補腎健脾顆粒質量標準研究

王 珍， 李 矗

(1.安徽省藥品審評認證中心，安徽合肥230022;2.安徽醫科大學附屬安徽省立醫院，安徽合肥230001)

補腎健脾顆粒是根據臨床經驗方開發的中藥復方制劑，由骨碎補、川牛膝、獨活等中藥組成，具有補腎健脾，活血散寒之功，用于治療骨性關節炎證見脾腎兩虛、寒濕瘀阻證。本文采用薄層色譜法對其中的骨碎補、川牛膝、獨活、黨參、當歸進行定性鑒別，采用HPLC法對骨碎補中的有效成分柚皮苷進行含量測定，可有效控制補腎健脾顆粒的質量。

1 儀器、試藥與樣品

島津LC-10AT型高效液相色譜儀(單元泵，紫外檢測器，浙大N2000色譜工作站);天津奧特塞斯AT-130型柱溫箱;UV-1700型紫外分光光度計(島津);超聲波清洗器HS3120型。柚皮苷對照品(批號110722-200307，供含量測定用)，川牛膝對照藥材(批號121066-200203);獨活對照藥材(批號 130940-200205)，黨參對照藥材(批號 121057-200303)，黨參炔苷對照品(111732-200804)，阿魏酸對照品(批號110773-9910)，均購于中國藥品生物制品檢定所。乙腈、磷酸為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為化學純。補腎健脾顆粒由安徽九鼎醫藥科技有限公司提供(規格:每袋裝10 g)。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 骨碎補的鑒別［1］取本品3 g，加水50 mL攪拌，微熱使溶解，用乙醚萃取2次，每次30 mL，棄去乙醚液，再用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取柚皮苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各3μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下分層的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。陰性對照無干擾。見圖1。

圖1 骨碎補鑒別薄層色譜圖

2.1.2 川牛膝的鑒別［2］取本品研細，取細粉5 g，加75%乙醇50 mL，加熱回流提取1 h，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，水溶液用乙醚10 mL振搖提取，提取液揮干乙醚，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取川牛膝對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-三氯甲烷-丙酮(8∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的藍色熒光斑點。陰性對照無干擾。見圖2。

2.1.3 獨活的鑒別［3］取本品3 g，加水50 mL攪拌，微熱使溶解，用乙醚萃取2次，每次30 mL，合并乙醚液，低溫(30℃)揮干乙醚，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取獨活對照藥材0.6 g，加乙醚10 mL，超聲處理5 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各7μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(8∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。陰性對照無干擾。見圖3。

圖2 川牛膝鑒別薄層色譜圖

圖3 獨活鑒別薄層色譜圖

2.1.4 黨參的鑒別［4］取本品10 g，研細，加甲醇100 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的氨試液洗滌2次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，通過D101型大孔吸附樹脂柱(內徑1.5 cm，柱高10 cm)，用水50 mL洗脫，棄去水液，再用50%乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取黨參對照藥材1 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，自“殘渣加水10 mL使溶解”起，同法制成對照藥材溶液。再取黨參炔苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述供試品溶液與對照藥材溶液各5μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一高效硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性對照無干擾。見圖4。

2.1.5 當歸的鑒別 取本品10 g，加1%碳酸氫鈉溶液100 mL，攪拌10 min，靜置，取上清液用稀鹽酸調節pH值至2～3，用乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取阿魏酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。陰性對照無干擾。見圖5。

圖4 黨參鑒別薄層色譜圖

圖5 當歸鑒別薄層色譜圖

2.2 柚皮苷的含量測定

據文獻報道，骨碎補能改變軟骨細胞功能，推遲細胞退行性變，降低骨關節病的發病率及發病程度，推遲發病時間［5］，為本方中的君藥。參考中國藥典2005年版一部中骨碎補和枳殼［6］項下柚皮苷的含量測定方法，并結合本劑型特點，研究建立HPLC法測定本方中柚皮苷含量，進行方法學考察，該方法分離度良好，簡單、靈敏、可靠。

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱:Waters C18(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:乙腈-0.1%磷酸溶液(19.5∶80.5);檢測波長:283 nm;柱溫:25℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:20μL;理論板數按柚皮苷峰計算應不低于3 000。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取減壓干燥至恒重的柚皮苷對照品10 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含柚皮苷40μg)。

2.2.3 供試品溶液制備 取本品研細，取細粉2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，密塞，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，甲醇補足減失的重量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性溶液制備 取按處方量制備的缺骨碎補的空白樣品，照供試品溶液的制備方法制備。

2.2.5 陰性干擾試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各20μL，按上述色譜條件進行測定，結果陰性溶液在與對照品相應的保留時間處無峰出現，可見本品中其它成分對柚皮苷的測定無干擾。見圖6。

圖6 對照品、樣品、陰性樣品HPLC色譜圖

2.2.6 線性關系考察 精密量取濃度為0.039 mg/mL和0.195 mg/mL的柚皮苷對照品溶液各5、10、15μL，按前述色譜條件注入液相色譜儀，計錄峰面積。以柚皮苷濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，計算，得回歸方程為:Y=708 793X－7 700.8，r=0.999 9。表明柚皮苷在0.195～2.925μg范圍內呈良好的線性關系。

2.2.7 供試品精密度試驗 取按供試品溶液制備法制備的供試液(批號040402)，按上述色譜條件注入液相色譜儀，連續進樣6次，記錄柚皮苷峰面積分別為479 284、485 766、478 891、483 806、471 237、481 021，RSD=1.05%，表明精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 將按供試品溶液制備法制備的供試液(批號040402)于 0，1，2，4，6，8 h 按上述色譜條件重復測定1次，記錄柚皮苷峰面積分別為482 004、491 344、489 396、483 830、497 579、476 929，RSD=1.52%。表明供試液在 8 h內穩定。

2.2.9 重復性試驗 取同一批號樣品(批號040402)共6份，按供試品溶液制備法制備供試液，精密量取該溶液和對照品溶液各20μL，按上述色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算柚皮苷含量分別為 0.84，0.86，0.86，0.84，0.85，0.85 mg/g，RSD=1.05%。表明方法重復性良好。

2.2.10 回收率試驗 精密量取已知含量(0.85 mg/g)的同一批號的樣品(批號040402)1 g共6份，再分別精密加入0.284 mg/mL柚皮苷對照品甲醇液3 mL，混合均勻，水浴蒸干，以下按供試品溶液的制備方法配制成供試液。分別取該溶液和對照品溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算柚皮苷含量，結果見表1。

表1 回收率試驗結果(n=6)

2.2.11 樣品測定 對3批小試樣品(批號分別為040401，040402，040501)和 3批中試樣品(批號分別為 060601，060602，060603)按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，分別精密吸取樣品溶液和對照品溶液各20μL，注入液相色譜儀，按外標法以峰面積計算含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

3 討論

3.1 本品為中藥復方制劑，采用薄層色譜鑒別方法對方中的主要藥味均進行了鑒別，并進行了陰性對照試驗，結果其方法簡便且專屬性強，可有效控制本品的質量。其中川牛膝的薄層色譜鑒別在2005年中國藥典一部中未收載，文獻中報道亦較少，大多采用顯微鑒別和理化鑒別，其專屬性較差，本文采用的方法具有很強的專屬性，可為川牛膝藥材和含川牛膝制劑的色譜鑒別提供參考。

3.2 骨碎補中柚皮苷的含量測定方法文獻報道較多，但在本制劑中尚未見報道。我們參考藥典骨碎補藥材項下含量測定項，流動相為甲醇-醋酸-水(35∶4∶65)進行操作，結果柚皮苷出峰時間過長，達28 min，且塔板數較低，約為5 000;參考藥典枳殼藥材項下流動相:乙腈-水(21.5∶80.5)，用磷酸調節至pH3，柚皮苷塔板數達9 000，調節乙腈與水的比例，結果得到了較好的出峰時間(16 min)。

3.3 曾對含量測定中供試品溶液提取方法進行了考察，藥典是采用甲醇回流提取3h，考慮到本品骨碎補藥材投料時采用醇提工藝，所以進行了不同時間的回流和超聲處理比較試驗。結果表明采用文中的方法即甲醇超聲30 min，功率120 W，頻率40 kHz為佳。

［1］何夏秋，賀建華，馬燕瓊，等.用薄層法鑒別與測定千金救心膠囊中柚皮苷的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2003，9(4):10-12.

［2］杜志謙，江海肖，夏華玲，等.筋骨痛消丸的質量標準研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2002，8(4):13-15.

［3］苗明三，李振國主編.現代實用中藥質量控制技術［M］.第一版，北京:人民衛生出版社，2002:778，825.

［4］中國藥典［S］.一部.2010:264.

［5］趙湘洪，陳寶興，丁繼華，等.骨碎補對實驗性骨性關節炎的治療作用［J］.中國中藥雜志，1987，12(10):41.

［6］中國藥典［S］.一部.2005:180，171.