粟酒裂殖酵母與釀酒酵母順序接種發酵對干紅葡萄酒品質的影響

王婧,高娉娉,田秀,梁麗紅,李敏,韓舜愈

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院,甘肅 蘭州,730070)2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室,甘肅 蘭州,730070)3(甘肅省輕工研究院有限責任公司,甘肅 蘭州,730000)

葡萄酒釀造涉及到的酵母菌種主要包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和非釀酒酵母(non-Saccharomycescerevisiae)[1]。釀酒酵母由于酒精轉化率高、發酵徹底而被廣泛用于葡萄酒酒精發酵。然而,釀酒酵母單獨發酵常常會造成葡萄酒香氣單一、風味同質化,地域風格欠缺等問題[2]。非釀酒酵母大量存在于葡萄酒酒精發酵的前期和中期,能夠通過代謝、自溶等生化過程,參與酯類、醇類、萜烯類等揮發性香氣物質的形成,提高葡萄酒的香氣[3]。

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)是裂殖屬的桿狀酵母,曾被認為是腐敗微生物,但近些年研究發現,S.pombe對葡萄酒生境耐受性較強,有較高的乙醇發酵能力,并能將L-蘋果酸轉化為乙醇[4],可以改善紅葡萄酒顏色的穩定性,增加葡萄酒中香氣化合物含量[5],降低影響產品質量安全的氨基甲酸乙酯的濃度[6],是極具釀酒潛力的非釀酒酵母,國外已將S.pombe應用于朗姆酒、棕櫚酒和可可酒的釀造[7]。國際葡萄與葡萄酒組織(International Organisation of Vine and Wine, OIV)也批準了S.pombe作為生物降酸劑在葡萄酒發酵中使用[8]。目前葡萄酒行業對非釀酒酵母的使用多以混菌發酵方式進行,包括同時接種和順序接種,其中順序接種方式能夠延長非釀酒酵母在發酵體系中的存活時間,更有效地改善葡萄酒的品質和感官特性[6],并縮短酒精發酵完成的時間[9],因此在混菌發酵中是一種有效利用非釀酒酵母的接種方式。黑比諾是西北地區主栽的早熟釀酒紅葡萄品種,喜歡溫和或冷涼的氣候,葡萄皮薄,單寧含量低,帶有成熟的紅色水果的香氣[10]。由于西北產區屬于溫帶季風性氣候,晝夜溫差較大,氣溫偏低,釀酒葡萄成熟時間較短,使成品酒存在酸度過高、香氣復雜性欠缺、產地特征不明顯等問題[11]。

本試驗以賀蘭山東麓青銅峽市西鴿酒莊‘黑比諾’葡萄為原料,采用S.pombe和商業釀酒酵母順序接種發酵,釀造‘黑比諾’干紅葡萄酒,并對酒精發酵過程中菌種生長動態、蘋果酸的變化趨勢、成品酒的色澤及香氣品質等進行分析,研究S.pombe與釀酒酵母順序接種發酵對‘黑比諾’干紅葡萄酒品質的影響,為提升西北產區葡萄酒品質提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

‘黑比諾’葡萄,采摘于賀蘭山東麓青銅峽市西鴿酒莊葡萄種植基地,糖含量226.8 g/L(以還原糖計),可滴定酸含量6.8 g/L(以酒石酸計),pH值3.67。

1.1.2 菌種與培養基

商業釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)活性干粉(紅佳釀Vintage Red),意大利Enartis公司；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe),甘肅農業大學葡萄酒微生物實驗室保藏；商業酒酒球菌(Oenococcusoeni)活性干粉(OMEGA),法國Lallemand公司。

YPD固體培養基(g/L)：無水葡萄糖10,蛋白胨10,酵母浸粉5,瓊脂10;YPD液體培養基(g/L)：無水葡萄糖10,蛋白胨10,酵母浸粉5;WL培養基：購于青島海博生物技術有限公司;葡萄汁培養基：葡萄汁與無菌水體積比為1∶1。

所有培養基均于121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

偏重亞硫酸鈉,上海源葉生物科技有限公司；EX-V果膠酶,法國Lallemand公司；L-蘋果酸試劑盒,愛爾蘭Megazyme公司；2-辛醇(色譜純),SIGMA-ALDRICH(上海)貿易有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵試驗

1.2.1.1 菌株活化

將商業釀酒酵母活性干粉按0.2 g/L的添加量置于無菌水中,37 ℃水浴30 min后接種于YPD液體培養基中,于28 ℃培養48 h,以2%的接種量接種于葡萄汁培養基中,擴培2次后進行接種試驗。

挑取S.pombe單菌落接種于液體培養基中,28 ℃培養48 h,再以2%的接種量(體積分數)接種于葡萄汁培養基中擴培,于28 ℃培養48 h后進行接種試驗。

1.2.1.2 小容器發酵

黑比諾葡萄除梗破碎裝罐,加入50 mg/L SO2(以偏重亞硫酸鈉的形式)和20 mg/L果膠酶,16～18 ℃浸漬48 h,取葡萄汁裝入2 L發酵罐中,裝液量為70%,65 ℃水浴20 min[12],冷卻至室溫后接種酵母,發酵溫度控制在25～28 ℃,當殘糖低于4 g/L時添加50 mg/L SO2終止發酵,滿罐于16～18 ℃酒窖貯存。每個處理設3組重復。

1.2.1.3 接種試驗

對照組(CK)：單獨接種釀酒酵母于無菌葡萄汁中,使細胞濃度為107CFU/mL,酒精發酵結束后,接種0.02 g/L酒酒球菌,18 ℃進行蘋果酸-乳酸發酵。

處理組：在S.pombe接種后的第6、8、10、12天接入釀酒酵母,分別標記為SX1、SX2、SX3、SX4,接種后2種菌株的初始細胞濃度均為107CFU/mL。所有試驗均設置3組平行。

1.2.2 指標測定

1.2.2.1 菌株生物量測定

采用平板計數法進行菌落計數。發酵期間,每隔2 d取樣,梯度稀釋后涂布于YPD固體培養基,28 ℃培養箱恒溫培養72 h,然后對S.pombe與釀酒酵母進行菌落計數,根據S.pombe、釀酒酵母分別在WL培養基上呈深綠色和奶油色帶綠色的菌落形態進行區別統計。

1.2.2.2 葡萄酒理化指標測定

總糖、總酸、酒精度和揮發酸等含量參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定；單寧含量測定參照農業標準NY/T 1600—2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測定分光光度法》中的方法；總花色苷參照史肖等[13]的方法測定；色度、色調參照莊惠婷等[14]的方法測定；蘋果酸采用試劑盒法進行檢測。

1.2.2.3 柔和指數的測定

柔和指數=酒精-(酸度+單寧)[15],其中酒精用體積百分數表示,單寧用g/L表示,酸度用g/L表示(以硫酸計)。

1.2.3 揮發性香氣化合物測定

參照宋茹茹等[16]的方法進行測定。

1.2.4 感官分析

由10位葡萄酒品嘗員進行感官評價,使用7分結構化數值尺度來量化,分別從外觀(顏色)、口感(酸度、甜味、余味)、香氣(濃郁度、優雅度、典型性)和綜合品質(整體評分)4個方面對各葡萄酒樣品進行評價。

1.3 數據分析

采用Excel 2010和Origin 9.0進行數據處理和圖形繪制。使用SPSS 19.0繪制主成分分析圖,并對數據進行差異顯著性分析,采用Duncan檢驗進行多重比較,顯著性水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 酒精發酵過程中的菌株生物量

不同順序接種方式完成酒精發酵的時間不同(圖1)。其中間隔12 d的SX4在第18天完成酒精發酵,其他順序接種處理均在第16天完成酒精發酵,而對照CK在第8天完成酒精發酵,說明S.pombe與釀酒酵母的順序接種使‘黑比諾’干紅葡萄酒完成酒精發酵所需時間明顯增加。

在酒精發酵過程中2種菌株生物量變化如圖1所示。S.pombe和釀酒酵母菌株的起始細胞濃度均為107CFU/mL,不同間隔天數的順序接種完成酒精發酵后釀酒酵母菌株生物量與對照組基本一致,均保持在107CFU/mL的水平；各處理組S.pombe菌株生長趨勢基本一致,于2 d的指數生長期后進入穩定期,釀酒酵母菌株順序接入后,S.pombe菌株細胞濃度迅速下降,酒精發酵結束后細胞濃度保持在105CFU/mL的水平,釀酒酵母的細胞濃度基本都維持在107CFU/mL左右。綜上可知,S.pombe與釀酒酵母順序接種發酵時,S.pombe的最終生物量基本一致,但隨著接種間隔時間的增加,S.pombe在酒中發揮作用的時間增加。

a-SX1;b-SX2;c-SX3;d-SX4圖1 S.pombe和釀酒酵母順序接種發酵過程中菌株生物量Fig.1 Strain biomass during alcohol fermentation by the sequential inoculation of S.pombe and S.cerevisiae注：圖中實線代表菌株生物量,虛線代表葡萄酒中總糖含量；Gsc代表對照組的總糖含量,G代表處理組的總糖含量；Sp代表Schizosaccharomyces pombe菌株,Sc代表Saccharomyces cerevisiae菌株

2.2 葡萄酒品質分析

2.2.1 主要理化指標的測定

表1顯示了酒精發酵結束后‘黑比諾’干紅葡萄酒的基本理化指標。各酒樣中殘糖含量為3.01～3.60 g/L,均能夠完成酒精發酵。與對照組相比,處理組酒樣中總酸含量均有降低,降低量為0.25～2.22 g/L,SX2的總酸含量顯著低于其他處理組,說明SX2的降酸能力最好。

表1 S.pombe和釀酒酵母順序接種酒樣的理化指標Table 1 Physical and chemical indexes under sequential inoculation of S.pombe and S.cerevisiae

SX1和SX2與對照組相比揮發酸含量無顯著差異,有研究表明,S.pombe菌株具有代謝產生乙酸的風險[6],本研究中處理組隨著S.pombe菌株在酒樣中作用時間的增加,揮發酸含量也逐漸增加,但均未超過國標限量值1.20 g/L。處理組酒精度與對照組相比顯著降低,降低值在0.95%～1.28%,但各處理組之間沒有顯著差異。以上4個基本理化指標均符合國標GB 15037—2006《葡萄酒》的要求。單寧是影響葡萄酒質量的重要因素之一,賦予了葡萄酒獨特的感官品質(收斂性),其含量與葡萄酒品質密切相關[17]。各處理組的單寧含量與對照組間差異不顯著,含量在2.10～2.29 g/L。

2.2.2 對葡萄酒顏色的影響

色澤是評價干紅葡萄酒品質的重要依據,是消費者選購和品評葡萄酒的重要參考因素[15]。酒精發酵結束后葡萄酒中色度值和色調值如圖2-a所示,各處理組的色調值和色度值與對照組相比沒有顯著性差異,其色調值為0.77～0.85,色度值為1.00～1.05。總花色苷是影響葡萄酒顏色的重要指標之一。如圖2-b所示,處理組酒樣總花色苷含量與對照組之間無顯著差異,表明S.pombe和釀酒酵母菌株不同間隔天數的順序接種對葡萄酒中總花色苷含量無顯著影響。

a-色度、色調；b-總花色苷圖2 S.pombe和釀酒酵母順序接種的色度、色調和總花色苷測定Fig.2 Effect of sequential inoculation of S.pombe and S.cerevisiae on chroma,hueand total anthocyanin content注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2.3 對葡萄酒柔和指數的影響

柔和指數(suppleness index,IS)可以對紅葡萄酒的味感平衡進行數字化衡量。IS<5的紅葡萄酒瘦弱粗重;IS>5的紅葡萄酒較為柔和;IS>6～7則表明紅葡萄酒豐滿圓潤,口感平衡[15]。從圖3可知,酒精發酵結束后,SX2酒樣的IS為6.89,與對照組無顯著差異,SX1、SX3和SX4的IS顯著低于對照組,但SX1、SX3和SX4間沒有顯著差異,其值分別為5.89、5.91和5.40。上述結果表明,SX2和CK的酒樣口感平衡協調。

圖3 S.pombe和釀酒酵母順序接種的柔和指數分析Fig.3 Effect of sequential inoculation of S.pombe and S.cerevisiae on softness index

2.2.4 對葡萄酒蘋果酸含量的影響

S.pombe在酒精發酵過程中不僅能降解葡萄糖,還能夠降解蘋果酸,相關研究發現,在S.pombe參與發酵的酒樣中,蘋果酸幾乎能夠被完全降解[4]。對各供試酒樣蘋果酸的含量分析表明(圖4),不同間隔時間接種處理與經過蘋果酸-乳酸發酵的對照酒樣相比,蘋果酸含量均顯著降低,分別降低了20.00%、73.33%、40.00%、26.67%,其中SX2酒樣中蘋果酸含量(0.04 g/L)顯著低于其他酒樣,說明S.pombe與釀酒酵母菌株順序接種發酵比酒酒球菌對蘋果酸的降解更徹底。

圖4 S.pombe和釀酒酵母順序接種的蘋果酸含量分析Fig.4 Effect of sequential inoculation of S.pombe and S.cerevisiae on malic acid content

2.3 葡萄酒主要香氣化合物分析

香氣是葡萄酒感官品質的重要方面。通過頂空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)與氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)儀對供試酒樣香氣物質進行檢測分析。試驗酒樣共檢出52種主要揮發性香氣物質。包括18種脂類,17種醇類,10種酸類,4種萜烯類,3種其他類。

2.3.1 酯類化合物

酯類是葡萄酒中重要的香氣化合物,能為葡萄酒提供令人愉快的花香和果香[19]。酒精發酵結束后,與對照組相比,SX2酯類物質總量增加了73.58 μg/L,而其他3個處理組的酯類物質總量低于對照組。在檢測到的18種酯類物質中,共有6種酯類物質的OAV>1,分別為乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯。其中月桂酸乙酯具有花果香味和奶香味,該物質僅在處理組酒樣中被檢出,并在SX2和SX3酒樣中的含量顯著高于SX1和SX4；己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的OAV值均>10,這幾種物質具有濃郁的花果香氣,而處理組中己酸乙酯含量顯著高于對照組,是對照組的9.57～22.89倍；辛酸乙酯和癸酸乙酯在SX2中的含量顯著高于其他組,分別比對照組增加了73.84%和40.01%。由此可以看出,間隔8 d的SX2處理能夠增加月桂酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量,對葡萄酒花果香氣具有積極影響。

2.3.2 醇類化合物

醇類物質產生于酒精發酵期間,是酵母菌的次生代謝物,當葡萄酒中的醇類物質含量低于300 mg/L時能夠增加葡萄酒香氣的復雜性。但當其總量超過400 mg/L時,會產生令人不愉快的氣味,導致感官品質下降[20]。酒精發酵結束后,SX1、SX2和SX3醇類物質的總量高于對照組,分別比對照組增加了121.01%、90.18%和10.84%。所檢測的17種醇類物質中,共有3種物質的OAV>1,分別為正辛醇、1-壬醇和正戊醇。正辛醇和正戊醇具有茉莉、檸檬和面包等香氣,這2種物質僅在對照組、SX1和SX2中被檢出,其中,SX1和SX2的正戊醇含量顯著高于對照,分別是對照組的1.26倍和1.61倍。此外,苯乙醇能夠為葡萄酒帶來玫瑰、蜂蜜和薔薇等香氣,該物質僅在處理組中被檢出,其中SX1的苯乙醇含量顯著高于其他處理組。上述結果表明,SX1和SX2能夠顯著增加正戊醇和苯乙醇的含量,能夠為葡萄酒帶來明顯的花香味。

2.3.3 酸類化合物

酸類物質能夠增加葡萄酒香氣的復雜性,其部分物質可以賦予葡萄酒果香、奶酪和脂肪等的風味[21]。所檢測到的10種酸類物質中,對照組中異丁酸和己酸的OAV>1,增加了酒體中異味,但在各處理組中均低于閾值,能夠增加酒樣香氣復雜性,降低不良風味的影響。

2.3.4 萜烯類化合物

萜烯類為葡萄酒提供花香和果香,且閾值較低,因此較低含量的萜烯也會在一定程度上影響葡萄酒的香氣[22]。酒精發酵結束后,相比于對照組,處理組均能夠顯著增加萜烯類物質的總量,是對照組的1.60～7.18倍。SX2的香茅醇OAV>1，且含量顯著高于其他組,是對照組的6.78倍,能夠為葡萄酒帶來青草香、丁香花香和薔薇香等香氣。上述結果表明,SX2能夠增加香茅醇的含量,為葡萄酒帶來比較濃郁的花香味。

2.3.5 其他類化合物

其他類化合物相對含量少。處理組的其他類化合物總量高于對照組,增加了37.23%～112.23%。所檢測到的3種物質中,只有丁香酚的OAV>0.1,該物質具有丁香味和甘草香等香氣,僅在處理組中被檢出。

2.4 主要香氣化合物的主成分分析

如圖5-a所示,2個主成分(PC1和PC2)分別占總體方差的56.71%和26.29%,二者累計貢獻率達到了83.00%。PC1主要反映了醇類和酸類的香氣物質信息,PC2主要反映了酯類和萜烯類的香氣物質信息。由圖5-b可知,根據不同接種方式的葡萄酒發酵特性,可以將其聚為3類。其中SX2位于PC2的正向端,與辛酸乙酯(A6)、癸酸乙酯(A11)、甲酸苯乙酯(A18)、月桂酸乙酯(A13)、正戊醇(B11)和香茅醇(D1)等物質的相關性強,主要為葡萄酒香氣貢獻了比較濃郁的花香和果香。CK位于PC1正向端,與乙酸異戊酯(A3)、辛酸甲酯(A5)、癸酸甲酯(A10)、硬脂酸乙酯(A7)、壬酸乙酯(A9)、1-壬醇(B7)、庚醇(B5)、己酸(C5)、異丁酸(C3)和3-羥基月桂酸(C2)等物質有密切的聯系,主要為葡萄酒香氣貢獻了果香和花香,但同時也增加了葡萄酒的不良風味。SX1、SX3和SX4位于PC1和PC2的負向端,說明這幾種接種方式釀造的葡萄酒香氣特征差,不適合用于高質量葡萄酒的釀造。通過主成分分析,可以看出不同間隔天數的順序接種處理與對照組之間有較大的香氣差異,其中SX2能夠在一定程度上增加葡萄酒的香氣。

a中A1～A18為酯類物質;B1～B17為醇類物質;C1～C10為酸類物質;D1～D4為萜烯物質a-因子載荷圖；b-樣品分布圖圖5 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖和樣品分布圖Fig.5 Loading plot and score plot from principal component analysis of volatile aroma compounds

2.5 感官分析

對供試酒樣進行感官分析(圖6),各試驗組在顏色、甜度、余味和優雅度方面的得分無明顯差異。在口感方面,各處理組的酸度得分略低于對照組,SX2的得分略低于其他3個處理組,表明SX2的酒樣降酸效果明顯。

圖6 感官分析雷達圖Fig.6 Radar map of sensory analysis

在香氣方面,SX2和對照組之間的濃郁度沒有顯著差異,SX1、SX3和SX4的濃郁度略低于對照組,且SX1、SX3和SX4之間的濃郁度無差異,這與香氣化合物主成分分析的結果一致,處理組的香氣典型性略高于對照組,SX1、SX2和SX3的香氣典型性略高于SX4,表明S.pombe和釀酒酵母順序接種方式能夠增加葡萄酒的典型性。

在整體評分方面,SX2酒樣的分值略高于其他供試酒樣,具有良好的口感和較為濃郁的花香和果香。

3 結論

粟酒裂殖酵母與商業釀酒酵母分別以間隔6、8、10、12 d順序接種方式發酵‘黑比諾’干紅葡萄酒,對蘋果酸的降解能力顯著高于酒酒球菌,間隔8 d的接種發酵方式降解蘋果酸的能力顯著高于6、10、12 d的接種發酵；其次,間隔8 d的順序接種發酵與商業釀酒酵母單獨接種并經過蘋果酸乳酸發酵的酒樣相比能夠增加月桂酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、正戊醇、苯乙醇和香茅醇的含量,對葡萄酒花果香氣具有積極影響,能夠在一定程度上提升‘黑比諾’干紅葡萄酒的感官品質。