超聲波輔助堿法提取美藤果分離蛋白及其加工性質研究

李云嵌,楊曦,劉江,吳娟,王振興,張雪春

(西南林業大學 生命科學學院,云南 昆明,650224)

美藤果(Plukenetiavolubilis),又名印加果、南美油藤、星油藤等,是一種原產于南美的大戟科多年生藤本油料植物[1],近年來在我國云南、貴州等地大量種植。美藤果仁中含有約30%的蛋白質,含量僅次于大豆,其必需氨基酸含量高達10.6%,且含有所有人體必需氨基酸,是一種優質的植物蛋白資源[1-3]。美藤果榨油后的果餅中蛋白質含量較高,但果餅大多作為動物飼料和肥料,造成美藤果資源的極大浪費。目前,美藤果蛋白常用的提取方法有堿溶酸沉法、酶法除雜濃縮法、反膠束法、水提法等[4],其中堿溶酸沉法因操作簡單、成本低等優點得到廣泛應用,但單一采用該方法往往提取率較低,故結合酶或超聲波輔助提取可提高美藤果蛋白的提取率。

超聲波輔助提取技術是一種綠色分離提取新技術,相比堿法等傳統的蛋白質提取方法而言，具有提取率高、時間短、溶劑消耗量小、成本低等優點[5],目前超聲波已被廣泛應用到蛋白質的提取制備中[3,6-9]。本文從脫脂美藤果餅中提取分離蛋白,并研究其加工性質,為美藤果資源的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂美藤果餅,西雙版納印奇生物資源開發有限公司提供,經粉碎,過60目篩后備用；牛血清白蛋白,上海伯奧生物科技有限公司；福林酚試劑、NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、鹽酸、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB]、三羥甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane,Tris]、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)等,均為分析純。

5804R多功能臺式高速冷凍離心機,Eppendorf中國有限公司；XMTD-7000電熱恒溫水浴鍋,北京市永光明醫療有限公司；UB-7 pH計,丹佛儀器(北京)有限公司；F50酶標儀,帝肯(上海)貿易有限公司；SB25-12DTDS超聲波清洗機,寧波新藝超聲設備有限公司；UV-1000紫外可見分光光度計,北京萊伯泰科儀器；FJ200-SH型數顯高速分散均質機,上海標本模型廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 超聲波輔助提取美藤果分離蛋白

取脫脂美藤果餅40 g,按液料比17∶1 (mL∶g)加入0.14 mol/L NaCl溶液混勻,再以2 mol/L NaOH溶液調pH至10,于43 ℃、220 W超聲處理16 min,離心(4 000 r/min,20 min),取上清液用2 mol/L HCl溶液調pH至4.9,在同樣條件下離心,沉淀以1∶3(g∶mL)的比例使用去離子水水洗2遍,凍干得美藤果分離蛋白備用[10]。按公式(1)計算美藤果分離蛋白得率：

(1)

式中：m1,美藤果分離蛋白質量,g；m0,脫脂美藤果餅質量,g。

1.2.2 單因素試驗

在超聲波輔助提取美藤果分離蛋白工藝試驗中,固定提取pH條件為10,對4個因素：超聲溫度、超聲時間、超聲功率、液料比分別進行單因素試驗,考察各因素對美藤果分離蛋白得率的影響。

1.2.3 響應面試驗

在單因素試驗基礎上,運用Design-Expert 8.0.6軟件,依據Box-Behnken設計原理,以Y(美藤果分離蛋白得率)為響應值,選取A(超聲時間)、B(超聲功率)、C(超聲溫度)、D(液料比)為自變量,設計響應面優化試驗,試驗因素水平表見表1。

表1 試驗因素水平表Table 1 Test factors and levels

1.2.4 美藤果蛋白組分的分離和理化性質測定

采用Osborne分離法[11]從脫脂美藤果餅中提取分離得到美藤果清蛋白和球蛋白,按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》、GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》、GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》分別測定美藤果分離蛋白、清蛋白和球蛋白的水分、粗脂肪和粗蛋白含量。

1.2.5 等電點的測定

取脫脂美藤果餅40 g,按液料比17∶1 (mL∶g)加入0.14 mol/L NaCl溶液混勻,以2 mol/L NaOH溶液調pH至10,于43 ℃、220 W超聲處理16 min,離心(4 000 r/min,20 min)后取等量上清液,用2 mol/L HCl溶液分別將pH調至4.4、4.6、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2,在同樣條件下離心,取上清液適度稀釋后用福林酚法[12]測定其蛋白質量濃度,繪制蛋白質量濃度與pH的關系曲線,曲線中蛋白質量濃度最低點對應的pH即為樣品的等電點[13]。

1.2.6 溶解性的測定

取0.4 g凍干蛋白樣品分散于40 mL 50 mmol/L pH 7的磷酸鈉緩沖液中,并分別用2 mol/L的NaOH溶液和HCl溶液調pH為2～12,室溫攪拌30 min后,于8 000 r/min離心15 min,采用福林酚法[12]測定上清液中蛋白質含量,采用凱氏定氮法測定樣品中蛋白質含量[14]。按公式(2)計算蛋白溶解性：

(2)

1.2.7 起泡性和起泡穩定性的測定

取蛋白樣品,以50 mmol/L pH 7磷酸鹽緩沖液配制體積分數為1%的溶液,分別用2 mol/L的NaOH溶液和HCl溶液調pH至2、7、10,攪拌30 min后,取20 mL于15 000 r/min均質分散1 min,測定0和60 min的泡沫體積[15]。按公式(3)和(4)計算起泡性和起泡穩定性：

(3)

(4)

式中：V1,0 min量筒中樣品體積,mL；V2,60 min量筒中樣品體積,mL。

1.2.8 乳化性及乳化穩定性的測定

取蛋白樣品,以10 mmol/L pH 7磷酸鹽緩沖液配制體積分數為1%溶液,分別用2 mol/L的NaOH溶液和HCl溶液調pH為2、7、10,攪拌30 min后,與5 mL大豆油混合,于15 000 r/min均質分散1 min制成乳狀液,立即從底部吸取100 μL乳狀液與15 mL質量分數為0.1%的SDS溶液混合,搖勻后于500 nm處測定吸光值A0,10 min后測定吸光值A10[16]。按公式(5)和式(6)計算乳化性和乳化穩定性：

(5)

(6)

式中：N,乳液稀釋倍數；A0,0 min時的吸光度；A10,10 min時的吸光度；φ,油相比例；C,初始蛋白質量濃度,g/mL；θ,油相體積分數,0.25。

1.2.9 巰基含量的測定

取蛋白樣品分別溶解于緩沖液A(10.4 g Tris,6.9 g甘氨酸,1.2 g EDTA,加水定容至1 000 mL,pH 8)和緩沖液B(96 g尿素溶于緩沖液A中,加水定容至200 mL,pH=8)中配成1 mg/mL溶液,以3 000 r/min離心15 min,取5 mL上清液與0.05 mL Ellman試劑(0.2 g DTNB溶于50 mL緩沖液A中)反應15 min,于412 nm測定吸光度值,其中緩沖液A用于游離巰基的測定,緩沖液B用于總巰基的測定[17]。按公式(7)計算游離巰基和總巰基含量：

(7)

式中：A,吸光度；D,稀釋倍數；C,蛋白質量濃度,mg/mL；V,所取蛋白溶液的體積,mL；13 600,黃色物質DTNB在pH 8情況下的摩爾消光系數,mol/(L·cm)。

1.2.10 數據統計分析

所有試驗均進行3次平行試驗,采用Excel 2010、Origin 2018、Design-Expert 8.0.6、SPSS 25對數據進行處理、繪圖、方差分析、響應面分析和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 超聲溫度對美藤果分離蛋白得率的影響

如圖1所示,超聲溫度在25～45 ℃時,蛋白得率隨超聲溫度的升高而增大,45 ℃時達到最大,為20.65%,當超聲溫度繼續升高時,蛋白得率呈下降趨勢。

圖1 超聲溫度對美藤果分離蛋白得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on the yield of protein isolate from P.volubilis

說明適當地升溫有利于蛋白質的溶解,但溫度過高可能會破壞維持蛋白質空間構象的次級結構,引起其構象的解體和內部疏水基團的暴露,從而促進蛋白質分子間的相互結合,降低蛋白質的溶出率[18]。因此,選擇超聲溫度為45 ℃左右。

2.1.2 超聲時間對美藤果分離蛋白得率的影響

如圖2所示,超聲時間在0.5～15 min時,蛋白得率隨超聲時間的延長而增大,15 min時達到最大,為20.35%,當超聲時間繼續延長時,蛋白得率呈下降趨勢。原因可能是隨著超聲時間的延長,空化作用增大,此時細胞膜的通透性增強,細胞破碎程度也隨之增大,進而導致蛋白的溶出量增多；但當超聲時間過長時,細胞膜進一步破裂,雜質溶出量增多[19],此外,超聲時間過長會使液體溫度過高,導致蛋白質變性,從而降低蛋白質得率。因此,選擇超聲時間為15 min左右。

圖2 超聲時間對美藤果分離蛋白得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of protein isolate from P.volubilis

2.1.3 超聲功率對美藤果分離蛋白得率的影響

如圖3所示,超聲功率在100～200 W時,蛋白得率隨超聲功率的增大而增大,200 W時達到最大,為19.88%,當功率繼續增大時,蛋白得率呈下降趨勢。原因可能是隨著超聲功率的增大,超聲波的空化作用增強,細胞破碎程度增加,使更多的蛋白質溶解[20],但當超聲功率過大時,蛋白質變性形成沉淀,降低蛋白質得率。因此,選擇超聲功率為200 W左右。

圖3 超聲功率對美藤果分離蛋白得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of protein isolate from P.volubilis

2.1.4 液料比對美藤果分離蛋白得率的影響

如圖4所示,液料比在5∶1～40∶1 (mL∶g)時,蛋白得率隨液料比的增大而增大,其中液料比在5∶1～15∶1 (mL∶g)時,呈大幅度上升趨勢,在液料比為15∶1 (mL∶g)時,蛋白得率為15.99%；進一步增大液料比時,上升趨勢減緩。原因是隨著液料比的增大,溶液的黏度降低,分子擴散速度加快,溶解度升高,蛋白得率也隨之升高。但液料比過大不利于蛋白質提取后的廢液處理,造成蛋白質的濃度偏低,不利于蛋白質的回收,且成本過高[18]。因此,選擇液料比為15∶1 (mL∶g)左右。

圖4 液料比對美藤果分離蛋白得率的影響Fig.4 Effect of liquid to material ratio on the yield of protein isolate from P.volubilis

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗設計及結果

以美藤果分離蛋白得率為指標,選取A(超聲時間)、B(超聲功率)、C(超聲溫度)、D(液料比)為自變量,設計出響應面試驗設計方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案及結果Table 2 Response surface test design and results

續表2

2.2.2 模型的建立及顯著性分析

運用Design Expert 8.0.6軟件對美藤果分離蛋白得率試驗結果進行數據分析,得到二次多項式回歸方程為：Y=20.99-0.22A+0.88B-0.27C+1.84D+1.18AB+0.23AC-0.86AD-0.735BC+0.075BD-0.41CD-2.14A2-2.31B2-1.41C2-2.65D2。

回歸模型方差分析如表3所示,模型的P<0.000 1,說明模型極其顯著,失擬項不顯著(P=0.252 3>0.05),相關系數R2=0.904 5,因此,該方程可以較好地反映美藤果分離蛋白提取過程中各因素與響應值的關系并預測最佳提取條件。由P值可知,B、D影響顯著,交互項AB顯著,二次項均顯著,其余不顯著。由F值可知,4個因素對美藤果分離蛋白得率的影響順序為：D>B>C>A。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Regression model variance analysis

2.2.3 響應面分析

運用Design Expert 8.0.6軟件并分析響應面優化試驗結果,得到響應曲面圖。由圖5可知,所有的響應曲面圖均呈凸面,等高線圖呈圓形或橢圓形。根據兩因素交互作用的等高線呈橢圓形,說明交互作用極為顯著,各因素響應曲線的陡峭程度反映出該因素對美藤果分離蛋白得率的影響程度,越陡峭,說明影響越大,綜合分析可知：液料比對美藤果分離蛋白得率的影響最顯著,其次是超聲功率,超聲時間,最后是超聲溫度。

圖5 四個因素之間交互作用對美藤果分離蛋白得率影響的等高線圖及響應面圖Fig.5 Contour map and response surface graph of the interaction among four factors on the yield of protein isolate from P.volubilis

2.2.4 響應面驗證試驗

通過擬合得出最佳提取工藝參數為超聲時間16.47 min、超聲功率220.96 W、超聲溫度42.89 ℃、液料比16.9∶1 (mL∶g),該條件下美藤果分離蛋白的預計得率為21.47%,為了操作方便,實際取值超聲時間16 min、超聲功率220 W、超聲溫度43 ℃、液料比17∶1 (mL∶g),該條件下美藤果分離蛋白的得率為21.23%,與模型預測值相接近,說明該模型可用于超聲波輔助堿法提取美藤果分離蛋白的工藝條件優化。

2.3 美藤果分離蛋白等電點

如圖6所示,pH 4.9時溶液中美藤果分離蛋白質量濃度最低,此時蛋白質分子顆粒在溶液中沒有相同電荷的排斥,蛋白質分子顆粒極易碰撞、凝聚并產生沉淀,溶解度最小,因此pH 4.9為美藤果分離蛋白的等電點。

圖6 美藤果分離蛋白等電點Fig.6 Isoelectric point of protein isolated from P.volubilis

2.4 美藤果蛋白組分的基本理化指標

由表4可知,所提取的美藤果分離蛋白、清蛋白和球蛋白的水分和粗脂肪含量較低,而粗蛋白含量較高,其中美藤果分離蛋白的粗蛋白含量接近90%,其他雜質含量較少,可用于下一步的理化性質測定。

表4 美藤果餅及所提取蛋白組分的理化指標 單位：%

2.5 美藤果蛋白組分的溶解性

如圖7所示,隨著pH的增大,美藤果分離蛋白、清蛋白和球蛋白的溶解性均呈先降低后升高的變化趨勢,在等電點附近溶解性最低,其中美藤果分離蛋白的變化趨勢最明顯,呈“V”形,與亞麻籽分離蛋白[21]、核桃分離蛋白[22]等的溶解性曲線相似。美藤果分離蛋白在pH 2～3和pH 10～12范圍內具有較好的溶解性,其原因可能是分離蛋白在強酸和強堿條件下發生解離,溶出了更多的蛋白質,從而具有較好的溶解性[13]。相比采用堿溶酸沉法提取的美藤果分離蛋白[23],本文所提取的該蛋白具有較高的溶解性。

圖7 美藤果分離蛋白、清蛋白和球蛋白的溶解性Fig.7 Solubility of protein isolate,albumin and globulin from P.volubilis

2.6 美藤果蛋白組分的起泡性和起泡穩定性

蛋白質起泡性指蛋白質在一定條件下產生泡沫的量,起泡穩定性則指所形成泡沫的穩定性,起泡性是蛋糕、面包、冰淇淋等食品加工過程中的一項重要指標。如圖8-a可知,美藤果分離蛋白的起泡性在pH 10時最好,為51.11%,但總體上低于清蛋白,高于球蛋白；如圖8-b可知,美藤果分離蛋白的起泡穩定性在pH 10時最大,為71.52%,且均維持在65%以上；這是因為蛋白質的起泡性在很大程度上取決于它的溶解性,而pH的變化改變了蛋白質的荷電狀態,從而影響蛋白質的起泡性和泡沫穩定性[24]。

a-起泡性；b-起泡穩定性圖8 美藤果分離蛋白、清蛋白和球蛋白的起泡性和起泡穩定性Fig.8 Foaming and foaming stability of protein isolate,albumin and globulin from P.volubilis注：圖中小寫字母表示同一種蛋白在不同pH條件下的組內差異顯著(P<0.05),下同

2.7 美藤果蛋白組分的乳化性和乳化穩定性

乳化性和乳化穩定性是直接反應蛋白質乳化特性的重要指標。如圖9-a和9-b可知,美藤果分離蛋白的乳化性和乳化穩定性低于清蛋白,高于球蛋白,且在pH 10的條件下最大,分別為45.72 m2/g和29.29 min。蛋白質的乳化過程較復雜,受溶解性、分子質量和表面疏水性等多個因素的影響,美藤果分離蛋白在pH 10的條件下具有較高的溶解性,這可能是其具有較好乳化性和乳化穩定性的原因[18]。

a-乳化性；b-乳化穩定性圖9 美藤果分離蛋白、清蛋白和球蛋白的乳化性和乳化穩定性Fig.9 Emulsifying and emulsifying stability of protein isolate,albumin and globulin from P.volubilis

2.8 美藤果蛋白組分的巰基含量

蛋白質的巰基和二硫鍵含量是其分子構象中起穩定性的重要化學鍵,兩者之間的相互作用可使蛋白分子間發生凝聚等變化[25]。如圖10可知,美藤果分離蛋白的總巰基和游離巰基含量較高,分別為8.04和3.86 μmol/g。巰基和二硫鍵可由氧化還原反應相互轉化,二硫鍵具有鎖定作用,使蛋白質中的大部分疏水性氨基酸包裹在分子內部,導致蛋白質的表面活性較差[26-27]。因此,通過一些物理化學方法適度打開美藤果分離蛋白的二硫鍵可提高蛋白表面活性[27]。

圖10 美藤果分離蛋白、清蛋白和球蛋白的巰基含量Fig.10 The content of sulfhydryl group in protein isolate,albumin and globulin from P.volubilis注：圖中小寫字母表示巰基含量在不同蛋白之間的差異顯著(P<0.05)

3 結論

以脫脂美藤果餅為原料,采用超聲波輔助堿法提取美藤果分離蛋白,通過單因素試驗和響應面法得到美藤果分離蛋白的最佳提取工藝條件為：pH 10、超聲時間16 min、超聲功率220 W、超聲溫度43 ℃、液料比17∶1 (mL∶g),此時蛋白得率為21.23%,相比傳統堿溶酸沉法提取蛋白質而言,得率顯著提高。另外,該得率與模型預測值21.47%相接近,說明該模型能夠用于超聲波輔助堿法提取美藤果分離蛋白的工藝條件優化。

通過比較美藤果分離蛋白、清蛋白和球蛋白的加工性質,發現分離蛋白的溶解性低于清蛋白和球蛋白,其溶解性曲線隨pH增大呈“V”形,在pH 2～3和pH 10～12具有較好的溶解性,與堿溶酸沉法提取的美藤果分離蛋白相比,本文提取的該蛋白溶解性較高；分離蛋白的起泡性低于清蛋白,高于球蛋白,在pH 10時最大,為51.11%,起泡穩定性低于球蛋白,但均維持在65%以上；乳化性和乳化穩定性低于清蛋白,高于球蛋白,在pH 10時最大,分別為45.72 m2/g和29.29 min；總巰基和游離巰基含量高于清蛋白和球蛋白,分別為8.04和3.86 μmol/g。因此,美藤果分離蛋白的提取及加工性質研究具有一定意義,可為其在食品工業等領域的應用提供理論依據。