,回溫時(shí)間5、10、15、20和25 min,測定巧克力中的活菌數(shù)、水分含量及水分活度。

1.2.3.2 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)(表1和表2),并測定各組巧克力中的活菌數(shù)、水分活度以及水分含量,以確定最佳的工藝優(yōu)化方案。

表1 正交試驗(yàn)因素表Table 1 Orthogonal experiment factors and levels

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Orthogonal experiment design

1.2.4 巧克力中活菌數(shù)、水分活度和水分含量的測定方法

活菌數(shù)：稱取20 g巧克力,與180 mL蛋白胨水溶液(0.1%)混合。混合物熔化后(40 ℃,15 min),振蕩均勻進(jìn)行平板計(jì)數(shù)[16];水分活度：參考KONAR等[17]的方法;水分含量：使用水分含量儀測定。均為1式3份測量。

1.2.5 以巧克力為載體的膳食補(bǔ)充劑儲藏期的特性研究

根據(jù)正交試驗(yàn)確定的最佳工藝條件,重新制作以巧克力為載體的膳食補(bǔ)充劑,在-20、4和25 ℃的條件下儲存,并在第0、30、60和90天時(shí)測定巧克力及復(fù)配菌粉對照的活菌數(shù),評價(jià)其對模擬胃腸液的耐受能力。

1.2.6 儲藏期巧克力中活菌數(shù)和模擬胃腸液的耐受能力的測定

活菌數(shù)：按照1.2.4小節(jié)的方法。模擬胃腸液的耐受能力：稱取4 g巧克力加入到300 mL模擬胃液(3 g胃蛋白酶/L無菌生理鹽水,pH 3.0)中溶解,取1 mL溶液活菌計(jì)數(shù),其余部分在37 ℃培養(yǎng)3 h；然后取1 mL溶液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),同時(shí)吸取9 mL溶液離心棄上清液,用9 mL模擬腸液(1 g/L胰蛋白酶和3 g/L膽鹽)重懸,37 ℃培養(yǎng)4 h,耐受腸液結(jié)束后取1 mL活菌計(jì)數(shù),并計(jì)算菌體存活率[18]。

1.2.7 巧克力的感官評定方法

參考DESHPANDE等[19]的感官評定方法。評定在相對安靜衛(wèi)生的獨(dú)立空間內(nèi)進(jìn)行,評定小組人數(shù)為8人,評分標(biāo)準(zhǔn)如表3所示。評分以8個(gè)人評分的平均值表示。

表3 巧克力感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Standard for sensory evaluation of chocolate

1.2.8 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)合GraphPad Prism 6作圖,所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少3次平行重復(fù),通過單因素方差分析(ANOVA)和Duncan事后檢驗(yàn)進(jìn)行分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 益生菌接種溫度的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,接種溫度略有提高利于保持益生菌的存活率,但溫度過高會使益生菌存活率下降(圖1-a)。37 ℃時(shí),巧克力樣品中的活菌數(shù)最高,且水分活度及水分含量顯著最低(圖1-b和圖1-c)。因此,最佳接種溫度選擇為37 ℃。

a-巧克力中的活菌數(shù)；b-巧克力的水分活度；c-巧克力的水分含量圖1 益生菌接種溫度對巧克力中活菌數(shù)、水分活度和水分含量的影響Fig.1 Effects of inoculation temperature on viable count,water activity and moisture content in chocolate注:柱形圖上的a～c表示不同組之間的顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.1.2 攪拌時(shí)間的影響

如圖2所示,隨著攪拌時(shí)間增加,巧克力中的活菌數(shù)先上升后下降,而水分含量與水分活度則表現(xiàn)出相反的趨勢。較于其他攪拌時(shí)間,攪拌10 min時(shí),巧克力中的活菌數(shù)顯著提高,且樣品中水分活度和水分含量顯著降低,因此最佳攪拌時(shí)間確定為10 min。

a-巧克力中的活菌數(shù)；b-巧克力的水分活度；c-巧克力的水分含量圖2 攪拌時(shí)間對巧克力中的活菌數(shù)、水分活度和水分含量的影響Fig.2 Effects of stirring time on viable count,water activity and moisture content in chocolate

2.1.3 結(jié)晶溫度的影響

如圖3所示,當(dāng)結(jié)晶溫度為26 ℃時(shí),活菌數(shù)最高(1.58×1010CFU/g)。此外,隨著結(jié)晶溫度升高,巧克力漿形成大量結(jié)晶,水分活度和水分含量下降。因此,結(jié)晶溫度定為26 ℃。

a-巧克力中的活菌數(shù)；b-巧克力的水分活度；c-巧克力的水分含量圖3 結(jié)晶溫度對巧克力中的活菌數(shù)、水分活度和水分含量的影響Fig.3 Effects of crystallization temperature on viable count,water activity and moisture content in chocolate

2.1.4 結(jié)晶時(shí)間的影響

如圖4所示,隨著結(jié)晶時(shí)間的增加,巧克力的水分活度和水分含量表現(xiàn)出先下降后升高的趨勢。因此,結(jié)晶時(shí)間確定為20 min。

a-巧克力中的活菌數(shù)；b-巧克力的水分活度；c-巧克力的水分含量圖4 結(jié)晶時(shí)間對巧克力中的活菌數(shù)、水分活度和水分含量的影響Fig.4 Effects of crystallization time on viable count,water activity and moisture content in chocolate

2.1.5 回溫時(shí)間的影響

如圖5所示,回溫10 min時(shí)巧克力樣品的活菌數(shù)最高,并伴隨著最低水平的水分活度和水分含量。因此,回溫時(shí)間應(yīng)挑選10 min最為適宜。

a-巧克力中的活菌數(shù)；b-巧克力的水分活度；c-巧克力的水分含量圖5 回溫時(shí)間對巧克力中的活菌數(shù)、水分活度和水分含量的影響Fig.5 Effects of rewarming time on viable count,water activity and moisture content in chocolate

2.2 正交試驗(yàn)

在9個(gè)正交實(shí)驗(yàn)組中,第2組和第9組的巧克力樣品的活菌數(shù)較高,其中第2組最高。水分活度較低組為第1組、第2組和第9組巧克力樣品,其中第2組最低。同時(shí)第2組、第5組、第7組和第9組的水分含量最低(圖6)。綜合以上研究結(jié)果,并把巧克力的活菌數(shù)和水分活度作為主要評價(jià)指標(biāo),第2組巧克力品質(zhì)為最佳條件,即巧克力制作過程中在35 ℃接入L.plantarumCCFM8661和低聚半乳糖,攪拌10 min,26 ℃下結(jié)晶,最后回溫10 min。

a-巧克力中的活菌數(shù)；b-巧克力的水分活度；c-巧克力的水分含量圖6 不同正交實(shí)驗(yàn)組巧克力中的活菌數(shù)、水分活度和水分含量Fig.6 Viable count,water activity and moisture content of chocolate in different orthogonal experimental groups

2.3 以巧克力為載體的益生菌膳食補(bǔ)充劑的儲藏特性

2.3.1 儲存期間巧克力活菌數(shù)的變化

如圖7所示,儲存時(shí)間和溫度的上升均會導(dǎo)致巧克力產(chǎn)品中活菌數(shù)下降。此外當(dāng)儲藏溫度和時(shí)間一致時(shí),巧克力產(chǎn)品中的活菌數(shù)顯著高于菌粉對照組。這表明巧克力包裹可以明顯提高益生菌在儲藏期間的活菌數(shù),并且儲藏溫度越低,時(shí)間越短活菌數(shù)越高。

圖7 儲藏期間巧克力中L.plantarum CCFM8661活菌數(shù)的變化Fig.7 Changes of viable counts of L.plantarum CCFM8661 in chocolate during storage

2.3.2 儲存期間巧克力益生菌對模擬胃腸液的耐受能力

模擬胃腸液中培養(yǎng)7 h后,以巧克力為載體的膳食補(bǔ)充劑中的活菌數(shù)明顯高于菌粉(表4)。巧克力作為載體可以保護(hù)益生菌在經(jīng)過模擬胃液和腸液后仍保持較高存活率[20-21]。

表4 巧克力及菌粉中益生菌對模擬胃腸液的耐受能力Table 4 Tolerance of probiotics to simulated gastrointestinal fluids in chocolate and powder

2.3.3 巧克力的感官評價(jià)

感官評價(jià)結(jié)果表明包埋益生菌復(fù)合膳食補(bǔ)充劑對巧克力的形態(tài)、雜質(zhì)色香味以及組織形態(tài)并無顯著影響(表5)。這可能是由于益生菌被巧克力均勻包裹后,菌體處于休眠狀態(tài)。此外,感官結(jié)果顯示,添加低聚半乳糖不會影響巧克力的感官品質(zhì),與前人的結(jié)論一致[22]。

表5 巧克力的感官評定Table 5 The sensory evaluation of the chocolate

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探究以巧克力作為載體的復(fù)合L.plantarumCCFM8661和低聚半乳糖膳食補(bǔ)充劑的最佳工藝條件。研究發(fā)現(xiàn),以巧克力為載體的復(fù)合膳食補(bǔ)充劑制作的最佳工藝條件為益生菌加入溫度35 ℃、攪拌時(shí)間10 min,結(jié)晶溫度26 ℃,回溫時(shí)間10 min。與復(fù)配菌粉相比,以巧克力為載體的復(fù)合膳食補(bǔ)充劑的貨架期更長,其最佳儲藏溫度為-20 ℃。同時(shí),巧克力包埋的益生菌比未包埋的益生菌具有更強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力,且包埋益生菌膳食補(bǔ)充劑并不會影響巧克力的感官品質(zhì)。