伊氏線蟲真菌碳氮條件下的表型和毒力基因表達差異*

賀 然 王瑞珍 應 玥 曲良建 張永安

(1.中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所 國家林業和草原局森林保護學重點實驗室 北京 100091； 2.北京市植物園 北京市花卉園藝工程技術研究中心 北京 100093)

松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)病自1982年在我國首次發生以來，造成松樹(Pinusspp.)大量死亡，疫情不斷擴展蔓延，且近年來有不斷加重流行的趨勢(葉建仁, 2019)。松材線蟲病在亞洲和歐洲造成嚴重的生態和經濟損失，其重要致病因子是全球公認的檢疫性有害生物松材線蟲(Futai, 2013; Vicenteetal., 2012; 葉建仁, 2019)。因此，如果不能盡快地有效地防控松材線蟲病疫情，這一重大病害可能很快會在我國更大范圍內流行，每年將會引發數億株松樹死亡，造成難以管控和治理的生態災難(葉建仁, 2019)。目前我國對松材線蟲的防治手段主要有化學防治、物理防治、生物防治及綜合防治，但仍以化學防治為主，如使用化學藥劑久效磷、甲胺磷、阿維菌素等進行點滴注干，雖然可以取得較好的防治效果，但對環境造成破壞，而且易使線蟲產生抗性(蔡夢玲, 2019)。對松材線蟲直接的大規模生物防治還沒有典型實例，因此對松材線蟲開展生物防治急需進一步研究和突破(張鍇等, 2010)。

伊氏線蟲真菌(Esteyavermicola，EV)是松材線蟲的內寄生真菌，其產生的新月形孢子能夠侵染并穿透線蟲的角質層然后在松材線蟲的體腔內繁殖，在室內純培養條件下，24 h內90%的線蟲被EV黏附性的彎月狀孢子侵染，通常8～10天殺死所有的線蟲，從線蟲體內長出的菌絲形成彎月狀的孢子進入下一個侵染循環(Liouetal., 1999; Wangetal., 2008)，在松材線蟲的生物防治方面具有良好的應用前景(Liouetal., 1999)。雖然EV在室內具有良好的防治松材線蟲的效果，但在野外的防治效果卻不太理想，對感染的松樹需要數月的時間才能起到防治效果，而且需要松材線蟲入侵前數周至數月提前噴灑或者注射EV(Wangetal., 2017; 2018)。因此，亟需提高EV的生長速率、產孢能力和殺線蟲毒力，才能進一步提高EV的防治效果。目前主要通過馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)培養該真菌，菌株ATCC74485、CBS115803、CNU120806、NKF13222在PDA上生長一周菌落直徑分別為3.0～4.8、3.0～3.7、4.0～4.5和3.1～3.5 cm(茅裕婷等, 2020)。自然界中，線蟲真菌生存環境可獲得的氮濃度很低，因此，感染線蟲對這類真菌具有顯著益處，可以彌補氮源不足(de Freitas Soaresetal., 2018)。而目前，以氮源為培養基的研究未見報導。本研究首次以氮源培養EV，以對比在碳氮培養下生長速率的差異，并探究EV在不同培養條件下殺線蟲基因的表達差異，為明確EV在碳氮培養條件下的表達模式，提高EV的防治效果和以后大規模培養高毒力EV提供重要的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

伊氏線蟲真菌CBS115803，購于荷蘭菌物保存中心。

1.2 培養基

2種培養基配方如下： 碳源培養基(代號C，6個重復樣本分別編號為P1—P6)： 24 g PDB(BD公司)和10 g瓊脂溶于1 L雙蒸水； 氮源培養基(代號N，6個重復樣本分別編號為L1—L6)： 5 g酵母粉(OXOID公司)和10 g瓊脂溶于1 L雙蒸水。碳氮混合培養基(C+N，6個重復樣本)： 上述2種培養基分別減半溶于1 L雙蒸水中。

1.3 菌落生長、產孢量及菌落生長趨勢圖繪制

測量并記錄3種培養基的菌落直徑，計算每個處理的平均菌落直徑和標準差。菌落生長趨勢折線圖由ggplot2-R包繪制。

1.4 轉錄組樣品處理

分別將上述2種培養基配制固體C和N培養基，凝固后在培養基中放入已滅菌的尼龍膜(孔徑3 μm，賽多利斯Sartorius)，接種EV菌后于25 ℃培養7天。將長滿菌絲和孢子的尼龍膜用無菌鑷子取出，用超純水沖洗尼龍膜，再用無菌的吸水紙吸掉尼龍膜接觸培養基面的水分，而后將菌絲和孢子刮入2 mL無菌無核酸酶的干燥圓底離心管，迅速將樣品管放入液氮中保存，供RNA提取與測序。

1.5 RNA提取與測序

RNA提取采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒，按照操作說明書進行。通過瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染，使用NanoPhotometer spectrophotometer檢測RNA純度(OD260/280及OD260/230比值)，使用Agilent 2100 bioanalyzer精確檢測RNA完整性。測序完成后，經質控過濾獲得clean reads，然后使用HISAT2 v2.0.5將其定位到參考基因組(SRA database in NCBI under the accession SRP097009)(Wangetal., 2018)，基于基因模型注釋文件生成拼接連接的數據庫，并根據基因組的注釋文件獲得轉錄組功能注釋結果。文庫構建與RNA測序由諾禾致源科技股份有限公司采用Illumina測序完成。

1.6 基因表達水平定量和差異表達分析

采用當前最常用的每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取數(fragements per kilobase of exon model per million mapped fragements, FPKM)估計基因的表達量，獲得各樣本中基因表達水平。通過計算Pearson相關系數評估重復樣本相關性。使用DESeq2軟件(1.16.1)進行2個比較組合之間的差異表達分析。結合經FDR法校正后的P值(Padj)以及|log2FoldChange|作為顯著差異表達判斷的依據。用H-cluster方法對差異基因表達量取log2(FPKM+1)并中心化校正后進行聚類。差異比較采用C為對照組，N為試驗組，將差異表達基因劃分為上調基因和下調基因，即樣品N中的表達水平高于樣品C中的表達水平為上調基因，反之為下調基因。

1.7 實時定量PCR驗證

采用在線引物設計工具Primer3Plus(http:∥www.primer3plus.com/)設計基因特異性引物，采用R2(Fw: TCGTTGAGTAGACTCTGAATGCTG；Rv: AGCCAGATGTTCCACCCG)為內參基因(Llanosetal., 2015)。采用TransScript one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech，北京)試劑盒進行DNA清除和反轉錄。驗證的3個基因分別為ZGLK4627、novel315、ZGLK4572，所用的引物分別為CGATGCGATTGCCTCCTACT/AGTGCC AGAGATGGTGTTCG、CGCAGGGGAGACAAGATGTT/GGCAAAGCGTTTCTTGTCGT和GGCTGGATGGAGT CGTTTGA/TCGCCGGAGAGAGTGTTTTC。

2 結果與分析

2.1 碳氮培養下的表型

菌落形態上，N培養基菌落灰白色； C培養基則為暗綠色，菌落邊緣灰白色； C+N培養基白綠色(圖1)。生長速度上，N培養基的生長速度大于C培養基及C+N培養基(圖2)。孢子產量上，N培養基產孢量最小，而且N培養基上不產生桿狀孢子。C+N培養基上彎孢和桿孢均最多(圖3)。

圖1 3種培養基培養下的EV菌落形態Fig. 1 Morphology of EV colonies cultured in three mediums 左Left: N; 中Middle: C; 右Right: C+N; 上Up: 正面Front side; 下Down: 背面Back side.

圖2 3種培養基菌落生長趨勢Fig. 2 Growth trajectory on three culture media

圖3 3種培養基孢子產量Fig. 3 Spore yields on three culture media 誤差線上字母表示差異顯著性，相同字母表示在0.05水平無顯著差異。The letters above the error bars present the significance of the difference and the same letter indicates non-significant at P<0.05.

2.2 轉錄組測序數據質量、mapping及基因定量分析

為了研究EV在C培養基和N培養基下殺線蟲基因的表達情況，進行了2組轉錄表達的比較研究。每個樣品產生了超過63 M的clean reads，總堿基數超過8.9Gb，Q30(堿基識別出錯率小于1/1 000)占比超過93%。經過與EV基因組比對，97%的片段可定位到基因組上，其中比對到EV基因組唯一位置的片段數約96%～97%，比對到EV基因組多個位置的片段低于0.4%。從基因表達盒形圖可以看出，N培養條件下EV基因表達水平高于C培養條件下EV基因表達水平(圖4)。Pearson相關性分析表明，組內相關性大于0.9，組間相關性僅為0.5～0.6(圖5)，組間差異大于組內差異。

圖4 12個樣品表達水平Fig. 4 Expression level box plots of 12 samples

圖5 12個樣品相關性系數Fig. 5 Correlation coefficient graph of 12 samples

2.3 組間差異基因分析

在Padj(FDR)≤0.05且|log2FoldChange|≥0(即差異倍數≥2)作為顯著差異表達閾值這一條件下，N組相對C組顯著差異表達的基因共有7 138個，其中顯著上調的3 571個，顯著下調的3 567個(圖6)。在C、N組中共同表達的核心基因有7 560個， 在N組中特有表達的基因474個，在C組中特有表達的基因295個(圖7)，可見，N培養條件下表達的基因更豐富。在特有表達的基因中，N組表達的轉錄因子15個，是C組表達的轉錄因子的3倍(5個)。MFS家族、糖轉運蛋白(sugar_tr)和P450等基因在N組也高表達，在殺線蟲過程中起重要作用的枯草桿菌蛋白酶S8(Peptidase_S8)在N組特異性表達了3個，而在C組則沒有特異性表達。激酶(Pkinase)基因在N組特異性表達了5個，在C組則特異表達了4個激酶基因(表1)。

圖6 差異基因表達量變化Fig. 6 Volcano diagram of differential gene

圖7 不同比較組合間差異基因數量Fig. 7 Venn diagram of differential genes between different comparison groups

經過聚類分析，將差異基因表達水平變化趨勢分為4個類群，同一類群中的基因在不同的處理條件下具有相似的表達水平變化趨勢(圖8)。在N組表達遠高于C組表達的基因[log2(FPKM+1)約為6]聚為cluster_1，該組涉及到的基因為165個； 在C組表達遠高于N組表達的基因[log2(FPKM+1)約為5]聚為cluster_2，該組涉及到的基因為65個； 在N組表達稍高于C組表達的基因[log2(FPKM+1)約為1]聚為cluster_3； 在C組表達稍高于N組表達的基因[log2(FPKM+1)約為1]聚為cluster_4，cluster_3和cluster_4涉及到的基因分別為3 406個和3 303個。特別值得關注的是，在cluster_1中(即N組高表達)有4個真菌轉錄因子(Fungal_trans)、1個Peptidase_S28、2個Peptidase_S8； 而在cluster_2(即C組高表達)中，則是無Fungal_trans、Peptidase_S28和Peptidase_S8(表2)。

表1 碳氮組特有表達基因統計Tab.1 Specific expression gene statistics between carbon and nitrogen group

表2 圖8中cluster_1和cluster_2表達基因統計Tab.2 Specific expression gene statistics between cluster_1 and cluster_2 inFigure 8

圖8 基因表達水平變化趨勢的聚類Fig. 8 Cluster line chart of the trend of gene expression levels

2.4 致病相關基因差異表達

1) 絲氨酸蛋白酶相關基因： 在致病真菌中，絲氨酸蛋白酶是昆蟲和農業有害線蟲的致病因子(Yangetal., 2007)。特別是枯草桿菌蛋白酶S8(subtilases/peptidase S8)具有致死線蟲的活性，并參與侵染線蟲的過程(Wangetal., 2009； 2007; Yangetal., 2005)，而且枯草桿菌蛋白酶S8在食線蟲真菌基因組中含量豐富(Wangetal., 2018)。為明確在C、N培養條件下EV真菌對線蟲毒力的差異，統計了屬于絲氨酸家族的peptidase S8、peptidase S28二類基因在組間的變化：共鑒定到顯著上調(其P值和Padj值均為0)的屬于枯草蛋白酶家族S8基因13個(表3)。基因長度分布在1 182～3 678 bp之間；分別為相對于C組表達的2.29～363.52倍，log2FoldChange為1.20～8.51。其中5個在病原宿主數據庫(pathogen host interactions,PHI-base)中注釋到，注釋結果顯示除一個基因不影響致病性外，其他4個基因的突變表型均導致對宿主致病力下降。只有一個基因(ZGLK1168)顯著下調，log2FoldChange只有-0.96，下調的倍數較小。絲氨酸蛋白酶S28基因只有上調，上調的3個基因log2FoldChange分別為1.84、3.18和6.22，上調表達的差異倍數很大(表3)。

2) 毒素相關基因： 微生物產生的毒素是導致微生物致病性的重要毒力決定因素(Mohamadzadeh, 2009)。許多植物病原真菌通過分泌毒素殺死宿主細胞(Ottmannetal., 2009)。同樣的，食線蟲真菌也通過分泌毒素攻擊線蟲(Lpez-Llorcaetal., 2008)。食線蟲真菌的化學生態學還遠未弄清(Degenkolbetal., 2016a; 2016b)。目前已經鑒定到的具有殺線蟲活性的物質有oligosporon、4′,5′-dihydrooligosporon、talathermophilins A和B、phomalactone、aurovertins D和F、paeciloxazine、apyridine carboxylic acid derivative和leucinostatins等，但這些殺線蟲物質主要是從子囊菌綱中具有捕食結構的食線蟲真菌(Nematode-trapping fungi)及侵染線蟲卵和胞囊的食線蟲真菌中分離到的(Degenkolbetal., 2016a)。關于線蟲內寄生性真菌(Endoparasitic fungi)中殺線蟲毒素的研究極少。內寄生真菌EV在不同碳氮培養條件下，毒素合成相關基因表達差異顯著，與病原宿主數據庫比對，多數毒素合成相關基因的突變表型表明，這些基因屬于致病基因(表4)。

36個差異表達毒素相關基因，共有25個與毒素相關的基因上調，11個與毒素相關的基因下調。差異表達的16個T-toxin的調控合成基因(RTtB)中，13個基因上調，3個基因下調。2個AF-toxin合成相關基因(CaE-EAKt)上調，3個AK-toxin合成相關基因上調。這些毒素相關基因最高的上調132倍，為HC-毒素外排轉運蛋白； 合成AK-toxin必須的ZGLK3633基因上調22.3倍。PHI數據庫注釋結果表明，36個差異表達基因中的33個基因可在PHI數據庫中獲得注釋，其中的32個基因與致病性相關，其中8個基因的敲除可直接導致病原菌失去致病力，8個基因中的6個均在N組高表達(表4)。

2.5 實時定量PCR驗證

選取3個基因ZGLK4627、novel315、ZGLK4572 進行實時定量PCR驗證。結果顯示，3個基因在N組中上調表達(圖9)，與轉錄組結果一致。

3 討論

先前通過不同培養基培養研究真菌的主要方向是研究真菌在不同營養培養基中的生長特性，如產孢量、菌落特征、生長速度等(Meletiadisetal., 2001)。本研究表明，EV在N培養基中生長速度快，在C+N培養基中產孢量高。在C+N培養基中生長速度并沒有N培養基中高(觀測時間內)，可能原因是C+N混合培養基中，EV首先利用單糖和其他寡糖，然后才利用其他營養。本研究發現在氮培養條件下EV基因的整體表達水平高于碳培養條件，而且氮培養條件下，EV特異表達的基因多于C組。在氮組中特異表達的基因中，有調控基因轉錄的轉錄因子、降解線蟲體壁的枯草桿菌蛋白酶S8和在細胞的信號轉導、代謝等生命活動中起廣泛作用的激酶基因。

表4 差異表達毒素相關基因統計①Tab.4 Statistics of differential expression of toxin-related genes

圖9 實時定量PCR對3條差異表達基因的驗證Fig. 9 Confirmation of the expression profiles of 3 differential expression genes by real-time RT-PCR 誤差線上字母表示差異顯著性，相同字母表示在0.05水平無顯著差異。 The letters above the error bars present the significance of the difference and the same letter indicates non-significant at P<0.05.

真菌的胞外枯草桿菌蛋白酶S8參與真菌的致病性，并在多種昆蟲病原真菌和食線蟲真菌中得到證實(Bidochkaetal., 2000; Huangetal., 2004; Keniryetal., 2002; Lietal., 2017; Luglietal., 1997; Mortonetal., 2003)。該種蛋白酶最初從昆蟲病原綠僵菌(Metarhiziumanisopliae) (Legeretal., 1987)和白僵菌(Beauvariabassiana)中分離和鑒定(Bidochkaetal., 1987)。食線蟲真菌產生的枯草桿菌蛋白酶能降解線蟲角質中的蛋白及卵殼中的蛋白，在侵染線蟲過程發揮重要作用(Mortonetal., 2004)。該蛋白酶可從少孢節叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)(Wangetal., 2006)和厚垣孢普可尼亞菌(Pochoniachlamydosporia) (Segersetal., 1994)等食線蟲真菌中分別純化和鑒定。EV真菌在氮培養條件下Peptidase_S8家族中的多個基因表達顯著上調，最高的表達差異倍數大于60倍。因此可以推測氮培養條件有利于殺線蟲基因的表達。

許多微生物會產生有毒代謝產物，進而從營養來源中排除競爭性微生物。寄生的昆蟲病原真菌和食線蟲真菌通過毒素使宿主失去活力來促進感染(Mortonetal., 2004)。昆蟲病原真菌綠僵菌產生一種稱為destruxins的毒素，可以殺死昆蟲，并且destruxin的產生與致病性相關(Kershawetal., 1999)。食線蟲真菌也可產生毒素(Morgan-Jonesetal., 1985)。培養基、pH值等試驗條件會影響殺線蟲真菌代謝產物的產生，如不同的pH值和培養基導致厚垣孢普可尼亞菌殺線蟲代謝物的差異;Khambay等(2000)進一步從該菌中分離到一種殺線蟲代謝產物phomalactone，該毒素在侵染線蟲幼蟲的過程中發揮作用。食線蟲真菌EV在氮培養條件下，大量的毒素合成基因或毒素調控基因高表達，該培養條件很可能會產生大量的毒素，但需要進一步的試驗驗證。EV真菌的殺線蟲毒素有待進一步開發。基于EV不同培養條件下的表型數據及固有的EV高碳培養方式，建議培養時加入一定量的氮源，從而提高孢子產量。根據轉錄差異分析結果，N培養條件下可提高殺線蟲基因和毒素產生基因的表達，或許可以縮短侵染松材線蟲的時間，這需要進一步的試驗驗證。

4 結論

松材線蟲生防真菌EV在N培養基下生長速度快，在C+N培養基中2種孢子的產量高。通過轉錄組數據，分析了C、N培養基下差異表達基因和特異表達基因。氮培養條件下的EV真菌表達的總基因數量和特異表達的基因數量高于碳培養條件下的基因表達。具有殺線蟲作用的枯草桿菌蛋白酶、毒素合成等相關基因在氮培養下顯著上調。研究結果可為高毒力EV菌株的培養和提高EV生防真菌的防治效果提供重要理論基礎。