外源褪黑素對鹽脅迫下單針藻Monoraphidium sp.QLY-1油脂合成的影響

師中迪,宋雪婷,余旭亞

(昆明理工大學 生命科學與技術學院,云南 昆明,650500)

化石燃料過度使用導致的土地坍塌、溫室效應及環境污染問題日益嚴重,開發新型能源成為近年來研究的熱點[1]。生物柴油具有碳中和、閃點高、可再生等優點,被視為化石能源的理想替代品。而微藻因其結構簡單、光合效率高且生長周期短等優勢,被視為生物柴油的第三代原料[2]。但在傳統養殖條件下,油脂產率低、生產成本高等問題限制了微藻生物柴油的商業化進程[3]。

微藻的生物量積累與油脂合成受諸多環境因素影響。強光、缺氮、高鹽及重金屬離子等非生物脅迫條件被證明可直接促進微藻油脂的合成[4]。在諸多脅迫條件中,鹽脅迫被證明是促進微藻產油的有效方式[5-6]。另外,植物激素可調控微藻生物量的積累和代謝物的合成[7-8]。近期研究表明,在非生物脅迫條件下,植物激素能夠通過調節氧化應激反應來促進油脂合成[9-10]。因此,鹽脅迫聯合植物激素可能是促進微藻油脂產率的有效策略。

褪黑素(melatonin,MT),是一種具有抗氧化活性的內源性植物激素,可以消除活性氧(reactive oxygen species,ROS)、提高植物抗脅迫能力等[11-12]。而這些作用近似于黃腐酸,在非生物脅迫下黃腐酸被證明可以促進微藻的油脂含量[13]。由此推測,鹽脅迫下,外源添加 MT可能會進一步促進微藻中油脂的合成。

本實驗探索了MT對鹽脅迫下富油微藻單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1油脂合成及相關生理生化指標的影響,并探討了MT對胞內ROS含量及抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione,GSH)活性的影響,分析了外源MT調控藻細胞中ROS水平和油脂合成之間的關系,為促進微藻產油提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1由本實驗組篩選、保存；BG-11培養基購自青島海博生物技術有限公司；植物激素(褪黑素)，生工生物工程有限公司；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒，寶 (TaKaRa) 生物工程(大連)有限公司；活性氧(reactive oxygen species,ROS)測定試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒,南京建成生物技術有限公司。本文所用試劑均為分析純級，鼎國試劑公司。

1.1.2 儀器與設備

分析天平(FA2004 N),上海箐海儀器有限公司；恒溫(恒濕)振蕩搖床(TS-2011GZ),上海百典儀器設備有限公司；高速離心機(5804R),Eppendorf；滅菌鍋(LDZX-50KBS)上海申安醫療器械廠；紫外可見分光光度計(Ultrospec 2100 pro),Amersham Biosciences；真空冷凍干燥機(FD5-12),上海一恒科學儀器有限公司；qPCR儀(ABI-7500),江蘇天瑞精準醫療科技有限公司；超凈工作臺(VS-840-1),上海博迅醫療生物儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微藻培養

采用BG-11培養基,添加葡萄糖至質量濃度為10 g/L,將單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1接種于含有250 mL培養基的500 mL錐形瓶中,用搖床(溫度25 ℃,轉速150 r/min)異養培養11 d至對數期末端。將異養種子液接種到含有20 g/L NaCl的BG-11培養基(初生物量約為0.9 g/L),作為對照組；同時添加MT(1、10、100 μmol/L)作為實驗組,在搖床中培養3 d,光強30 μmol/(m2·s)、溫度25 ℃、轉速150 r/min,,每組設置3個平行樣。

1.2.2 生物量和油脂含量的測定

取10 mL的培養液(V),5 000 r/min離心10 min后去除上清液并收集生物質,放于真空冷凍干燥機48 h,稱取干藻粉質量(m1),按公式(1)計算生物量：

(1)

微藻油脂含量的檢測采用BLIGH等[14]的方法。向研缽中加入3 mL氯仿-甲醇溶液(體積比為2∶1)來提取油脂,在150 r/min搖床中晃動提取30 min,5 000 r/min離心10 min,取上清液。重復以上步驟2～3次,將上清液移至預先稱質量的管(m2)中。將管放置于40 ℃干燥箱中處理至質量恒定(m3),按照公式(2)計算油脂含量：

(2)

1.2.3 碳水化合物和蛋白質的測定

按照BERGES等[16]的方法提取并測定總蛋白的含量。根據MA等[17]的方法測定總碳水化合物含量。

1.2.4 油脂合成相關基因表達分析

采用TRIzol法提RNA,用逆轉錄試劑盒合成cDNA,具體操作參考CHE等[18]的方法。

以cDNA為模板,利用TB Green熒光染料,通過熒光定量 PCR 儀進行RT-PCR擴增,具體步驟參照ZHAO等[15]的方法。酶基因熒光定量引物me和accD序列參照文獻[9]。依據擴增曲線,根據2-△△T法計算各基因相對表達量[19]。

1.2.5 ROS和GSH的測定

ROS和GSH的測定,按照試劑盒說明書進行測定。

1.2.6 脂肪酸組成檢測

向提取的油脂中加入2 mL 體積分數為3%的 硫酸-甲醇(V∶V=3∶97)混合溶液,在70 ℃水浴中回流4 h進行脂肪酸甲酯化,加入2 mL正己烷振動提取4 h,取正己烷相進行氣相色譜-質譜分析[15]。

1.3 數據處理

試驗均設置3個平行樣,數據表示為平均值±標準差,通過SPSS 19.0軟件中ANOVA分析實驗數據。最小顯著性差異進行多重比較,檢驗試驗的組間差異。*P<0.05表示差異顯著,**P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與討論

2.1 鹽脅迫下MT對單針藻QLY-1細胞生長的影響

在鹽質量濃度20 g/L時,測定了不同濃度MT下單針藻QLY-1的生長情況。如圖1所示,所有組的生物量在3 d的培養時間中都有所增加。在20 g/L NaCl作用下,微藻生物量從1.05 g/L下降到0.96 g/L,比對照組降低了9.14%。另外,10 μmol/L MT單獨處理對微藻的生物量沒有顯著影響。在鹽脅迫下,濃度1～100 μmol/L的MT處理對單針藻QLY-1的生長情況也沒有顯著影響。LI等[7]也發現1～100 μmol/L的MT處理對單針藻QLY-1的生物量影響不具顯著性。因此,可初步斷定,低濃度(<1 mmol/L)的MT處理對單針藻QLY-1生物量不會造成顯著影響。此外,DING等[10]發現10 μmol/L MT處理會抑制雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)在高光和氮缺陷條件下的細胞生長,但可顯著提高蝦青素的積累量。在植物中,MT可以通過提高光合作用效率、消除ROS、提高抗氧化系統酶活性等方式來降低不良環境帶來的氧化損傷,提高種子的發芽率和幼苗生長速率[20,31]。

圖1 鹽脅迫下不同濃度MT對單針藻QLY-1生物量的影響Fig.1 Effect of MT concentrations on the biomass of Monoraphidium sp.QLY-1 under salinity stress

而在非生物脅迫下,外源褪黑素可能更多地參與調控微藻中次級代謝產物的合成。此外,響應MT的分子串擾網絡需要進一步的研究。

2.2 鹽脅迫下MT對單針藻QLY-1油脂積累的影響

如圖2所示,培養過程中,微藻油脂含量逐漸上升,并在第2天達到峰值。20 g/L NaCl 脅迫下,單針藻中油脂含量最大值由37.65%提高到42.92%。微藻在鹽脅迫下大量積累油脂可能歸因于NaCl處理對藻細胞造成氧化脅迫及ROS積累,是微藻在滲透壓增加下為保持細胞流動性和完整性的一種適應性機制[32]。10 μmol/L MT聯合20 g/L NaCl處理下的微藻油脂積累量達到最大(51.74%),相較于對照組(37.65%)、10 μmol/L MT處理組(45.76%)及20 g/L NaCl處理組(42.93%)分別提高了37.42%、13.07%和20.52%,并且在鹽脅迫下其他MT處理組油脂含量也有不同程度的提升。上述結果顯示,MT能夠與NaCl產生協同效應,進一步提高單針藻QLY-1在鹽脅迫下的油脂積累。另外,近期研究顯示,外源添加MT能夠促進缺氮條件下單針藻QLY-1的油脂合成[21]。由此可知,在非生物脅迫下,外源添加MT可進一步提高微藻中油脂的積累。因此,選取濃度為10 μmol/L MT進行單針藻QLY-1在鹽脅迫下油脂合成機理的進一步研究。

圖2 鹽脅迫下不同濃度MT對單針藻QLY-1油脂積累的影響Fig.2 Effect of MT concentrations on the lipid content of Monoraphidium sp.QLY-1 under salinity stress

2.3 鹽脅迫下MT對單針藻QLY-1生理生化指標的影響

微藻通過光合作用固定的碳可用于合成能量物質,如脂質、蛋白質和碳水化合物。在外源MT處理下,微藻中碳水化合物量逐漸下降,并在培養周期的最后1 d低于對照組。同時,在培養過程中,MT的添加抑制了鹽脅迫下的蛋白質含量。類似地,在光誘導下,MT處理后單針藻細胞中碳水化合物含量相比于對照顯著下降[7]。另外,SONG等[8]的研究指出,在植物激素獨腳金內酯處理下,單針藻QLY-1中油脂含量顯著提高,而碳水化合物和蛋白含量相較于對照組顯著下降。蛋白質含量的降低,可能因為MT誘導的藻細胞膜上蛋白質發生降解[23]。因此,MT可能通過參與微藻中蛋白質和碳水化合物的降解來改變碳代謝流,從而促進油脂的積累。

a-碳水化合物；b-蛋白質圖3 鹽脅迫下MT對單針藻QLY-1碳水化合物和蛋白質含量的影響Fig.3 Effect of MT on the carbohydrate and protein contents of Monoraphidium sp.QLY-1 under salinity stress

2.4 鹽脅迫下MT對單針藻QLY-1油脂合成相關基因的影響

蘋果酸在NADP依賴型蘋果酸酶(malic enzyme，me)的催化下發生不可逆的脫羧反應，產出丙酮酸、NADPH和CO2，從而參與微藻中多種代謝途徑，如油脂合成及光合作用。因此，me并被認為是脂肪酸合成過程中的關鍵酶[24]。乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)的β碳基轉移酶(beta-carboxyltransferase，accD)編碼ACCase的β亞基，而ACCase催化乙酰輔酶A(acetyl-CoA)生成丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)，是脂肪酸合成的第一步反應。10 μmol/L MT誘導對me和accD基因相對表達量的影響如圖4所示。me和accD基因分別在第2天和第3天相對表達量達到最高,是鹽脅迫組的1.75和1.40倍。有研究發現,通過過表達accD基因能夠顯著增強大腸桿菌(Escherichiacoli)中脂肪酸的合成[24]。此外,多個研究證明[8,13,25],微藻中me和accD基因的轉錄水平與脂質合成情況正相關。結果顯示,MT能夠通過上調油脂合成相關基因的表達從而提高微藻的產油能力。

圖4 鹽脅迫下MT對單針藻QLY-1油脂合成相關基因的影響Fig.4 Effect of MT on the lipogenic genes of Monoraphidium sp.QLY-1 under salinity stress

2.5 鹽脅迫下MT對單針藻QLY-1細胞內ROS、GSH的影響

ROS作為重要的第二信使,關聯多種代謝途徑及免疫反應,并在油脂合成過程中扮演重要角色,其信號傳導途徑是近年來的研究熱門[26]。圖5顯示,在高鹽條件下,ROS水平隨培養時間逐漸上升。而MT處理顯著地抑制了ROS水平,在第3天僅是鹽脅迫組的55.95%。GSH作為細胞中關鍵的抗氧化劑,對減輕非生物脅迫引起的氧化應激反應起重要作用[27]。與ROS變化水平一致,在高鹽條件下,GSH含量逐漸上升。而MT顯著抑制了GSH含量,在培養第3天僅是鹽脅迫對照組的74.04%。

a-ROS；b-GSH圖5 鹽脅迫下MT對單針藻QLY-1 ROS和GSH水平的影響Fig.5 Effect of MT on the levels of ROS and GSH in Monoraphidium sp.QLY-1 under salinity stress

MT作為一種有效的抗氧化劑,能夠有效地清除胞內由于缺氮引起過量積累的ROS以及細胞損傷[7]。此外,MT可通過提高紅球藻中抗氧化酶活性從而緩解由高光照及缺氮導致的氧化損傷[28]。因此,外源MT能夠有效地降低藻細胞內的ROS含量,使微藻細胞避免因環境脅迫造成的氧化損傷,從而保持細胞的正常代謝。

2.6 鹽脅迫下MT對單針藻QLY-1脂肪酸組成的影響

油脂的脂肪酸組成是衡量油脂是否作為生物柴油原料的重要指標。與鹽脅迫處理組相比, 1 μmol/L MT處理組中,C16∶0值有所下降而C18∶1含量上升,從而使飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)含量上升,單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)含量下降,而多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)含量幾乎不變(表1)。相反地,10 μmol/L MT處理下的C18∶1和C20∶1含量分別提高了29.91%和94.85%,而C18∶2下降了16.03%,從而使得實驗組中MUFA含量相比于對照組升高了27.76%,PUFA含量下降了11.89%,SFA含量幾乎不變。100 μmol/L MT處理組的脂肪酸變化與10 μmol/L MT處理組相似。提高脂肪酸中MUFA的含量,尤其是C18∶1,可以提高生物柴油的質量[29]。此外,MT處理下脂肪酸的不飽和度(degree of unsaturation,DU)與對照組差異不顯著,且均小于137(歐盟生物柴油標準UNE-EN14214)。因此,基于DU值和MUFA含量分析,微藻油脂可作為生產生物柴油的原料,而通過添加適宜濃度的MT可獲得更具有市場價值的生物柴油。

與一些典型的可作為生物柴油生產原料的植物油相比,單針藻QLY-1所產油脂脂肪酸具有更高的C16∶0和C18∶3值以及更低的C18∶1含量,這就使得藻油的SFA值高于植物油,而PUFA含量和DU值較低。脂肪酸的SFA值越高則碳鏈越長,同時具有更高的十六烷值(cetane number,CN)[30]。柴油的CN值越高表明燃燒的發火性能好,燃燒均勻且滯燃期短。同時,偏低的DU值和更長的脂肪酸碳鏈使微藻油脂比傳統植物油具有更好的穩定性。因此,單針藻QLY-1可作為一種具有市場前景的生物柴油生產原料。

2.7 物料成本分析

上述結果表明,植物激素MT對鹽脅迫下培養的微藻的適應性和脂質積累有一定的改善作用。在不考慮人工成本情況下,根據本文數據進行產量轉化,表2列出了對照組、鹽脅迫及鹽脅迫聯合MT三種培養模式下微藻油脂的物料生產成本。顯然,在BG-11培養基中添加NaCl和MT用于微藻油脂生產比單純使用BG-11培養基更加經濟,成本僅為BG-11的80.40%。這為植物激素耦合非生物脅迫進行藻類生物燃料生產的概念奠定了基礎。此外,以MT聯合NaCl生物質生產物料成本為例,生產1 kg微藻生物質需要158.88元,而BG-11培養基成本為156.38元,占總物料成本的98.43 %。由此可見,培養基的成本是限制微藻生物能源大規模發展的重要因素,因此,尋求廉價替代培養基對微藻生物能源發展進程至關重要。

表1 不同培養條件下單針藻與典型生物柴油生產原料的植物油的脂肪酸組成比較Table 1 Comparison of the fatty acid profile in Monoraphidium sp.QLY-1 under different growth conditions and vegetable oils typically used to produce biodiesel

表2 不同培養條件下單針藻生物質和油脂物料成本分析比較Table 2 Comparison of the material cost analysis of Monoraphidium sp.QLY-1 biomass and lipid production under different growth conditions

3 結論

外源MT上調了油脂合成相關基因的表達量,進一步提高了單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1在鹽脅迫下的油脂含量。在MT誘導下,胞內蛋白質和碳水化合物含量下降。且MT能夠通過改變GSH含量,有效地去除鹽脅迫下胞內過量積累的ROS。隨著MT誘導微藻脂質合成機制的進一步研究,外源添加MT聯合鹽脅迫有望成為提高微藻油脂合成的有效策略。