滇西18種豆科植物體外降脂活性研究

郎利娟，姜 北，崔淑君，朱起杰，董 相，肖朝江*

（1.大理大學(xué)藥物研究所，云南大理 671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000）

高脂血癥（hyperlipidemia）是指血漿中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）中一項或多項水平升高超出正常水平上限，是一類較常見的疾病。在我國，成人血脂異常總體患病率高達(dá)34%，其發(fā)生率近年來也隨著生活水平的提高、生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變呈逐年上升趨勢，我國兒童、青少年高膽固醇血癥患病率也有明顯升高，預(yù)示未來中國成人血脂異常患病及相關(guān)疾病負(fù)擔(dān)將繼續(xù)加重。以LDL-C或TC升高為特點的血脂異常是動脈粥樣硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）的重要誘發(fā)因素；降低LDL-C水平，可顯著減少ASCVD的發(fā)病率及死亡危險〔1-3〕。因此，有效控制血脂水平，對防控ASCVD具有重要意義。

豆科（Leguminosae）植物全球約有650屬，18 000種，廣泛分布于世界各地。我國有172屬，1 485種，13亞種，153變種，16變型；各省區(qū)均有分布。豆科為被子植物中三個最大的科之一，分布極為廣泛，生長環(huán)境各式各樣，無論平原、高山、荒漠、森林、草原還是水域，幾乎都可見到豆科植物的蹤跡。豆科植物具有重要的經(jīng)濟價值，它是人類食品中淀粉、蛋白質(zhì)、油和蔬菜的重要來源之一〔4〕。另外，許多豆科植物還具有良好的降脂活性。例如研究〔5〕發(fā)現(xiàn)，從苦參（Sophora flavescens Aiton）中提取分離的苦參堿對血清膽固醇增高的大鼠有一定的降低作用，對高三酰甘油血癥有明顯的治療作用。葛根（Pueraria edulis Pamp.）中的有效成分葛根素通過降血糖和降血脂活性表現(xiàn)出抗糖尿病作用〔6〕。大量研究表明，決明子（Cassia obtusifolia L.）也具有良好 的 降 脂 作用〔7-8〕。胡 蘆 巴（Trigonella foenumgraecum L.）提取物可改善血脂紊亂，具有顯著的降血脂作用〔9-10〕。紫苜蓿（Medicago sativa L.）具有降血脂、抗動脈粥樣硬化的作用〔11-14〕。此外，豆科植物的主要藥效成分之一大豆皂苷可以降低血液中膽固醇和TG的含量〔15〕。

為了從植物中發(fā)現(xiàn)降脂活性較好、副作用較低的天然產(chǎn)物，本研究采用高脂HepG2細(xì)胞模型，對采自滇西的18種豆科植物進行體外降脂活性篩選。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BSC-1000ⅡA2生物安全柜（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；5510E CO2培養(yǎng)箱（美國Nuaire公司）；DT5-6低速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）；M700E倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Coolsafe 95-15冷凍干燥機（丹麥LaboGene公司）；AL204電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；HVE-50高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司）；DW-86L 628-80℃低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥 人肝癌細(xì)胞株（HepG2）由中國科學(xué)院昆明植物研究所黎勝紅研究員惠贈；Gibco澳洲特級胎牛血清、Gibco RPMI 1640干粉培養(yǎng)基均購自美國Invitrogen公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液均購自北京索萊寶科技有限公司；油酸、油紅O均購自上海麥克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自德國Biofroxx公司；棕櫚酸鈉購自上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；辛伐他汀購自美國Ark Pharm公司。

1.3 植物樣品 18種豆科植物樣品均采自滇西地區(qū)，由大理大學(xué)藥學(xué)院張德全教授鑒定，植物標(biāo)本均存放于大理大學(xué)藥物研究所。植物信息見表1。

表1 18種豆科植物基本信息

2 方法

2.1 植物提取物的制備 18種干燥豆科植物樣品粉碎后均采用75%乙醇熱回流提取3次，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃以下除去乙醇后，轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機上冷凍干燥，得相應(yīng)凍干粉，備用。

2.2 體外降脂活性測試 參考文獻(xiàn)〔16-18〕中的方法，并進行適當(dāng)改良，具體如下：將HepG2細(xì)胞（1.5×104個∕孔）接種于96孔板上，置37℃和5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)至細(xì)胞豐度達(dá)90%以上時，以40%BSA結(jié)合的0.6 mmol∕L的油酸和0.3 mmol∕L的棕櫚酸鈉誘導(dǎo)。24 h后，供試組每孔加入20μL供試物溶液，終濃度為0.5 mg∕mL，空白組和模型組每孔加入20μL相應(yīng)溶媒（粗提物溶媒為滅菌水，辛伐他汀溶媒為DMSO）。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，小心移除孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入60μL 10%甲醛溶液固定30 min。隨后移除固定液，每孔加入60μL 0.4 mg∕mL油紅O工作液染色，60 min后用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3遍，置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴染色情況。最后每孔加入200μL異丙醇，并用酶標(biāo)儀測定波長510 nm下各組的光密度（OD）值。降脂率按以下公式計算：降脂率=［1-（供試組OD值-空白組OD值）∕（模型組OD值-空白組OD值）］×100%。

3 結(jié)果

對18種豆科植物進行體外降脂活性篩選的結(jié)果見表2。從表中可以看出，18種供試植物中有13種（占比70%以上）具有不同程度的降脂活性，推測豆科植物可能普遍具有一定的降脂活性。陽性藥物辛伐他汀終濃度為50μmol∕L時，降脂率為（11.4±2.9）%。在所有篩選出的活性植物中，云南甘草地上部分降脂活性最強，終濃度為0.5 mg∕mL時的降脂率可達(dá)（21.6±3.9）%；其次是截葉鐵掃帚全株、黑毛多枝黃芪地下部分、鞍葉羊蹄甲地上部分，終濃度為0.5 mg∕mL時的降脂率分別為（19.6±10.0）%、（17.8±1.9）%、（15.3±4.6）%。此外，合歡地上部分終濃度為0.5 mg∕mL時，顯示出較強的細(xì)胞毒性，故其在此濃度下的降脂活性無法測定。

4 討論

治療高脂血癥除了控制飲食、改善生活方式外，一般還需臨床藥物進行干預(yù)。常用的調(diào)血脂藥物除了他汀類外，還包括膽固醇吸收抑制劑、膽酸螯合劑、貝特類、煙酸類、高純度魚油制劑、普羅布考及其他調(diào)脂藥（脂必泰、多廿烷醇）等。但是，無論是經(jīng)典降血脂藥還是新型調(diào)血脂藥，均有不同程度的肝毒性或其他不良反應(yīng)〔2，19〕，因此，尋找高效、無毒副作用的新型降血脂藥物依然任重而道遠(yuǎn)。目前應(yīng)用于臨床的藥物大多源于天然產(chǎn)物，其中又以植物來源為主。自然界中已開發(fā)用于治療疾病的植物數(shù)量僅僅只是龐大植物界的冰山一角，因此從藥用植物中尋找、發(fā)現(xiàn)新的降脂藥物的可能性非常大。

表2 18種豆科植物體外降脂活性篩選結(jié)果(±s,n=4)

表2 18種豆科植物體外降脂活性篩選結(jié)果(±s,n=4)

注：ND表示具有細(xì)胞毒性而無法測定。

?

文獻(xiàn)〔20-21〕報道從鞍葉羊蹄甲莖皮中分離得到了沒食子酸，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸具有良好的降脂活性。黃酮類化合物大都具有良好的降脂活性〔22〕。研究者〔23-24〕從云南甘草中分離得到了具有良好降脂活性的黃酮類化合物鷹嘴豆芽素A、芒柄花黃素、黃豆苷元等。張創(chuàng)峰〔25〕從截葉鐵掃帚中分離了21個黃酮類化合物，其中也包括具有良好降脂活性的黃酮類化合物異葒草素〔26〕。本研究篩選出鞍葉羊蹄甲、云南甘草、截葉鐵掃帚等植物具有良好的降脂活性，結(jié)合上述文獻(xiàn)報道，推測這些植物的降脂活性物質(zhì)基礎(chǔ)可能為黃酮類或其他酚類化合物，但仍需進一步深入研究驗證。另外，豆科植物普遍富含黃酮類化合物，這也可能是本研究大部分植物具有不同程度降脂活性的原因。同時，本研究結(jié)果也說明該體外降脂實驗方法可行，結(jié)果可靠。