超聲輔助酶法提取米渣中蛋白的研究

王真真，史晶晶，汪姣蓉，陳嘉輝，王華南，章 焰，劉愛紅，陳 潔

（湖北大學知行學院糧食與食品工程學院，湖北武漢 430011）

米渣是味精、淀粉糖、有機酸生產(chǎn)的副產(chǎn)物，在生產(chǎn)淀粉糖的過程中，當7 t 大米被用來制作淀粉糖時就會有1 t 的米渣產(chǎn)生。在工業(yè)制糖的過程只是利用了大米當中的淀粉，副產(chǎn)品米渣中還含有大米蛋白，其米渣中蛋白質(zhì)的含量高達40%～70%，稱作大米蛋白濃縮物（Rice protein concentrate，PRC） 俗稱米渣蛋白，其中大米蛋白含量可達到80%[1]。大米蛋白由于其較高的生物價、低抗原性、氨基酸組成合理、易于消化等特點，成為大米深加工的新方向[2]。然而，米渣蛋白在經(jīng)過長時間的高溫液化后，蛋白發(fā)生變性，結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，溶解性也降低，其在食品方面的應用受到了很大限制，大部分的米渣經(jīng)過干燥后被用作飼料，使殘留在米渣中的蛋白質(zhì)未得到開發(fā)。大米蛋白由于其較高的生物價、低抗原性、氨基酸組成合理、易于消化等特點，成為大米深加工的新方向[3]。

大米蛋白是優(yōu)質(zhì)谷物蛋白，非常符合WHO/FAO推薦的理想模式[4]。大米蛋白的結(jié)構(gòu)特點賦予了其持水、乳化、起泡等特性，如國內(nèi)外有研究人員利用米渣蛋白生產(chǎn)發(fā)泡粉[5-6]，大米蛋白除作為蛋白飼料外，可應用于食品添加劑。還有研究者發(fā)現(xiàn)，大米蛋白在降低膽固醇、預防慢性疾病、抗癌變、促進免疫等方面發(fā)揮了很大作用[7-9]。

一般是從精米或者碎米中提取米粉加工成淀粉，而殘留的蛋白質(zhì)則被認為是價值有限的副產(chǎn)品。近年來，大米蛋白的營養(yǎng)和健康特性得到廣泛的認可，使得一些研究者對這些成分越來越感興趣，轉(zhuǎn)而展開對大米蛋白的提取、濃縮、純化和功能性產(chǎn)品的研究[10]。稻谷在加工時的各項副產(chǎn)物，均能用來提取大米蛋白，國內(nèi)研究較多的主要是米胚和碎米，由于米渣的高蛋白質(zhì)含量開始漸漸引起研究者的關(guān)注[11]。大米蛋白主要是4 類蛋白質(zhì)：水溶性的清蛋白、鹽溶性的球蛋白、醇溶蛋白、酸溶或者堿溶性的谷蛋白。其中，谷蛋白占到總蛋白含量的80%以上，是這幾種蛋白中占比最高的一種[12]。針對這幾種蛋白的特性，目前國內(nèi)外比較常用的提取方法主要是酶法提取、堿法提取、溶劑提取法、物理分離法及將2種或者多種方法結(jié)合起來的復合提取法等[13]。堿法的提取工藝簡單、成本低廉、提取率高，然而在反應過程需要消耗大量的堿液和酸液，淀粉和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)在強酸強堿的影響下會產(chǎn)生有害變化，會導致發(fā)生氨基酸縮合反應而引起有毒有害物質(zhì)的生成，并伴隨著褐色物質(zhì)的產(chǎn)生，影響產(chǎn)品的外觀色澤[14]。排雜法是通過去除米渣中各種非蛋白組分，如油脂、纖維素、淀粉等糖類物質(zhì)，從而提高剩余物中蛋白的比例，得到高純度的大米蛋白，但其提取的操作十分復雜[15]。酶法提取米渣蛋白的原理是利用蛋白酶的內(nèi)切或者外切作用對蛋白質(zhì)進行切割，使其水解成為可溶性的短肽，之后通過離心分離和干燥得到大米蛋白[16]。使用蛋白酶法提取的優(yōu)點是提取的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值高，人體能夠較好地消化吸收其水解得到的短肽，不會產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，并且提取條件十分溫和。米渣中蛋白因在水中的溶解性較差，常規(guī)酶解方法只能使50%的大米蛋白溶解[17]。而超聲預處理是利用超聲波的能量來改變物質(zhì)組織結(jié)構(gòu)、狀態(tài)、功能，并且超聲能量能夠作用于酶分子，使酶分子的構(gòu)象改變，影響其催化活性[18]。酶的構(gòu)象因適宜的超聲改變，使酶的活性中心充分暴露，增加底物與之結(jié)合的機會，加快反應過程[19]。超聲波具有明顯的空化效應，適用于乳化、結(jié)晶、均質(zhì)、水解、生物活性物質(zhì)提取等許多食品加工過程[20]。

采用超聲輔助酶法提取工藝，以米渣為大米蛋白提取原料，研究超聲對米渣蛋白提取效率的影響，優(yōu)化米渣蛋白的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品級堿性蛋白酶（酶活力單位200 000 U/g），浙江安詳生物科技有限公司提供；硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、氫氧化鈉、鹽酸等，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1104 型分析天平，上海精科天平有限公司產(chǎn)品；SH A-B 型雙功能水浴恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司產(chǎn)品；TG16G 型臺式高速離心機，常州市金壇高科儀器廠產(chǎn)品；UP 型超聲波清洗儀，南京壘君達超聲電子設(shè)備有限公司產(chǎn)品；KDN-04A 型蛋白質(zhì)測定儀，上海洪記儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；D2X-6020B 型真空干燥箱，上海福瑪實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白質(zhì)的測定方法

參照GB 5009.5—2016 食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定。

1.3.2 超聲對米渣蛋白提取率的影響

稱取4 份相同米渣樣品，分別標記為I，II，III，IV。II 號樣品料液比1∶6，加酶量1 200 U/g，酶解溫度40 ℃；

III 號樣品料液比1∶6，超聲處理40 min；IV號樣品料液比1∶6，加酶量1 200 U/g，酶解溫度40 ℃，超聲處理40 min；I 號樣品不加酶，不適用超聲處理，作為空白對照。以上I～IV 號樣品按上述方法提取米渣蛋白后，采用凱氏定氮測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 超聲輔助堿性蛋白酶提取米渣蛋白工藝

稱取米渣→加酶→調(diào)pH 值→水浴振蕩→超聲處理→滅酶→離心分離→上清液干燥→測定蛋白質(zhì)含量。

根據(jù)料液比將堿性蛋白酶溶于定量的去離子水，微熱并攪拌使其充分溶解，冷卻至室溫后待用。酶液中加入3.00 g 米渣，調(diào)pH 值至8.5，50 ℃下水浴振蕩超聲處理，80 ℃下滅酶15 min。然后離心，將離心的沉淀用20 mL 的去離子水洗滌，相同轉(zhuǎn)速下二次離心，收集并合并2 次上清液，調(diào)節(jié)pH 值至中性，烘箱干燥。

1.3.4 超聲輔助堿性蛋白酶提取米渣蛋白工藝優(yōu)化

（1） 料液比對米渣蛋白提取率的影響。料液體積比分別選取1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，加酶的量1 200 U/g，酶解溫度50 ℃，酶解pH 值8.5，酶解時間100 min，超聲時間40 min。后續(xù)提取測定步驟同1.3.3，考查不同料液比對米渣蛋白提取率的影響。

（2） 加酶量對米渣蛋白提取率的影響。料液比1∶6，加酶量分別選取1 200，1 350，1 500，1 650 U/g，酶解溫度50 ℃，酶解pH 值8.5，酶解時間100 min，超聲時間40 min。后續(xù)提取測定步驟同1.3.3，考查不同加酶量對米渣蛋白提取率的影響。

（3） 酶解溫度對米渣蛋白提取率的影響。料液比1∶6，加酶量1 200 U/g，酶解溫度分別選取50，55，60，65 ℃，酶解pH 值8.5，酶解時間100 min，超聲時間40 min。后續(xù)提取測定步驟同1.3.3，考查不同酶解溫度對米渣蛋白提取率的影響。

（4） 酶解時間對米渣蛋白提取率的影響。料液比1∶6，加酶量1 200 U/g，酶解溫度50 ℃，酶解pH 值8.5，酶解時間分別選取100，120，140，160 min，超聲時間40 min。后續(xù)提取測定步驟同1.3.3，考查不同酶解時間對米渣蛋白提取率的影響。

（5） 超聲時間對米渣蛋白提取率的影響。料液比1∶6，加酶量1 200 U/g，酶解溫度50 ℃，酶解pH 值8.5，酶解時間100 min，超聲時間分別選取40，60，80，100 min。后續(xù)提取測定步驟同1.3.3，考查不同超聲時間對米渣蛋白提取率的影響。

（6） 正交試驗設(shè)計優(yōu)化米渣蛋白的提取工藝參數(shù)。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過設(shè)計正交試驗優(yōu)化米渣蛋白提取工藝參數(shù)。以料液比、加酶量、酶解時間、酶解溫度及超聲時間為5 個因素，以蛋白質(zhì)的提取率為指標，采用L16（45）進行正交試驗。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲處理對米渣蛋白提取率的影響

超聲處理對米渣蛋白提取率的影響見圖1。

圖1 超聲處理對米渣蛋白提取率的影響

由圖1 可知，無論是單獨的堿性蛋白酶作用還是超聲波單獨處理均有助于對米渣蛋白提取。酶法提取主要是使用蛋白酶的降解和修飾作用使其成為可溶性肽，然后提取出來。酶法提取反應條件溫和、料液比小、固形物含量高，能減少去除提取液水分的能量消耗[21]。酶法提取還可能產(chǎn)生具有多種活性的生物肽和氨基酸[22-23]。與超聲預處理比較，超聲波與酶協(xié)同處理對米渣蛋白純度的影響更大。底物可以通過超聲波在介質(zhì)中形成的微流效應快速進入催化部位，并讓其構(gòu)象發(fā)生改變，使其折疊更合理，便于與底物進行結(jié)合，從而影響酶促反應進程，提高酶的催化效率。超聲處理在米糠蛋白的提取上也得到了應用[24]。超聲還廣泛應用于輔助堿法提取米渣蛋白[25]。

2.2 提取工藝條件對米渣蛋白提取率的影響

2.2.1 料液比對米渣蛋白提取率的影響

料液比對米渣蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對米渣蛋白提取率的影響

由圖2 可知，料液比為1∶6 ～1∶10 時，提取率逐漸升高，當料液比達到1∶10 時不再升高而略有下降。當料液比值較大時，提取液黏度大，分子擴散速率降低降低，不利于超聲波的傳導，影響蛋白酶提取物的釋放[22，26]。增加提取液的體積，有利于提高堿性蛋白酶與大米蛋白相互作用的機率及對大米蛋白的降解和修飾作用。料液比值過小時，提取率降低，會增加后續(xù)對提取液處理的成本。

2.2.2 加酶量對米渣蛋白提取率的影響

加酶量對米渣蛋白提取率的影響見圖3。

圖3 加酶量對米渣蛋白提取率的影響

由圖3 可知，在加酶量＜1 500 U/g 時，隨著酶的添加量的增加，蛋白提取率的增高。當加酶量＞1 500 U/g 時，提取率減小。一般情況下在pH 值、溫度和底物濃度一定時，酶促反應速率正比于酶濃度。酶在特定的蛋白質(zhì)分子上的作用位點的數(shù)量是有限的，當添加的酶量達到一定量后，酶與底物的作用位點到達飽和，再增加酶的用量提取率影響不大。

2.2.3 酶解溫度對米渣蛋白提取率的影響

酶解溫度對米渣蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對米渣蛋白提取率的影響

由圖4 可知，隨著溫度的升高，米渣蛋白的提取率增加；當酶解溫度達到50 ℃時，米渣蛋白的提取率達到最高值；當溫度超過50 ℃時，米渣蛋白的提取率呈現(xiàn)下降趨勢。蛋白酶發(fā)生作用溫度范圍為40～50 ℃。溫度對酶催化反應速率的影響是雙重的：在低的溫度范圍內(nèi)隨溫度提高，反應速率加快；當溫度超過50 ℃時堿性蛋白酶的活性降低，溫度過高甚至使酶失去活性。

2.2.4 酶解時間對米渣蛋白提取率的影響

酶解時間對米渣蛋白提取率的影響見圖5。

圖5 酶解時間對米渣蛋白提取率的影響

由圖5 可知，米渣蛋白的提取率與酶解時間呈現(xiàn)正相關(guān)。140 min 之前，底物濃度高酶解速度快，隨著酶解時間的延長，提取率緩慢升高。140 min 后米渣蛋白的提取率略微降低。

2.2.5 超聲時間對米渣蛋白提取率的影響

超聲時間對米渣蛋白提取率的影響見圖6。

由圖6 可知，當超聲時間為40～80 min 時，隨著超聲時間的增加，蛋白質(zhì)的提取率也在提高，當超過80 min 時，蛋白質(zhì)提取率略有下降。適宜的超聲能量能夠改變酶的構(gòu)象，當酶的構(gòu)象改變后，酶的活性中心被暴露出來，這就使得底物與酶活性中心結(jié)合的機率大大增加，這樣可以加快反應進程[27]。但當達到一定程度后超聲物理能量作用效果有減弱的趨勢，超聲時間過長，使得米渣蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，與蛋白酶的結(jié)合位點反而減少。

圖6 超聲時間對米渣蛋白提取率的影響

2.3 超聲輔助酶法提取米渣蛋白工藝參數(shù)的正交試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇超聲時間（A）、酶解時間（B）、加酶量（C）、料液比（D）、酶解溫度（E） 為考查因素，分別選擇4 個水平進行L16（45）正交試驗。

正交試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)直觀分析極差R 值大小可以看出，5 個影響米渣蛋白提取率的因素的影響作用主次關(guān)系依次為D＞C＞A＞E＞B，說明料液比的影響最大，其次為加酶量、超聲時間、酶解溫度、酶解時間。初步確定最優(yōu)的組合為A3B1C4D3E4，即料液比1∶10，加酶量1 650 U/g，酶解時間100 min，酶解溫度55 ℃，超聲時間80 min。對最佳組合進行驗證試驗得到蛋白質(zhì)的提取率為82.80%。

3 結(jié)論

通過對比堿性蛋白酶單獨作用、單獨使用超聲處理、超聲處理輔助堿性蛋白酶等提取方式對米渣蛋白提取率的影響，得出超聲協(xié)同堿性蛋白酶提取效果最佳。在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用正交試驗確定了最優(yōu)組合超聲輔助酶法提取米渣蛋白。

大米蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，諸多優(yōu)良的特性使其應用前景得到了廣泛的關(guān)注。采用超聲波輔助堿性蛋白酶法純化工藝，適宜的超聲對提取米渣蛋白有利，能夠提高堿性蛋白酶的活力，且安全可靠，對營養(yǎng)物質(zhì)的影響也較少。同時，可以防止酶解溫度過低而導致酶反應時間過長，有效縮短了酶解的時間，且酶法作用的條件溫和，將超聲與酶法有效結(jié)合，既而從米渣中得到高純度的蛋白成分。