草莓葉水提物對成纖維細胞合成Ⅰ型膠原及分泌骨形態發生蛋白-1的影響

丁文玉,何聰芬,劉蕾,楊笑笑,董坤*

1(北京工商大學 化學與材料工程學院,北京,100048)2(北京市植物資源研究開發重點實驗室(北京工商大學),北京,100048)

皮膚中的膠原蛋白主要包括I型(collagen I,COL I)和III型(collagen III,COL III),為皮膚提供強度和支撐。人類年輕皮膚中COL I和COL III分別占總膠原蛋白的80%和15%,隨年齡增長,COL I明顯丟失,同時合成速度減慢,導致COL I和COL III的比值逐漸降低,引起皮膚老化,故COL I是維持皮膚豐盈飽滿的重要蛋白[1]。膠原蛋白的主要合成場所在成纖維細胞(fibroblast,FB),FB首先合成帶有氨基(N-)端和羧基(C-)端的無活性膠原前體,其N-和C-端經過相關蛋白酶切割(翻譯后加工)釋放出成熟的三股螺旋膠原蛋白,最終形成膠原纖維,發揮其生物學功能。研究發現,骨形態發生蛋白1(bone morphogenetic protein 1,BMP-1)參與細胞外基質(extracellar matrix,ECM)中的多種蛋白質肽鏈的切割,包括膠原蛋白、小型富含亮氨酸蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycans,SLRPs)、SIBLING(small integrin binding ligand,N-linked glycoprotein)蛋白、賴氨酸氧化酶(the enzyme lysyl oxidase,LOXs)等[2]。其中,BMP-1參與膠原蛋白前體C端水解過程,促使膠原蛋白功能化[3],如圖1所示。

圖1 膠原蛋白成熟過程Fig.1 Collagen maturation process

草莓葉是草莓種植過程中最主要的副產品,其富含多種生物活性成分,如有機酸、槲皮素和山柰酚衍生物等黃酮類化合物,咖啡酸和綠原酸等酚酸,鞣花單寧、萜類化合物等[4-5]。此外,草莓葉提取物具有抑制膠原酶活性,可改善因膠原蛋白流失引起的皮膚衰老[6]；抑制炎癥介質釋放,表現出潛在的抗過敏性[7]；對胰脂肪酶有微弱的抑制作用,表現出潛在的抗肥胖活性[7]。法國植物專家BERKEM曾將一種高多酚含量的草莓葉提取物用于化妝品中,可有效改善皮膚的光澤和質地[8]。本實驗室前期針對草莓葉水提物(water extractions from strawberry leaves,SLWE)研究發現,其具有良好的提高膠原蛋白含量和抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP-1)活性，進而減少膠原蛋白降解的功效,而SLWE是否存在促進膠原蛋白成熟的功效未知。

本文通過測SLWE主成分和抗氧化活性酶酶活力,分析SLWE對HFF-1中COL I和BMP-1含量的影響,探究SLWE作為開發延緩衰老功效性原料的可能性,為提高草莓廢棄物綜合利用效率提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗材料與試劑

人包皮成纖維細胞(human foreskin fibroblasts,HFF-1),由中國科學院干細胞庫提供；新鮮紅顏草莓葉,北京市欣寶萊科技股份有限公司。DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培養基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS),Hyclone；胰酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、鏈霉素/青霉素,gibco；CCK-8試劑盒,碧云天生物技術公司；COL I試劑盒,南京建成生物研究所；BMP-1試劑盒,北京安迪華泰科技有限公司；維生素C,北京奧拓達科技有限公司；人參皂苷Rb1、蘆薈多糖,上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器

206471-6608型恒溫培養箱，Thermo；Centrifuge 5810 R臺式冷凍離心機，Eppendorf；Infinite M200 PRO酶標儀，TECAN；LGJ-18冷凍干燥機，北京松原華興科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SLWE制備

新鮮紅顏草莓葉冷凍干燥24 h,打磨成粉,過100目篩,料液比1∶25(g∶mL),超聲30 min,8 000 r/min離心10 min,取上清液,即為SLWE。用HFF-1培養基稀釋SLWE至體積分數為12.5%、6.25%、3.125%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.062 5%,備用。

1.2.2 HFF-1培養、計數、鋪板

當HFF-1生長率達到80%以上時進行傳代培養,傳代流程如下：棄去培養基廢液,用1 mL PBS溶液清洗2次,加入1 mL胰酶,在37 ℃、5%CO2培養箱中消化3 min,當細胞消化至80%以上,加入2 mL培養基終止消化。細胞轉移至離心管中,1 000 r/min、25 ℃下離心4 min。棄去培養基,加入1 mL培養基吹打懸浮,按照一分二原則于5 mL培養基的培養瓶中傳代培養。

按照傳代方法,將細胞吹打成單細胞懸液,取10 μL沿蓋玻片打入血球計數板中,于顯微鏡下計數,遇到邊框上的細胞,按照數上不數下,數左不數右原則計數,按公式(1)計算:

(1)

依據實際需要,將已知密度的細胞懸液稀釋至密度為5×104個/mL,每100 μL細胞懸液接到96孔板中。

1.2.3 SLWE主要成分和酶活性分析

以SLWE原液為研究對象,參照陳金娥等[9]方法,利用鉬酸銨比色法測定還原型Vc含量；可溶性糖含量參照南京建成試劑盒說明書進行測定；蛋白質提取、含量測定,參照全式金BCA蛋白測定試劑盒說明書；原花青素含量采用香草醛-濃鹽酸法[10]；總酚含量,參照CHAVAN等[11]采用的Folin-酚法；總黃酮含量測定,采用NaNO2-AlCl3-NaOH法[12]；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化物酶(peroxidase,POD)提取及含量,參照魏彥珍[13]等方法進行測定。

1.2.4 SLWE安全濃度篩選

參考CCK-8試劑盒說明書,以正常培養HFF-1為陰性對照組,不鋪細胞只有培養基為空白對照,以1.2.1小節制備8個濃度梯度SLWE為測試樣品,以HFF-1存活率大于80%為標準,確定SLWE對HFF-1的安全濃度,通過公式(2)計算細胞存活率：

(2)

式中:在450 nm處測定OD值。

1.2.5 SLWE對HFF-1合成COL I的影響

以0.01% Vc為陽性對照組,更換培養基為陰性對照,用培養基稀釋SLWE體積分數至0.2%、1.5%、2%、6.25%作為試驗組,分別作用于HFF-1培養24 h后取上清液,COL I試劑盒說明書進行測定。

1.2.6 SLWE對HFF-1分泌BMP-1的影響

鋪板的HFF-1培養72 h后棄去培養基,用無血清的DMED處理12 h。研究表明HFF-1培養24 h后是BMP-1含量的最適檢測時間點[14],所以,更換培養基為陰性對照,100 μg/mL Vc、200 μg/mL蘆薈多糖、10 ng/mL TNF-α、40 ng/mL人參皂苷Rb1、100 μg/mL人參皂苷Rb1為預選的陽性對照,培養基稀釋SLWE體積分數至0.5%、1%、2%、3.125%作為試驗組,分別作用于處理好的HFF-1培養24 h,取上清液,按BMP-1試劑盒說明書進行測定。

1.2.7 數據處理與統計分析

采用SPSS軟件進行獨立樣本t檢驗,0.01

2 結果與分析

2.1 SLWE主要成分及抗氧化酶SOD、POD分析

Vc、原花青素、多糖類、黃酮類化合物和多酚類化合物的抗氧化活性主要通過清除自由基而體現出現，同時活性成分之間具有協同增效的作用，從而提高抗氧化活性[15-18]。由表1可知，SLWE中Vc含量為(0.88±0.025)mg/mL，約是新鮮葉片Vc含量的11倍[19]；SLWE中的原花青素含量為(0.28±0.027)mg/mL，約是山葡萄籽中原花青素的含量(水提：0.075 mg/mL)的4倍[20]；SLWE中多糖類、黃酮類化合物和多酚類化合物含量分別達到(10.00±0.28)、(1.47 ±0.05)和(2.05 ±0.03)mg/mL，故SLWE具有一定的抗氧化能力。此外，SLWE有一定SOD和POD酶活力，SOD是生物體內存在的一種抗氧化金屬酶，能催化超氧陰離子自由基(·O2-)歧化生成O2和H2O2[21]，進而被POD徹底還原生成H2O排出體外。

表1 SLWE活性成分和主要酶活力Table 1 Contents of active components and activities of main antioxidant enzymes in SLWE

人體正常新陳代謝會產生活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，主要以·OH、·O2-以及H2O2的形式存在[22]，是造成肌膚老化最主要的原因；SLWE中的活性成分和酶可以通過清除新陳代謝產生的氧自由基，從而起到抗氧化的作用，延緩皮膚衰老。

2.2 SLWE對HFF-1活性影響

由圖2可知,SLWE在體積分數0.062 5%～12.5%范圍內對HFF-1沒有明顯細胞毒性,且與陰性對照相比,不同體積分數的SLWE對細胞無明顯增殖作用。

圖2 SLWE對HFF-1存活率的影響Fig.2 Effect of SLWE on HFF-1 viability注：細胞存活率≥80%,沒有明顯細胞毒性；細胞存活率<80%,存在細胞毒性[14]

2.3 SLWE對HFF-1合成COL I的影響

結合上述試驗結果,選取了4個SLWE體積分數(0.2%、1.5%、2%、6.25%)考察其對HFF-1合成COL I的影響,結果如圖3所示。SLWE在0.2%～6.25%體積分數范圍內,能顯著促進HFF-1分泌COL I。此外,結果表明SLWE對HFF-1無明顯增殖作用(圖2),說明SLWE不是通過增加細胞數量促進COL I的含量,而是具有促進HFF-1細胞中COL I表達的作用。

圖3 SLWE對HFF-1合成COL I影響Fig.3 Effect of SLWE on the synthesis of COL Ⅰ by HFF-1

Vc具有羥基化前膠原多肽的脯氨酸和賴氨酸殘基[23-24]、抑制MMP-1基因的轉錄[25]以及促進和維持細胞外基質(extracellular matrix,ECM)中I型膠原的合成的作用,此外,SLWE中活性成分及酶能有效清除氧自由基。所以推測SLWE可通過促進阻斷因ROS激活的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路引起的膠原蛋白的降解,從而維持膠原蛋白含量。綜上,SLWE中的活性成分通過減少膠原蛋白降解及促進COL I合成2種途徑來增加膠原蛋白的含量。但HFF-1合成的只是膠原蛋白前體,而生物體內只有成熟的膠原蛋白才能發揮其生物學功能,所以本文又進行了SLWE能否促進COL I成熟過程中最關鍵的C端蛋白酶BMP-1的表達。

2.4 SWEL對HFF-1分泌BMP-1影響

2.4.1 陽性對照的篩選

理想陽性對照品可以確保試驗的穩定性和可靠性。文獻調研發現,Vc能促進COL I合成[26];蘆薈多糖可促進人皮膚成纖維細胞增殖,促進COL I、COL III合成及表達[27];TNF-α可促進成纖維細胞分泌BMP-1[28];而人參皂苷Rb1在促進成纖維細胞增殖的同時,可促進I型前膠原蛋白表達[29]。故本文以VC、蘆薈多糖、TNF-α以及人參皂苷Rb1作為預選陽性對照品,同時參照相應參考文獻中的最適濃度進行試驗[14],用BMP-1試劑盒檢測其對HFF-1分泌BMP-1的影響。設定陰性對照組HFF-1分泌BMP-1的含量為100%,計算上述幾種成分作用于HFF-1分泌BMP-1的相對生成率,結果如圖4所示。

1-VC 100μg/mL;2-TNF-α 10 ng/mL;3-蘆薈多糖 200μg/mL;4-人參皂苷 40ng/mL;5-人參皂苷 100 μg/mL圖4 幾種成分對HFF-1分泌BMP-1的影響Fig.4 Effect of several components on the secretion of BMP-1 by HFF-1

結果表明,100 μg/mL Vc與陰性對照組差異十分顯著(0.001

2.4.2 SLWE對HFF-1分泌BMP-1的影響

由圖5可知，SLWE體積分數為2%時，與陰性對照組差異十分顯著(0.001

1-SLWE 0.5%;2-SLWE 1%;3-SLWE 2%;4-SLWE 3.125%圖5 SLWE對HFF-1分泌BMP-1的影響Fig.5 Effect of SLWE on BMP-1 secretion by HFF-1

SWEL中Vc含量為(0.88±0.025)mg/mL(表1),則體積分數為1% SLWE中的Vc含量為8.8 μg/mL,其對HFF-1分泌BMP-1的相對生成率(157.77%)與陽性對照100 μg/mL Vc的作用(143.26%)相當,如表2所示,說明SLWE對HFF-1分泌BMP-1的促進作用相當于Vc的10多倍,這可能與SLWE中其他活性成分(如原花青素、多糖、黃酮類化合物多酚等)密切相關,可能是多種活性成分的協同增效作用,明確的機理有待研究。

表2 SLWE與陽性對照組中Vc濃度及促進BMP-1作用的對比Table 2 Comparison of Vc content and BMP-1 promoting effect between SLWE and positive control

3 結論

(1)SLWE富含多糖、酚類化合物、黃酮類化合物、Vc、原花青素和蛋白質,以及一定的SOD和POD酶活力,為SLWE促進COL I合成和BMP-1分泌提供了物質基礎。

(2)SLWE在0.2%～6.25%(體積分數)范圍內沒有促進HFF-1增殖作用,但可以促進HFF-1合成COL I,0.5%～3.125%范圍內促進HFF-1分泌BMP-1。SLWE可以通過促進膠原蛋白合成和成熟(功能化),如圖6所示,為SLWE作為延緩皮膚衰老化妝品功效成分提供理論基礎。

圖6 SLWE對HFF-1合成COLI及分泌BMP-1的影響Fig.6 Effects of SLWE on COL I synthesis and BMP-1 secretion by HFF-1注：加粗實線表示本試驗結果；細實線表示文獻調研結果

(3)草莓葉作為草莓產業的副產物,存在處理費時費力及其污染環境的問題,開發SLWE作為化妝品原料,有助于植物資源廢棄物的再利用,促進農村二三產業發展,提高草莓產業。