金刺參九正合劑HPLC指紋圖譜研究

孫冬梅， 畢曉黎， 莊玉堅

（廣東省中醫研究所，廣東廣州 510095）

金刺參九正合劑HPLC指紋圖譜研究

孫冬梅， 畢曉黎， 莊玉堅

（廣東省中醫研究所，廣東廣州 510095）

金刺參九正合劑；HPLC；指紋圖譜

目的：采用高效液相色譜法建立金刺參九正合劑（金蕎麥、刺梨、苦參）的指紋圖譜。方法：以Agilent Zorbax Extend-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈-水（含0.3%磷酸及0.2%三乙胺）為流動相梯度洗脫，流速0.7 mL/min；柱溫25℃；檢測波長220 nm。結果：以兒茶素峰為參照物峰，確定13個共有峰，共有峰面積之和大于95%。結論：建立的方法操作簡便，精密度、穩定性和重復性好，為該制劑的質量控制提供了方法。

金刺參九正合劑（原愛福寧合劑）是在貴州苗族民間驗方的基礎上以刺梨、苦參、金蕎麥配伍組方，采用現代生物工程技術處理精制而成的新一代抗癌藥物，具有清熱解毒、健脾生津、燥濕和胃之功，臨床作為腫瘤治療的輔助藥，取得較好療效［1］。原質量標準僅對制劑中苦參堿的含量進行控制，并不能表征全方內在質量。為了更高地控制制劑質量，并為其物質基礎研究提供依據，對金刺參九正合劑進行指紋圖譜研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀，DAD檢測器，四元梯度泵，G2171BA數據處理系統。HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥 乙腈為色譜純（Merk），水為屈臣氏蒸餾水，其它試劑均為分析純。

兒茶素（批號：877-200001）購于中國藥品生物制品檢定所；苦參、金蕎麥、刺梨汁藥材及金刺參九正合劑共10批（20080107、20080108、20080109、20080201、20080202、20080203、20080301、20080302、20080501、20080502）均由貴州老來福醫藥有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱；流動相：乙腈（A）-水（含 0.3% 磷酸及 0.2%三乙胺）（B），采用梯度洗脫，A相梯度：0～10 min，1% ～1%；10～20 min，1% ～10%；20～40 min，10% ～30%；40～55 min，30% ～40%；檢測波長：220 nm；流速：0.7 mL/min；柱溫：25 ℃；運行時間：55 min；進樣量：7 μL。

2.2 參照峰的選擇 兒茶素（10號峰）為本方有效成分之一，在HPLC圖譜中峰面積較大，出峰時間適中且穩定，故選擇兒茶素為參照峰。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取兒茶素對照品適量，加乙腈-水（1∶9）使溶解，制成每1 mL含兒茶素176 μg的溶液，即得。

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 藥材供試品溶液的制備

刺梨：取新鮮刺梨榨汁，濾過，量取濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，搖勻，即得刺梨供試品溶液。

金蕎麥：取金蕎麥藥材3.3 g，加70%乙醇30 mL，回流提取兩次，第1次2 h，第2次1.5 h，合并提取液，濾過，濾液濃縮至約1 mL，加水溶解并定容至10 mL，10℃以下靜置24 h，取上清液，即得金蕎麥供試品溶液。

苦參：取苦參藥材1 g，加70%乙醇30 mL，回流提取兩次，第1次2 h，第2次1.5 h，合并提取液，濾過，濾液濃縮至約1 mL，加水溶解并定容至10 mL，10℃以下靜置24 h，取上清液，即得苦參供試品溶液。

2.4.2 金刺參九正合劑成品供試品溶液的制備

量取本品2 mL，置5 mL量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.5 方法學驗證

2.5.1 精密度試驗 取同一批號（批號：20080203）制劑的供試品溶液，連續進樣6次進行測定，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積比值的一致性，結果表明各共有峰相對保留時間的RSD為0.13% ～0.77%，相對峰面積的RSD為1.92% ～2.90%，表明本方法儀器精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗 取同一批號（批號：20080203）制劑的供試品溶液，分別在 0、1.5、3、6、9 h 進樣，測定，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積比值的一致性，結果表明各共有峰相對保留時間的RSD為0.11% ～0.85%，相對峰面積的RSD為1.36% ～3.28%，沒有明顯變化，顯示供試品溶液在9h內穩定性良好。

2.5.3 重復性試驗 取同一批號（批號：20080501）樣品，按照供試品溶液的制備方法，制備5份供試品溶液，依次進行測定，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積比值的一致性，結果表明各共有峰相對保留時間的RSD為0.08%～2.48%，相對峰面積的RSD為1.23% ～2.95%，RSD<3%，表明本方法重復性良好。

2.6 指紋圖譜的建立

2.6.1 樣品測定 取10批金刺參九正合劑樣品，分別按2.4.2項下供試品溶液的制備方法進行處理，再按2.1項下條件進行HPLC指紋圖譜測定。根據10批供試品溶液HPLC提供的相關參數，確定共有峰為13個，并對其進行標示。為了便于辨認和分析比較，將整個色譜圖分成Ⅰ、Ⅱ兩個區。指紋峰的位置：第一區包括1#～8#峰（保留時間范圍3～11 min）；第二區包括9#～13#峰（保留時間范圍21～42 min），見圖1。相對保留時間和相對峰面積數據見表1、2。

圖1 金刺參九正合劑特征指紋圖譜

表1 10批樣品指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表2 10批樣品指紋圖譜共有峰的相對峰面積

2.6.2 指紋圖譜相似度計算 將10批樣品的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004 A版），設定匹配模板，進行譜峰自動匹配，生成對照指紋圖譜（見圖2），進行相似度評價。樣品與對照圖譜的相似度，以平均數計算，分別為：0.998、0.998、0.999、0.998、0.996、0.998、0.998、0.998、0.998、0.997；以中位數計算，分別為 0.997、0.998、1.000、0.996、0.996、0.996、0.997、0.998、0.999、0.995，均大于0.99。表明10批樣品與對照指紋圖譜相似度良好，本制劑工藝穩定。

2.6.3 指紋圖譜各共有峰歸屬的初步判斷 精密吸取對照品溶液10 μL，藥材供試品和制劑供試品溶液各7 μL分別進樣，通過與指紋圖譜保留時間和紫外光譜對照，確定了10號峰（S）為兒茶素。另外通過各單味藥材與復方制劑指紋圖譜的對照分析，基本確定了各味藥材對該方的貢獻。其中共有峰1#峰、8#峰來自于金蕎麥藥材，9#峰、13#峰來自于苦參藥材，2#峰、3#峰、4#峰、7#峰來自于刺梨藥材。計算各批號樣品共有峰的面積，結果表明，10批供試品的共有峰面積之和均大于總峰面積的95%，結果見表3。

圖2 10批金刺參九正合劑指紋圖譜

2.6.4 苦參中苦參堿的含量測定 為了控制金刺參九正合劑的質量，還按照《中國藥典》2005年版一部苦參項下含量測定方法對樣品中苦參主要成分苦參堿的含量進行了測定，所得色譜圖峰形較好，分離度高，苦參堿的含量測定結果見表4。

表3 10批金刺參九正合劑特征指紋峰的峰面積之和/%

表4 苦參堿含量測定結果

3 結論

通過上述研究確定了金刺參九正合劑供試品制備方法和色譜條件，并驗證了精密度、穩定性、重復性，結果令人滿意；建立了金刺參九正合劑指紋圖譜，確定了其中13個主要特征峰。

13 個共有色譜峰的相對保留時間為：峰1（0.135～0.136）；峰2（0.146～0.147）；峰 3（0.165～0.166）；峰 4（0.180～0.181）；峰 5（0.234～0.237）；峰 6（0.265～0.272）；峰7（0.336～0.338）；峰 8（0.376～0.380）；峰 9（0.802～0.804）；峰10（1.000）；峰11（1.145～1.146）；峰12（1.339～1.350）；峰13（1.525～1.529）。

13 個共有色譜峰的相對峰面積為：峰1（0.555～0.660）；峰2（11.815～14.993）；峰3（1.159～1.378）；峰4（0.498～0.582）；峰 5（0.400～0.457）；峰 6（0.502～0.612）；峰7（2.739～3.248）；峰 8（0.796～0.969）；峰 9（1.367～1.792）；峰10（1.000）；峰11（1.571～1.880）；峰12（1.420～1.662）；峰13（3.810～4.605）。

根據研究結果，制定了金刺參九正合劑指紋圖譜的技術參數，通過對其指紋圖譜相似度的計算，10批樣品的相似度都在0.99以上。因此，本方法可作為評價金刺參九正合劑質量的指紋圖譜，同時為進行其物質基礎研究提供了一定的實驗依據。

4 討論

4.1 流動相的選擇 試驗中曾選擇4種流動相系統：以乙腈-水，乙腈-水-無水乙醇，乙腈-0.3%磷酸，乙腈-水（含0.3%磷酸及0.2%三乙胺）進行試驗。結果表明，以乙腈-水，乙腈-水-無水乙醇，乙腈-0.3%磷酸為流動相系統，供試品溶液中組分分離不理想；采用乙腈-水（含0.3%磷酸及0.2%三乙胺）體系，色譜峰尖銳無拖尾，且基線在同一趨勢下重復性較好，故選擇乙腈-水（含0.3%磷酸及0.2%三乙胺）系統為流動相［2］。

4.2 檢測波長的選擇 參考相關文獻報道［3-4］，運用Agilent 1200高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器分別在210、220、230、254、280、365 nm對金刺參九正合劑主要成分吸收波長進行考察，結果在220 nm處吸收峰呈現較完全，因此確定，檢測波長為220 nm。

4.3 按照國家藥典委員會關于“中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）的通知”，以HPLC梯度洗脫法對金刺參九正合劑進行指紋圖譜研究，實驗證明，該方法可操作性強，重復性好，可作為金刺參九正合劑指紋圖譜研究［5］。

［1］趙新環，謝正富.苗族方藥“愛福寧合劑”的抗癌作用［J］.中國民族民間醫藥雜志，2002，57：223-225.

［2］王欣之，文紅梅，居玲玲，等.玉屏風散醇提部位HPLC指紋圖譜研究［J］.中成藥，2009，31（3）：335-339.

［3］何美珊，錢炳輝，王兆龍，等.金蕎麥HPLC指紋圖譜的研究［J］. 中國藥師，2005，8（3）：217.

［4］馬仁玲，周紅華，于喜水，等.苦參注射液生物堿類成分指紋圖譜的研究［J］. 中國中藥雜志，2003，28（9）：817-819.

［5］孫守國.復方丹參片的HPLC指紋圖譜研究［J］.中成藥，2009，31（3）：339-342.

R284.1

A

1001-1528（2010）07-1096-03

2009-06-12

孫冬梅（1969－），女，主任中藥師，主要從事中藥質量評價。Tel：（020）83501292 E-mail：tcmgdp@163.com