龍眼核多酚對蛋白非酶糖基化的抑制及機制研究

鄭子鋒,孫培冬*

1(食品膠體與生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)2(江南大學 化工與材料工程學院,江蘇 無錫,214122)

自1981年MONNIER提出體內蛋白的非酶褐變可能與衰老、相關病理有關[1],這一“非酶糖基化衰老假說”[2]揭示了非酶糖基化反應產物是衰老的生物標志之一[3]。蛋白結構中游離的氨基與還原糖的羰基在非酶的條件下,經過縮合、重排、降解、氧化等復雜的反應,生成不可逆程度非常高的晚期糖化產物(advanced glycation end-products,AGEs)。這些AGEs的形成除了可能導致蛋白本身的功能喪失,還能通過與其受體結合使NF-κB激活,加重機體的氧化應激和炎癥反應,它們在細胞和細胞間基質中的積累導致細胞、組織和器官的代謝紊亂,對多種慢性病(糖尿病、動脈粥樣硬化等)具有致病作用[4-5]。因此尋找可以抑制蛋白糖基化的物質具有重要意義。

氨基胍(amino guanidine,AG)是實驗室中最常用的標準抗糖化劑,但它在臨床測試中與機體產生不良反應而被中止應用[6]。據報道,許多天然物質具有抗糖化性能,植物多酚在體外實驗中表現出較好的抗糖化活性[7-8],多酚通過與羰基結合[9],或者與氨基結合[10],以及抗氧化和螯合金屬離子[11]等機制抑制AGEs產生。雖然多酚抑制非酶糖基化的一些機制已經被報道,但是多酚對蛋白質糖化各階段的影響尚不清晰。

龍眼核中含有多種多酚類物質,包括柯里拉京、訶子鞣質、地榆酸內酯、鞣花酸等多種化學成分[12-13]。本課題組已對龍眼核多酚進行分離和純化,發現龍眼核多酚有良好的抗氧化性,與常用抗氧化劑抗壞血酸相當[12]。本研究通過檢測具有熒光特性的AGEs和非交聯AGE羧甲基賴氨酸(Nε-(carboxymethyl) lysine,CML)的含量,對龍眼核多酚抑制蛋白非酶糖基化效果進行評價,并利用不同的反應模型對龍眼核多酚抑制蛋白非酶糖基化的作用機制進行較為完整的分析,為龍眼核多酚的抗糖基化功能研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

龍眼核多酚(乙酸乙酯相),實驗室自制,經Folin-酚比色法檢測總酚含量為663.5 mg/g[12]；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,≥96%)、氨基胍鹽酸鹽(≥98%)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,≥99%)、丙酮醛(methylglyoxal,MGO,40%水溶液)、N(α)-Boc-L-精氨酸(98%),阿拉丁；無水葡萄糖、冰乙酸、氯化硝基四氮唑藍(nitrotetrazolium blue chloride,NBT),均為分析純,鄰苯二胺(o-phenylenediamine,OPD)、乙二醛(glyoxal,GO,40%水溶液),化學純,甲醇(≥99.9%,色譜純),國藥集團化學試劑有限公司；牛羧甲基賴氨酸(Nε-(carboxymethyl) lysine,CML)試劑盒,上海聯邁生物工程有限公司；Proclin 300,美國Rohm & Haas公司。

超濾管,美國Millipore公司；ME204E型電子分析天平,Mettler Toledo儀器(上海)有限公司；Infinite M200 PRO酶標儀,瑞士Tecan集團；CARY Eclipse熒光分光光度計,美國Varian有限公司；1525u高效液相色譜儀,美國Waters公司；TG16高速離心機,上海盧湘儀離心機有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 體外蛋白非酶糖基化模型的建立

參考PENG等[14]的方法,建立BSA-葡萄糖反應模型。用0.2 mol/L pH 7.4的磷酸緩沖液(phosphate buffered solution,PBS, 0.2% proclin 300作為防腐劑)配制30 mg/mL BSA、300 mg/mL葡萄糖溶液、60 μg/mL AG溶液。用DMSO溶解龍眼核多酚配制成質量濃度為20 mg/mL的溶液,然后用PBS稀釋龍眼核多酚溶液至15、60、120、180、240 μg/mL。在超凈工作臺上將BSA、葡萄糖和龍眼核多酚溶液過0.22 μm濾膜,并等體積混合。將龍眼核多酚替換成60 μg/mL AG作為陽性對照,未加龍眼核多酚或AG作為陰性對照,將葡萄糖溶液替換成PBS溶液作為對照。在37 ℃恒溫培養箱中培養10 d,分別在1、3、5、7、10 d取培養液進行Amadori產物、二羰基化合物含量、熒光性AGEs測定。

1.2.2 Amadori產物測定

采用ZHANG等[15]的方法,將0.2 mL培養液和0.8 mL 0.3 mmol/L NBT試劑加入到2 mL碳酸鹽緩沖液(100 mmol/L,pH 10.1)中,在40 ℃下反應1 h,用酶標儀在530 nm波長處測定OD值。

1.2.3 二羰基化合物含量測定

采用柱前衍生高效液相色譜法[16]對GO、MGO和3-脫氧葡萄醛酮(3-deoxyglucosone,3-DG)進行測定。取1 mL培養液于30 kD超濾管,以4 500 ×g離心12 min。取外管濾液900 μL,加入20 μL乙酸和30 μL 100 mmol/L OPD液在樣品瓶中混合,充氮氣,在40 ℃下衍生反應80 min。以GO、MGO濃度(x,μmol/L)與峰面積(y)建立GO、MGO的標準曲線,分別為y=8 221.8x+45.8,R2=0.999 8,y=7 556.6x+129.16,R2=0.998,根據標準曲線計算GO、MGO含量。通過液質聯用,確定3-DG出峰位置[17],對3-DG用峰面積進行含量相對比較。高效液相色譜條件為：

色譜柱：WondaCract ODS-2 C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱溫25 ℃；流速0.8 mL/min；進樣量10 μL；紫外檢測器：313 nm；流動相：A相為體積分數10%的甲醇水溶液(0.2%乙酸),B相為甲醇(0.2%乙酸)；洗脫條件：0 min,90%A；12～15 min,0%A；16～20 min,90%A。

1.2.4 熒光性晚期糖基化產物測定

采用PAGEON等的方法[18],利用熒光分光光度計,在激發/發射波長(ex/em)370/440 nm、335/385 nm對培養液中熒光值進行測定,并按公式(1)計算龍眼核多酚或AG對熒光性AGEs的抑制率。

(1)

式中：A1,陰性對照熒光值；A0,只含有BSA組的熒光值；A2,加入龍眼核多酚或AG組熒光值;A3,加入龍眼核多酚或AG組相應對照組的熒光值。

1.2.5 非交聯晚期糖基化產物CML測定

采用酶聯免疫技術(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)對培養液中CML的含量進行測定[19]。往包被CML抗體的微孔加入樣品(或標準品),再與辣根過氧化物酶標記的CML抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物。洗滌后加入TMB顯色,用酶標儀在450 nm波長下測定OD值,根據標準曲線計算CML含量。以CML含量(x,μg/g protein)與OD值(y)建立CML標準曲線,為y=0.080 99x+3.07×10-18,R2=0.999 9。

1.2.6 捕獲MGO、GO能力測定

用PBS溶液將MGO或GO溶液進行稀釋,并與龍眼核多酚溶液混合。在混合液中,當龍眼核多酚終質量濃度為80、60、40 μg/mL時,MGO濃度為1.100 mmol/L,GO為1.801 mmol/L；當龍眼核多酚終質量濃度為20、5 μg/mL時,MGO濃度為0.304 mmol/L,GO為0.446 mmol/L。在37 ℃下恒溫培養1 d后測定MGO、GO的含量,按公式(2)計算龍眼核多酚的捕獲能力。

(2)

式中：c0,初始時測定的MGO或GO濃度；c1,1 d后測定的MGO或GO濃度。

1.2.7 Amadori反應模型的建立

用PBS配制30 mg/mL BSA溶液和900 mg/mL葡萄糖溶液,與PBS等體積混合,在37 ℃培養5 d制備Amadori產物。利用超濾管分離除去反應混合液中的葡萄糖、二羰基化合物,然后將截留蛋白轉移到相同體積的PBS溶液中。取4 mL蛋白溶液于培養瓶中,加入80 μL 2 mg/mL龍眼核多酚和90 μL PBS作為未加乙酸體系實驗組,加入80 μL 2 mg/mL龍眼核多酚和90 μL乙酸作為乙酸體系實驗組,加入170 μL PBS或者80 μL PBS和90 μL乙酸作為對照組。在37 ℃下培養7 d,在第4、7天時測定它們的熒光值和二羰基化合物含量(峰面積),并按公式(1)計算對熒光性AGEs的抑制率。

1.2.8 MGO反應模型的建立

建立MGO-精氨酸(arginine,Arg),MGO-BSA反應體系。在MGO-BSA體系中,將1.5 mL 30 mg/mL BSA溶液與1.5 mL 120 μg/mL龍眼核多酚溶液混合,在37 ℃培養1 h,然后加入1.5 mL MGO(約3.924 mmol/L),將PBS溶液替換龍眼核多酚作為空白對照,將PBS溶液替換MGO作為對照組。在MGO-Arg體系中,將含有N(α)-Boc-L-精氨酸(10.5 mmol/L)的PBS溶液替換BSA,其他實驗條件不變。在37 ℃培養2 d,在6、21、26、48 h利用熒光分光儀測定(ex/em)320/420處的熒光值,在48 h測定各組培養液中的MGO含量,并按公式(1)計算對熒光性AGEs的總抑制率。

2 結果與討論

2.1 Amadori產物含量測定結果分析

Amadori產物是蛋白非酶糖基化反應第一階段的產物,它是由蛋白上游離的氨基或者N端氨基與還原糖之間形成的亞胺中間體(席夫堿)經過Amadori重排生成的。從圖1可見,陰性對照培養至7 d時,體系中Amadori產物含量不斷升高,添加有不同濃度的龍眼核多酚、AG的體系與陰性對照中Amad-ori產物含量基本相等。第10天時,陰性對照中Amadori產物水平趨于平穩,而龍眼核多酚和AG略高于陰性對照。所以龍眼核多酚和AG不能抑制蛋白非酶糖基化的第一階段。

圖1 不同質量濃度龍眼核多酚對Amadori產物含量的影響Fig.1 Effects of different concentration of longan seed polyphenols on the content of Amadori products

2.2 二羰基化合物含量的測定

糖基化反應的第二階段是羰基中間體的形成。第一階段物質葡萄糖、席夫堿和Amadori產物能夠經過氧化或非氧化降解生成反應活性遠高于葡萄糖的二羰基化合物,主要有GO、MGO、3-DG、D-葡萄酮醛等。它們直接作用于蛋白中游離氨基,具有高度生理損傷危害,被稱為羰基應激,所以降低二羰基化合物的含量能夠有效地抑制蛋白的非酶糖基化反應,減少AGEs的產生。在BSA-葡萄糖體系培養期間3種二羰基化合物的水平如圖2所示,陰性對照中GO和MGO先增加后趨于穩定,各濃度龍眼核多酚體系的GO和MGO含量基本都低于陰性對照GO和MGO含量的30%,處于較低的水平,即便是低濃度龍眼核多酚對GO和MGO水平都有著很明顯的抑制作用。GO和MGO在AG體系中的水平高于陰性對照。圖2-c顯示,3-DG水平隨著培養時間不斷增強,加入龍眼核多酚組低于陰性對照和AG組,并且龍眼核多酚對降低3-DG水平呈現濃度依賴性。

a-GO;b-MGO;c-3-DG圖2 不同質量濃度龍眼核多酚對二羰基化合物含量的影響Fig.2 Effects of different concentration of longan seed polyphenols on the content of dicarbonyl compounds

2.3 熒光性AGEs抑制測定

在糖基化反應后期,可有多種途徑形成結構復雜的AGEs。其中一種途徑是Amadori產物直接經過氧化或非氧化、重排,另一種途徑是二羰基化合物直接與蛋白上賴氨酸殘基和精氨酸殘基反應。這2個途徑最終都可以形成熒光性AGEs,比如Amadori產物直接氧化降解可以形成戊糖素(pentosidine,ex/em,335/385 nm),MGO可以與2個賴氨酸反應形成具有熒光交聯特性的MOLD(methylglyoxal derived lysine dimer)等。因此,采用不同的激發波長可以檢測多種熒光性AGEs。由圖3可知,龍眼核多酚對熒光性AGEs有著強烈的抑制作用,并且呈現濃度依賴性。圖3-a中,不同濃度的龍眼核多酚均表現出較好的抑制效果,優于AG,在第5天之后,低濃度的龍眼核多酚呈現抑制率下降的情況。圖3-b中,最低質量濃度5 μg/mL的龍眼核多酚添加量就能達到60%的抑制效果,遠遠大于AG,并且龍眼核多酚對于在(ex/em)335/385 nm體現的熒光性AGEs表現出穩定的抑制作用,龍眼核多酚培養10 d后就能穩定抑制一些熒光性AGEs生成。

a-(ex/em) 370/440 nm;b-(ex/em) 335/385 nm圖3 不同質量濃度龍眼核多酚和AG對熒光性AGEs的抑制Fig.3 Inhibition of fluorescence AGEs with different concentrations of longan seed polyphenols and AG

2.4 CML含量測定

CML是從人體分離鑒定的第一種AGE,廣泛存在于各個組織的糖基化蛋白中,是一種非交聯AGE,主要由Amadori產物氧化降解以及GO與蛋白上賴氨酸殘基反應這2個途徑形成。圖4顯示,加入龍眼核多酚和AG能明顯抑制體系中CML的生成,CML的抑制率似乎與龍眼核多酚的濃度沒有相關性,可能與體系GO的水平有關,圖2-a顯示,不同濃度的龍眼核多酚均能保持很低的GO水平,從而抑制CML的生成。

圖4 不同質量濃度龍眼核多酚對CML含量的影響Fig.4 Effects of different concentration of longan seed polyphenols on the content of CML

2.5 龍眼核多酚捕獲GO、MGO醛能力測定

多酚在堿性條件下能夠通過苯環上的親電取代反應捕獲二羰基化合物[15]。圖5顯示,龍眼核多酚具有較好的清除率,且龍眼核多酚對GO的清除率更強,40、60、80 μg/mL的龍眼核多酚對GO清除率均在70%以上,這可能是因為GO在溶液中多以水合單體、二聚體等需要緩慢轉化為游離的形式存在[19],使各質量濃度龍眼核多酚的游離GO濃度基本相同。在捕獲能力實驗中,龍眼核多酚表現出了較強的和MGO和GO的結合能力。

圖5 不同濃度多酚捕獲MGO(a)和GO(b)能力測定Fig.5 The ability to capture MGO (a) and GO (b) of polyphenols at different concentrations

2.6 Amadori產物反應模型結果分析

通過超濾除去培養液中的葡萄糖和二羰基化合物,截留含有Amadori產物的蛋白,建立Amadori產物反應模型,研究龍眼核多酚對糖基化中后期反應的影響。調節溶液pH能夠影響多酚捕獲二羰基化合物的能力,通過在Amadori反應模型中加入乙酸,使得龍眼核多酚捕獲羰基能力消失[15]。建立Amadori乙酸體系能夠研究龍眼核多酚對Amadori產物生成二羰基化合物的影響以及對由Amadori產物直接生成熒光性AGEs的影響。Amadori產物能夠在氧化條件下發生斷裂形成GO,以及經非氧化重排、水解形成3-DG[20]。由圖6可知,龍眼核多酚能夠抑制Amadori產物裂解產生GO,但是對MGO和3-DG基本沒有影響,所以龍眼核多酚能夠抑制Amadori產物氧化降解形成GO。龍眼核多酚除了通過捕獲GO,還可通過抑制Amadori產物氧化降解來降低GO的含量。

圖6 乙酸體系中二羰基化合物水平測定Fig.6 Determination of dicarbonyl compounds in acetic acid system

圖7顯示,未加乙酸體系中,龍眼核多酚對在(ex/em)335/385、370/440 nm表現的熒光性AGEs抑制率分別為93%、47%,說明龍眼核多酚確實能夠在蛋白非酶糖基化中后期抑制熒光性AGEs的產生。在乙酸體系中,龍眼核多酚對在(ex/em)335/385、370/440 nm的熒光性AGEs抑制率分別為80%、45%。在Amadori產物反應模型中,可以由Amadori產物降解形成的二羰基化合物與氨基殘基反應或者Amadori產物直接形成AGEs。由于在乙酸體系中,龍眼核多酚不具有捕獲二羰基化合物能力,可能是其抗氧化性能抑制了部分Amadori產物經氧化、重排產生的熒光性AGEs。所以龍眼核多酚不僅能夠通過降低二羰基化合物含量,還能通過抗氧化性能直接抑制Amadori產物生成熒光性AGEs。

圖7 Amadori反應模型龍眼核多酚對熒光性AGEs抑制率Fig.7 Inhibition rate of longan polyphenols on fluorescence AGEs in Amadori reaction model.

2.7 MGO反應模型結果分析

圖8-a顯示,在培養0～6 h,Arg體系中的抑制率只有26.7%,而BSA體系中多酚抑制率有53%。隨著培養時間的增加,Arg體系多酚組中龍眼核多酚對MGO逐漸進行捕獲,降低了體系中MGO濃度,使得Arg體系中抑制率上升,并在50%穩定不變。圖8-b顯示，在26～48 h BSA體系中熒光值增加很快,說明熒光性AGEs大量生成。而對于這段時間而言,加入多酚組對熒光抑制率達到了80%左右。在MGO含量測定中顯示,培養2 d后,所有組中MGO基本反應完全。這些結果說明,在BSA體系中龍眼核多酚能更好地抑制熒光性AGEs生成。

a-兩體系龍眼核多酚對熒光性AGEs的總抑制率；b-各組熒光增長值圖8 MGO模型熒光性AGEs測定Fig.8 Determination of fluorescence AGEs in MGO model

實驗室制備的龍眼核多酚中含量最多的成分為柯里拉京[12],利用分子對接軟件,對柯里拉京與牛血清白蛋白進行分子對接。賴氨酸殘基和精氨酸殘基是蛋白糖基化反應中主要的反應位點。在分子盲對接中,BSA中有10個賴氨酸和6個精氨酸(Lys:106,131,159,187,204,221,294,431,439,465;Arg:194,196,217,335,336,435)通過氫鍵、范德華力和共軛作用直接與柯里拉京相互影響,還有一些賴氨酸與精氨酸與柯里拉京多酚的結合能較小,但也在多酚結合蛋白區域附近。結合圖8結果分析,龍眼核多酚很有可能是通過與蛋白相互作用,結合到蛋白分子區域里,當具有反應活性二羰基化合物靠近這些賴氨酸、精氨酸等反應位點時,能夠被多酚迅速清除,從而保護蛋白分子。

a-BSA與柯里拉京多酚盲對接所有方位;b-分子對接最小能量的二維視圖圖9 BSA與柯里拉京多酚分子對接Fig.9 Molecular docking between BSA and Coriolis polyphenols

3 結論

在BSA-葡萄糖反應模型研究中,龍眼核多酚和AG并沒有抑制第一階段Amadori產物的生成,龍眼核多酚能夠顯著降低體系中的GO和MGO的水平,對抑制3-DG的水平具有濃度依賴性。在抑制AGEs的測定中,龍眼核多酚能很好地抑制AGEs的產生,即使是5 μg/mL的低濃度龍眼核多酚,對(ex/em)335/385、370/440 nm的熒光性AGEs抑制率分別為62.4%和21.3%,對CML生成的抑制率為61.5%。通過Amadori產物反應模型不加乙酸體系中熒光AGEs的測定,龍眼核多酚確實能夠在非酶糖基化中后期抑制AGEs的生成。Amadori產物反應模型乙酸體系中測定的GO/MGO水平和捕獲羰基實驗表明,龍眼核多酚能夠通過抗氧化作用抑制GO的生成并具有很好的捕獲GO和MGO能力,來降低非酶糖基化第二階段反應中間產物二羰基化合物的水平。此外,Amadori產物反應模型乙酸體系的熒光AGEs的測定結果還表明,龍眼核多酚能抑制非酶糖基化第三階段中Amadori產物生成熒光性AGEs。通過比較MGO-BSA與MGO-Arg兩個體系并結合分子對接結果分析,龍眼核多酚能與蛋白相互作用,更加有效的保護氨基不受二羰基化合物的進攻。總之,龍眼核多酚能夠通過抗氧化作用和捕獲羰基能力,在糖化反應的中后期較好地抑制AGEs的產生,所以龍眼核多酚可用于功能性食品添加劑和化妝品抗糖化活性成分的開發。