不同后發酵溫度下曲霉型豆豉的氨基酸態氮生成動力學及品質變化研究

王迪,王智榮,陳湑慧,宋軍,孔祥兵,陳本開,闞建全*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)2(農業農村部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶),重慶,400715)3(中匈食品科學合作研究中心,重慶,400715)4(重慶市永川區君意食品廠,重慶,402160)

豆豉是將黃豆或黑豆經過浸泡、蒸煮和微生物發酵等工藝制成的一種風味食品,因其滋味獨特而深受消費者的喜愛。在豆豉的生產工藝中,后發酵是其外觀變化、風味物質生成、生物活性增強、營養成分變化的重要工序。在此階段,豆豉中的還原糖和氨基酸進行非酶促褐變反應生成類黑精[1],使得豆豉的顏色逐漸向黑色轉化,且在微生物酶系作用下,豆豉的蛋白質和纖維素發生水解,硬度和咀嚼度不斷降低[2],滋味也由蒸煮后的奶香[3]向鮮味、甜味、苦味等滋味[4]轉變。與此同時,大豆浸泡蒸煮后產生的20多種揮發性成分[3]經過后發酵后可增至60～80種[5],且后發酵后豆豉的游離氨基酸(free amino acids,FAA)總量、總酸(total acids,TA)和維生素B2等含量明顯增高[6-7]。此外,豆豉在后發酵過程中產生的類黑精[1]和大豆多肽[8]等物質,具有抗氧化[9]及抑制血管緊張素轉化酶活性作用[10]等多種生物活性,有利于促進人體健康。

研究認為,氨基酸態氮(amino nitrogen,AN)含量可以反映出豆豉中蛋白質的水解程度,其含量是判斷豆豉后發酵是否完成的重要指標[11-12]。因此,研究AN生成動力學,將有利于減少工業生產成本,提高生產效率。目前,關于豆豉后發酵的研究主要集中后發酵工藝的優化和某一溫度下理化性質的變化,但對于不同后發酵溫度對豆豉的品質影響研究較少,尤其是不同溫度下AN的生成動力學。近年來,修正后的Gompertz方程為描述豆豉后發酵過程中AN的動力學過程提供了新的思路,該方程已成功描述了多種發酵過程的產物的動力學變化[13-14]。

在豆豉工業生產中,根據不同工藝要求,曲霉型豆豉通常在45～60 ℃中的某一溫度下進行保溫后發酵。然而,在實際生產中,豆豉發酵程度往往依托于工人的經驗進行判斷,因此,本文以4種大豆(3種黃豆和1種黑豆)為原料,米曲霉為發酵菌種,使用修正后的Gompertz方程擬合45、55和65 ℃溫度下AN的含量,評估不同溫度下AN的最大值以及最大生成速率,同時探討AN最大值和最大生成速率與溫度的關系。此外,監測3種溫度下豆豉的pH值、水分、褐變指數(browning index,BI)、TA及FAA的含量變化,并對這些指標進行相關性分析,旨在為曲霉型豆豉生產提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4種市售大豆：重慶本地大豆(渝豆6號,文中縮寫為LS),重慶市永輝超市；東北大粒大豆(東生7號,文中縮寫為DBL)、黑豆(青仁烏,文中縮寫為BS),黑龍江省大興安嶺市當地超市；東北小粒大豆(東生1號,文中縮寫為DBS),黑龍江省哈爾濱市當地超市；米曲霉(滬釀3.042菌種),山東濟寧玉園生物科技公司；醪糟、食鹽,永輝超市。

賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、纈氨酸(Val)、胱氨酸(Cys)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、組氨酸(His)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、蛋氨酸(Met)、蘇氨酸(Thr),Sigma公司；1 mol/L NaOH標準溶液,Aladdin 公司;甲醛溶液、鹽酸、三乙胺醋酸鈉、乙腈,成都市科隆化學品有限公司；2,4-二硝基氟苯,成都科龍化工試劑廠,其中乙腈為色譜級,其余均為分析純。

1.2 儀器與設備

WR-18威福光電色差儀,深圳市威福光電科技有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀,美國Agilent公司；FS-2可調高速勻漿機,江蘇金壇科析儀器有限公司；DCX—9243 B-1電熱恒溫鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司；PB-10 pH計、SQP電子天平,賽多利斯科學儀器有限公司；RCT basic package磁力攪拌器,德國IKA公司；LHS-150CLY恒溫恒濕箱,上海齊欣科學儀器有限公司；

1.3 試驗方法

1.3.1 曲霉型豆豉的制備

曲霉型豆豉的工藝及條件如下所示：

挑選大豆→浸泡 (25 ℃,12 h) →瀝干→蒸煮 (常壓蒸煮,2 h) →冷卻→接種 (0.04%米曲霉) →制曲 (30 ℃,85%相對濕度,48 h) →拌料 (8%食鹽、10%醪糟) →后發酵 (45、55、65 ℃)→豆豉

將拌勻后的曲料分裝在無菌密封袋中,分別放在45、55及65 ℃的恒溫箱中進行后發酵,并于0、2、4、7、10、14、18、22 d分別取樣并進行相關理化指標的測定。

1.3.2 水分含量的測定

參考COSTA等[15]的方法并作適當修改,先稱空白鋁盒的質量記為m1,再稱取5 g左右豆豉于鋁盒中記為m2,再放置在105 ℃下烘16 h,烘后質量記為m3,按公式(1)計算水分含量：

(1)

1.3.3 pH值的測定

參考張仁鳳[11]的方法。取5 g樣品加入40 mL蒸餾水并用勻漿機破碎,7 500 r/min離心10 min,離心后將上清液移至50 mL容量瓶并定容,用pH計測定。

1.3.4 TA的測定

取5 g豆豉加入50 mL 蒸餾水并用勻漿機分散均勻,定容到100 mL,按照GB/T 12456—2008[16]中總酸的方法進行測定,結果以乳酸計。

1.3.5 AN的測定

樣品制備方法與總酸測定相同,樣品制備好后按照GB 5009.235—2016[17]測定AN的含量。

1.3.6 BI的測定

使用色差計直接測定豆豉的顏色,即L*、a*和b*值,按公式(2)計算BI[18]：

(2)

(3)

1.3.7 FAA的測定

(1) FAA標準曲線的繪制。分別準確稱取氨基酸標準品各4 mg于5 mL 的棕色容量瓶中,用0.1 mol/L的HCl溶液定容。分別吸取上述混合標準溶液,用0.1 mol/L的HCl溶液稀釋,制成一系列濃度的混合溶液。

(2) 豆豉樣品的制備。參考梁葉星等[19]的方法并作適當修改。準確稱取豆豉樣品5 g,加入20 mL 0.1 mol/L HCl溶液,用勻漿機對樣品進行破碎,將破碎后的樣品溶液放置在25 ℃、160 r/min 振蕩搖床中振蕩提取1 h,8 000 r/min離心15 min,過濾至50 mL容量瓶,在濾渣中按照上述方法重復提取1次,合并濾液最后定容。

(3) FAA的柱前衍生和HPLC測定條件。將氨基酸標準溶液和豆豉樣品參照文獻[20]的方法進行柱前衍生,衍生結束后經0.22 μm有機微孔濾膜過濾,取濾液后HPLC上機分析。

1.3.8 數學模型

修正后的Gompertz方程如公式(4)所示[13]：

(4)

式中：Pm,AN的最大值,g/100 g；tz,滯后時間,h；km,生成速率,g/h；t,后發酵時間,d。

1.3.9 數據分析及處理

以上指標均重復測定3次。使用Microsoft Excel 2019處理數據,Origin pro 2019b繪制圖形和擬合方程,Minitab 19進行顯著性分析,SPSS 25進行相關性分析,確定系數(R2)和誤差平方和(sum of squares due to error,SSE)對數學模型進行評估。

2 結果與分析

2.1 不同后發酵溫度下曲霉型豆豉的AN生成動力學

如圖1所示,在后發酵過程中,4種大豆在3種溫度下AN含量總體呈現出先上升后逐漸趨于穩定最終有所下降的趨勢,發酵前期的上升后趨于穩定是因為隨著后發酵的不斷進行,總蛋白酶活力逐漸下降,從而導致AN的增速逐漸變慢[7,21]；發酵22 d AN含量下降可能是豆豉內某些生化反應消耗所導致的。同時,不同后發酵溫度下AN的含量不同,這可能是因為后發酵的溫度影響了蛋白酶的活力,溫度越高,蛋白酶活力越低。值得注意的是,4種豆豉在65 ℃下,后發酵前期AN含量有明顯的下降,這可能是因為在此溫度條件下,蛋白酶活力很低,氨基酸的消耗量遠大于產生量。

a-LS;b-DBL;c-DBS;d-BS圖1 不同后發酵溫度下4種曲霉型豆豉的AN含量Fig.1 AN content of four Aspergillus-type Douchi at different post-fermentation temperatures

由圖1可知,4種豆豉在發酵18 d的AN含量達到最高,故將18 d作為豆豉發酵的終點。國家標準規定曲霉型豆豉AN含量需高于0.4 g/100 g,本文所研究的各溫度下AN終點含量均符合該要求。為了更好地探索溫度和AN的關系,剔除了65 ℃下0 d的值,使用修正后的Gompertz方程擬合了4種大豆在3種溫度下的AN含量,擬合結果如表1所示,擬合曲線如圖2所示。

表1中，R2均大于0.94,故該方程可以很好地擬合不同溫度下后發酵過程中AN的生成;4種豆豉在同一溫度Pm和km基本無差異,這說明大豆品種對于后發酵期間AN的生成無明顯影響。4種曲霉型豆豉Pm和km均隨著溫度的升高而降低。CHOACHAMNAN等[22]使用Arrhenius方程描述km和T(K)之間的關系,本文使用線性回歸描述Pm和后發酵溫度T(K)之間的關系,結果如表2所示。在45～65 ℃,km和發酵溫度之間也符合Arrhenius方程的關系,Pm和溫度有良好的線性關系。

表1 方程系數及擬合優度表Table 1 Equation coefficients and goodness of fit

a-LS;b-DBL;c-DBS;d-BS圖2 不同后發酵溫度下4種曲霉型豆豉的AN實測值和擬合曲線Fig.2 Measured AN values and fitting curves of four Aspergillus-type Douchi at different post-fermentation temperatures

表2 模型系數和溫度的關系Table 2 Relationship between model coefficients and temperature

2.2 不同后發酵溫度下曲霉型豆豉的水分含量、pH及TA的變化

如圖3所示,4種大豆在不同溫度下的水分含量雖有波動但無顯著差異,這可能是因為豆豉在后發酵過程中處于密閉環境,無法與外界交換水分,在趙文鵬[23]和張仁鳳[11]的研究中也發現了類似的現象。4種豆豉的水分含量略有差異可能是因為品種不同。

由圖4可知,4種大豆的pH值在3個溫度下均呈現出短暫上升后下降的趨勢,且在3種溫度下無較大差異,4種豆豉間的pH值無顯著的差異。如圖5所示,在3種溫度下,4種大豆的總酸含量整體呈現出先下降后緩慢上升最終趨于穩定的趨勢。pH的上升和TA的下降可能是微生物生長消耗,后期pH的下降和TA上升可能是因為豆豉中的蛋白質和脂肪等物質被相關酶分解成有機酸、FAA及脂肪酸等酸性物質[11]。對TA而言,不同溫度下,4種豆豉的TA含量呈現出一樣的趨勢：在45 ℃下含量最高,其次為55 ℃,65 ℃含量最低。這可能是在本文研究的溫度下,溫度越高,生成酸類物質相關酶的酶活力越低。對比同一溫度下4種豆豉TA含量,發現DBL明顯高于其他3種,其次是BS、LS和DBS,后3種差異不是很大,這可能與大豆品種有關。

2.3 不同后發酵溫度下曲霉型豆豉的BI變化

由圖6可知,隨著后發酵的不斷進行,4種豆豉BI值呈現出不斷上升的趨勢,吳枚枚[12]也發現了同樣的現象。同時觀察出,后發酵溫度越高,BI值越大,這可能是因為溫度越高,美拉德反應越快[22],由此證明,后發酵的時間和溫度都會影響豆豉褐化。

2.4 不同后發酵溫度下曲霉型豆豉的FAA含量變化

本文測定了發酵終點(18 d)4種曲霉型豆豉在3種溫度下的FAA含量,結果如表3所示。由表可知,4種豆豉中都檢測出18種FAA。對比4種豆豉后發酵前后總FAA的含量,觀察到45 ℃和55 ℃的FAA含量大幅度增高,在65 ℃條件下,除黑豆的FAA含量有輕微上升以外,其余3種黃豆的FAA含量均輕微下降。同時除了Ala之外,其余氨基酸基本均隨著后發酵溫度的升高而降低。索化夷等[2]報道,Glu和Leu是大豆中的主要游離氨基酸,本文的結果也證實了這一點。4種豆豉中均含有除色氨酸以外的7種人體必需氨基酸[2],通過對比發酵前后必需氨基酸含量的變化,發現3種發酵溫度下其含量都在增加:在45 ℃下,LS、DBL、DBS和BS分別增加了4.1、4.6、6.3和6.7倍；在55 ℃下,分別增加了3.8、4.4、5.2和6.1倍；在65 ℃下,4種豆豉分別增加了1.4、1.8、2.1和2.5倍；對比發酵前4種豆豉的FAA總含量,發現3種黃豆的總含量無明顯差異且均高于黑豆的總含量,差異主要體現在Arg的含量不同；對比45和55 ℃下4種豆豉的游離氨基酸總含量,發現黑豆的總含量高于3種黃豆,主要體現在Glu的含量不同；但在65 ℃下沒有發現4種豆豉的總含量有明顯差異。通過對比發酵前4種豆豉的必需氨基酸含量,發現LS最高,其次為DBL、DBS和BS。對比同一溫度下4種豆豉的必需氨基酸含量,發現在45和55 ℃下依舊是LS>DBL>DBS>BS,但在65 ℃下4種豆豉無明顯差異。

a-LS;b-DBL;c-DBS;d-BS圖3 不同后發酵溫度下4種曲霉型豆豉的水分含量Fig.3 Moisture content of four Aspergillus-type Douchi at different post-fermentation temperatures

a-LS;b-DBL;c-DBS;d-BS圖4 不同后發酵溫度下4種曲霉型豆豉的pH值Fig.4 pH value of four Aspergillus-type Douchi at different post-fermentation temperatures

a-LS;b-DBL;c-DBS;d-BS圖5 不同后發酵溫度下4種曲霉型豆豉的TA值Fig.5 TA value of four Aspergillus-type Douchi at different post-fermentation temperatures

a-LS;b-DBL;c-DBS;d-BS圖6 不同后發酵溫度下4種曲霉型豆豉的BI值Fig.6 Browning index of four Aspergillus-type Douchi at different post-fermentation temperatures

表3 四種曲霉型豆豉不同溫度下發酵前后游離氨基酸含量Table 3 Content of free amino acids before and after fermentation of four Aspergillus-type Douchi at different temperatures

續表3

秦禮康[24]將游離氨基酸分為以下幾種呈味氨基酸：甜味(Ala、Gly、Thr、Ser),鮮味(Glu、Asp),苦味(Met、Arg、Phe、Leu、His、Tyr、Val、Ile)及無味氨基酸(Pro、Cys、Lys)。由表4可知,在后發酵前后,鮮味和苦味氨基酸占了呈味氨基酸總量的80%及以上,甜味及無味氨基酸在呈味氨基酸中的占比差異不大。在后發酵前,4種豆豉的鮮味氨基酸占比略微高于苦味氨基酸；在后發酵結束后,3種黃豆豆豉中的苦味氨基酸明顯高于鮮味氨基酸；而黑豆中鮮味及苦味氨基酸占比差異不大。此外,鮮味氨基酸在呈味氨基酸中占比隨著后發酵溫度的升高而降低。

表4 不同溫度下4種曲霉型豆豉發酵前后呈味氨基酸在總氨基酸的占比Table 4 Proportion of flavored amino acids in total amino acids before and after fermentation of four Aspergillus-type Douchi at different temperatures

2.5 不同后發酵溫度下曲霉型豆豉各指標的相關性分析

對4種曲霉型豆豉在45～65 ℃下后發酵期間(0～18 d)水分含量、BI值、pH、TA及AN含量進行相關性分析,分析結果如表5所示。在4種曲霉型豆豉中各指標間的相關性呈現一致的趨勢：發酵溫度與BI值呈極顯著正相關(P<0.01),與TA和AN呈極顯著負相關(P<0.01),這可能是因為在本文研究的溫度范圍內,溫度越高,生成類黑精的褐變反應速度越快[7],生成有機酸和游離氨基酸的酶活力越低[12]。而水分含量和其余指標的相關度比較低,這是因為發酵過程豆豉水分沒有顯著變化。BI值和pH值呈極顯著負相關 (P<0.01),可能是因為隨著發酵的進行,豆豉的BI值越來越高,樣品中的pH越來越低。本文研究了3個發酵溫度,發現豆豉顏色和AN沒有相關性；但僅對一種溫度下的豆豉顏色和AN進行相關性分析,發現2個指標呈現正相關,這與韓佳冬[25]在永川豆豉的后發酵過程中發現豆豉的顏色和AN的生成有顯著的相關性的結果類似。TA與AN呈極顯著正相關 (P<0.01),張仁鳳[11]使用同種米曲霉在后發酵過程中也發現了同樣的結果,這可能是因為在后發酵過程中,TA和AN含量的增加都與其相關的酶有關,而大部分酶的酶活力均呈下降趨勢[21]。

表5 不同指標間的相關性分析Table 5 Correlation analysis between different indicators

3 結論

本研究發現修正后的Gompertz方程可以很好地描述4種曲霉型豆豉在不同后發酵溫度(45～65 ℃)下AN的生成動力學,觀察擬合后的參數發現,AN的最大值和生成速率均隨著溫度的升高而降低,且AN的最大值與溫度呈線性關系,生成速率和溫度的關系符合Arrhenius方程,但4種豆豉的AN最大值和生成速率沒有差異。此外,后發酵溫度越高,4種豆豉的褐變程度越高,TA和AN含量越低,發酵結束后的游離氨基酸總量與必需氨基酸總量越低。本研究結果能準確描述不同溫度下AN變化的動力學方程,明確了不同溫度下曲霉型豆豉理化性質的變化,為曲霉豆豉的工業化生產提供理論支持。